异源四倍体鲫鲤的受精细胞学

异源四倍体鲫鲤的受精细胞学 () 动物学报 48 2:233,239 , 2002 A ct a Zoologica S i nica 3 异源四倍体鲫鲤的受精细胞学 33 筠李建中 张轩杰 刘少军 冯 浩 刘 ( )湖南师范大学生命科学学院 , 长沙 410081 摘 要 异源四倍体鲫鲤的成熟卵子处于第二次减数分裂中期 , 精子通过受精孔进入卵内 。精子入卵以后 , 受 精孔立即被受精塞堵住 。受精后 8 min , 受精卵出现明显的精子星光 , 同时进入第二次减数分裂后期 , 即将排出 第二极体 ; 13 min 时 , 精子头部开始膨胀 , 趋向核化 ; 18 min 时 , 雌雄原核均已形成 , 并向胚盘中央靠近 ; 23 min 时 , 雌 、雄原核开始接触 ; 33 min 时 , 雌 、雄原核完全融合成为一个合子核 ; 38 min 时 , 受精卵开始第一次卵裂 , 53 min 后分裂形成两个子核 。该研究证明异源四倍体鲫鲤和大多数二倍体鱼一样 , 具有正常的受精细胞 学程序 , 受精方式为单精受精 。 单精受精 关键词 异源四倍体鲫鲤 二倍体卵子 二倍体精子 人工诱导四倍体鱼的研究是鱼类育种领域中的 用 Smit h’s 液 固 定 受 精 卵 , 酒 精 脱 水 , 二 甲 苯 透 μ重大课题 。国内外学者采用物理或化学的方法 , 在 明 , 石蜡包埋 , 连续切片厚度为 6,8 m , 苏木精2 ( ) 虹鳟 Cho urro ut , 1982 ; Ref stie , 1981、罗 非 鱼 伊红染色 , 中性树胶封片 , Olymp us 显微镜观察并 ( ) ) ( Myers , 1986 、鳙 鱼 洪 云 汉 , 1990 、水 晶 彩 摄影 。 (( ) ( ) ) 鲫 桂建芳等 , 1991和白鲫 ?×红鲫 ?2 结 果 () 陈敏容等 , 1997等鱼类获得了同源四倍体或异 受精前源四倍体 , 但到目前为止 , 成功获得两性可育且能 211 成熟的异源四倍体鲫鲤的二倍体卵子和精子都自然繁殖的人工诱导四倍体鱼的研究甚是少见 。湖 比一般鲤鲫鱼产生的单倍体配子要大 。其中卵子直 南师范大学生命科学学院与湘阴县东湖渔场合作 , ( 利用 生 物 学 的 方 法 , 在 红 鲫 Ca rassi us a u rat usμ径约为 116,118 mm , 精子头部直径约为 214 m )) ? 与 湘 江 野 鲤 (red variet y , ( 。卵膜上的受精孔呈典型的漏 2001Liu et al . , Cy p ri n us ca r pio , )() 的杂交三代 ) ( 图版 ?: 1, 外部口径较大 , 直径约为 716 ( 斗状 ?中发现了异源四倍体鱼 刘 F3 ) μ1993, 该四倍体鱼雌雄可育并且能自然繁殖 , ,1513 m , 能同时容纳多个精子 ; 但精孔管道细 筠 , ( μ长而狭小 , 直径约为 310,315 m , 可以限制大量 已形成了一个新的稳定的四倍体鱼种群 刘少军 ) 等 , 1999 ; Liu et al . , 2001 ; 李 建 中 等 , 2001 。 精子涌入卵中 。即将受精的异源四倍体鲫鲤的卵子 为了进一步了解异源四倍体鲫鲤能自然繁殖的生物 处于第二次减数分裂中期 , 受精孔敞开 , 精孔细胞 学基础 , 我们对异源四倍体鲫鲤自交的受精细胞学 消失 。 进行了研究 。 212 精 子 入 卵 和 卵 激 动 反 应 ( 受 精 至 受 精 后 8 材料与方法 1 min) 1998 年 4 月在湘阴县东湖渔场进行异源四倍 异源四倍体鲫鲤的精子是通过受精孔进入卵内 的 。通常情况下 , 只有一个精子进入受精孔 。但在 体鲫鲤的人工繁殖时取得实验所用材料 。在 18 , 受精后 1 min 的受精卵切片上 , 作者也观察到( 有 4 ) 图版 ?: 1。 个精子依次进入受精孔管道的现象 21 ?的水温下 , 采用干法人工授精 。先取刚受精的 精子入卵以后 , 受精孔立即被一个像瓶塞一样的受 卵 , 然后在受精后 1 、2 、3 和 8 min , 到以后每隔 ( ) 精塞堵住 图版 ?: 2 , 3 。受 精 后 3 min , 受 精5 min 分别取材固定 , 直到受精后 68 min 结束 。采 2000210208 收稿 , 2001204228 修回 ( )3 国家 “863”计划项目 国科生字 1996182 33 通讯作者 E2mail : liuyun @hunnu. edu. cn 第一作者简介 李建中 , 男 , 32 岁 , 博士研究生 , 讲师 。研究方向 : 鱼类生殖生理 。 ( ) 卵仍处于第二次 减 数 分 裂 中 期 图 版 ?: 5 。此 3 讨 论 时 , 精子头部已离开受精孔 , 游过新月池 , 到达卵 ( () 质边缘 图版 ?: 4。精子入卵后 , 卵即被激动 。 受精孔是无顶体鱼类精子入卵的唯一通道 朱 ) 卵子激动的最初表现是卵体显著收缩 , 放射膜离开 洗等 , 1960 ; 宋慧春等 , 1999。一般认为 , 硬骨 (在受精膜 () 图版 ?: 5; 鱼类都是单精入卵 、单精受精 刘筠等 , 1981 ; 王 卵体向外隆起形成受精膜 () ) 与卵体之间出现围卵腔 图版 ?: 2, 皮质小泡破 瑞霞等 , 1982 ; 黄永松 , 1993 ; 尹洪滨等 , 2000; 形成胚 裂释放到围卵腔中 ; , 但也有人发现一些硬骨鱼类有多精入卵 、多精受精 细胞质向动物极流动 () 盘 。的现象 叶玉珍等 , 1994或多精入卵 、单精受精 ( ) 213 雌 、雄原核形成 ( 受精后 8,18 min) 的现象 许雁等 , 1990。我们的研究发现 , 异源 受精后 8 min , 精子深入卵质 , 在动物极卵质 四倍体鲫鲤只有一个精子由受精孔进入卵内形成雄 () 边缘形成精子星光 图版 ?: 8。同时 , 受精卵进 原核 , 并与雌原核结合 , 形成合子核 。这证明异源 () 入第二次减数分裂晚期 图版 ?: 6, 准备排出第四倍体鲫鲤和大多数二倍体鱼一样 , 具有正常的受 ( ) 二极体 图版 ?: 7 。受精后 13 min , 精子头部 精细胞学程序 , 受精方式为单精入卵 、单精受精 。 ( ) 开始 膨 胀 , 趋 向 核 化 图 版 ?: 1 ; 受 精 后 18 我们在观察中还发现 , 异源四倍体鲫鲤虽然有 多个 ( () min , 精 子 头 部 完 全 核 化 形 成 雄 原 核 图 版 ?: 精子进入受精孔管道的现象 图版 ?: 1, 但 ) 2, 此时已由一个星光发展为成对的子星光 , 或称 最终只有一个精子进入卵内 。这表明异源四倍体鲫 双星光 。精子星光的形成与发展以及精子头部的核 鲤有完善的阻止多精入卵的机制存在 。我们的研究 化 , 是异源四倍体鲫鲤正常受精的标志 。在雄原核 表明 , 达到生理成熟的异源四倍体鲫鲤 ?时相卵子 和双星光出现的同时 , 卵子已完成第二次减数分 的受精孔是畅通无阻的 , 而精子入卵以后 , 受精孔 裂 , 排出了第二极体 , 留在卵子里的那部分遗传物 立即被一个像瓶塞一样的受精塞堵住 。在受精后 1 () () 质形成雌原核 图版 ?: 3, 雌原核周围未见星光 min 的一个受精卵切片上 图版 ?: 2 , 3可以看 发出 。到 , 由于精孔管的内孔被封闭 , 受精孔的外口边缘 ( 受精后 18, 214 雌 、雄原核靠近 、接触及融合 和精孔管道完全被受精塞堵住 , 已到达受精孔管道 口准备入卵的两个精子因受到受精塞的阻止而不能 33 min) 受精后 18 min , 雌 、雄原核形成后均 向 胚 盘 继续入卵 , 另外还有几个精子被受精塞堵在受精孔 ( ) 中央靠近 图 版 ?: 4 ; 受 精 后 23 min , 雌 、雄 的外部 。所以我们认为 , 受精塞的形成是异源四倍 ( ) 原核开始接触 图版 ?: 5; 受精后 28 min , 雌 、 体鲫鲤也是大多数硬骨鱼类阻止多精受精的一种主 雄原核进一步融合 , 但两者的接合线还存在 ; 受精 要的机制 。形成受精塞的物质是从何而来 ? 又是如 后 33 min , 雌 、雄 原 核 完 全 融 合 , 来 自 父 母 双 方 () 何产生 ? 有学者 尹洪滨等 , 2000提出 , 受精塞 的二倍染色体组 , 融合成为一个具有四倍染色体组 () 的合子核 图版 ?: 6。此时核中染色体嗜碱性大 可能是精子入卵以后精孔细胞释放出来的一种物质 为增强 , 容易看到许多染成黑紫色的染色体 。 所形成的 , 而作者则认为受精塞的形成与精孔细胞 215 第一次卵裂 ( 受精后 33,53 min)无关 。我们的观察证实 , 成熟的异源四倍体鲫鲤卵 雌 、雄原核融合后经过短时间的准备 , 便开始 子的受精孔是敞开的 , 精孔细胞已经消失了 , 这同 第一次卵裂 。受精后 38 min , 合子核的核膜消失 , () 刘筠等 1981对青鲂杂交受精的光学显微镜观察 染色质凝聚形成染色体 ; 受精后 43 min , 受精卵 () 和王瑞霞等 1982对鲂鱼受精前后的扫描电镜观 进入第一次卵裂中期 , 染色体整齐地排列在纺锤体 ( 察结 果 是 一 致 的 。有 学 者 Brummet t et al . , ( ) 的赤道板上 图版 ?: 7 ; 受精后 48 min , 在纺 ) 1979认为 , 受精塞是精子入卵后皮质小泡破裂释 锤丝的牵引下 , 染色体分为两部分 , 各自移向纺锤 放的物质形成的 , 我们同意这种观点 , 但尚需进一 体的两极 , 最终染色体被拉至两端 , 形成两子核 。 步的研究证明 。当然 , 异源四倍体鲫鲤可能还有一 与此同时 , 在两子核之间的细胞质也分别向两端收 些其它阻止多精受精的机制 , 例如 , 成熟卵子的卵 ( ) 缩形成卵沟裂 图版 ?: 8 ; 受精后 53 min , 第 膜上可能含有精子的受体 , 当精子入卵后由于膜电 一次卵裂结束 。分裂形成的两子核并不停止活动 , 位的变化 , 使没有被精子附着的受体结构发生改 紧接着进行第二次卵裂 。 变 , 变为没有功能 , 从而迅速阻止第二个精子入卵 ( ) pel , 1978。另外 , 异源四倍体鲫鲤的成熟卵子E 2 期 李建中等 :异源四倍体鲫鲤的受精细胞学 235 的受精孔可能释放某些特殊的物质 , 能使精子入卵 ; 而异源四倍体鲫鲤具有 鲤能自然繁殖的前提条件 以后附着在卵子表面的精子凝集并融化而失去受精 正常的单精受精方式 , 则是异源四倍体鲫鲤能自然 ( ) 的功 能 Yanagimachi , 1957 , 从 而 阻 止 多 精 受 繁殖的重要保障 。正是因为异源四倍体鲫鲤的二倍 精 ; 还有 , 异源四倍体鲫鲤的精子入卵以后 , 放射 体精子与二倍体卵子正常受精形成了四倍体的合子 膜离开卵体向外隆起形成了受精膜 , 受精膜的形成 核 , 保证了异源四倍体鲫鲤染色体数目的恒定性 , 使异源四倍体鲫鲤能代代相传 , 已形成了一个染色 和举起等因素 , 对阻止多精受精也有重要的作用 () 吴长功等 , 2000。 异源四倍体 鲫 鲤 虽 然 含 有 四 体数目为 4 n = 200 的四倍体鱼新种群 。能自然繁殖 ( 套 染 色 体 4 n = 的异源四倍体鲫鲤的获得 , 不仅为探讨自然界鱼类 ) 200, 但是由于它们的染色体是整倍体的 , 所以异 多倍体的形成机制提供了重要的理论依据 , 而且在 源四倍体鲫鲤能进行正常的减数分裂 , 产生可育的 生产上有重要的应用价值 。 ( ) 二倍体配子 楼允东 , 1984, 这是异源四倍体鲫 参 考 文献 ( Ref erences) ( ) Brummet t , A. 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The t hickness of t he tissue sectio ns was f ro m 6 to 8 micro meters. Befo re t he sper m entering t he egg , t he mat ure eggs of t he allotet raploid fish remained at t he metap hase of t he seco ndary mat uratio n divisio n . At t his stage , a f unnel2like dep ressio n co uld be seen nearby t he animal pole o n t he cho rio n and at t he bot to m of t he dep ressio n was located t he microp ylar canal w here no microp ylar cell was o bserved. The diameter of t he o uter opening of t he microp ylar canal was always bigger t han t he inner o ne . The number of diploid sper m penet rating into t he egg was limited because of t he narrow microp ylar canal . In t he fertilized eggs , as many as fo ur sper ms entering t he microp yle were o bserved. The microp yle was blocked by t he fertilizatio n plug as soo n as t he sper m entered t he egg. When t he water temperat ure was bet ween 18 ? and 20 ?, t he sper master co uld be clearly seen and t he seco nd polar bo dy was ext ruded abo ut 8 minutes af ter inseminatio n w hich showed t hat t he egg was developing into t he anap hase of t he seco ndary mat uratio n divisio n . At 13 minutes af ter inseminatio n , t he sper m nucleus became vesicular nuclear . At 18 minutes af ter inseminatio n , t he male p ro nucleus was o bserved and t he female p ro nucleus was fo r med at t he same time . At 23 minutes af ter inseminatio n , t he male p ro nucleus and t he female p ro nucleus ( )3 The research was suppo rted by t he Chinese 863 High Tecnology Program No . 1996182 33 Co rrespo nding aut ho r E2mail : liuyun @hunnu. edu. cn 2 期 李建中等 :异源四倍体鲫鲤的受精细胞学 237 moved toward t he center of t he blasto disk , t hen f used wit h each ot her . At abo ut 33 minutes af ter inseminatio n , t he zygote nucleus was fo r med. At 38 minutes af ter inseminatio n , t he first cleavage was o bserved and t he first cleavage f urrow of t he blasto disk appeared at 53 minutes. Fro m all t he result s , we co ncluded t hat t he ( ) )( allotet raploid hybrids of red crucian carp ?×co mmo n carp ? underwent t he no r mal fertilizatio n p rocess and t he fertilizatio n t ype was mo no sper mism. ( ) ) ( Key words Allotet raploid hybrids of red crucian carp ?× co mmo n carp ?, Diploid oocyte , Diploid sper m , Mo no sper mism 李建中等 : 异源四倍体鲫鲤的受精细胞学 图版 ? ( )L I J ian2Zho ng et al . : Cytological st udy o n fertilizatio n of allotet raploid hybrids of red crucian carp ? ( ) ×co mmo n carp Plate ?? ( )× 1 000 11 受精后 1 min , 4 个精子进入受精孔 1 min af ter inseminatio n , fo ur sper ms entered t he microp yle ( 21 受精后 1 min , 受精孔被受精塞堵住 , 白箭头示受精塞 , 黑箭头示围卵腔 1 min af ter inseminatio n , t he micropyle was blocked by fertilizatio n ) plug , white arrow showing fertilizatio n plug , black arrow showing perivitelline space . ×400 ( ) 31 图 2 放大 magnificatio n of pict ure 2×1 000 ( 41 受精后 3 min , 到达卵质边缘的精子 , 白箭头示新月池 , 黑箭头示精子 3 min af ter inseminatio n , a sper m arrived at t he edge of ooplasm , ) white arrow showing crescentic area , black arrow showing a sper m×1 000 ( 51 受精后 3 min , 受精卵处于第二次成熟分裂中期 , 白箭头示受精膜 3 min af ter inseminatio n , t he fertilized egg remained at t he metap hase of ) seco ndary mat uratio n divisio n , white arrow showing fertilizatio n membrace×1 000 ( 61 受精后 8 min , 受精卵进入第二次成熟分裂后期 , 白箭头示留在卵内将来形成雌原核的遗传物质 8 min af ter inseminatio n , t he egg was ) developing into t he anap hase of seco ndary mat uratio n divisio n , white arrow showing t he genetic material which wo uld beco me female p ro nucleus× 1 000 ( ) 71 受精后 8 min , 受精卵即将排出第二极体 8 min af ter inseminatio n , t he seco nd polar bo dy was being ext ruded×1 000 ( ) 81 受精后 8 min , 精子星光形成 8 min af ter inseminatio n , t he sper master appeared×1 000 李建中等 : 异源四倍体鲫鲤的受精细胞学研究 图版 ? ( )L I J ian2Zho ng et al . : Cytological st udy o n fertilizatio n of allotet raploid hybrids of red crucian carp ? ( ) ×co mmo n carp Plate ?? ( )11 受精后 13 min , 精子头部开始核化 13 min af ter inseminatio n , t he sper m nucleus became vesicular nuclear ×1 000 ( ) 21 受精后 18 min , 雄原核形成 , 白箭头示雄原核 18 min af ter inseminatio n , male p ro nucleus fo r med , white arrow showing male p ro nucleus× 1 000 ( )31 受精后 18 min , 雌原核形成 , 白箭头示雌原核 18 min af ter inseminatio n , female p ro nucleus fo r med , white arrow showing female p ro nucleus ×1 000 ( ) 41 受精后 18 min , 雌 、雄原核彼此靠近 18 min af ter inseminatio n , female p ro nucleus and male p ro nucleus app roached each ot her× 1 000 ( ) 51 受精后 23 min , 雌 、雄原核开始接触 23 min af ter inseminatio n , female p ro nucleus and male p ro nucleus came into co ntact ×1 000 ( 61 受精后 33 min , 雌 、雄原核完全融合成为合子核 , 白箭头示合子核 33 min af ter inseminatio n , female p ro nucleus and male p ro nucleus f used ) into a zygotic nucleus , white arrow showing a zygotic nucleus×1 000 ( ) 71 受精后 43 min , 受精卵进入第一次卵裂中期 43 min af ter inseminatio n , t he first cleavage entered into metap hase×500 ( 81 受精后 53 min , 白箭头示两个子核 , 黑箭头示分裂沟 53 min af ter inseminatio n , white arrows showing t he daughter cell nucleus , black arrow ) showing t he cleavage f urrow×300