过氧亚硝酸根离子诱导DNA断裂机理的研究_cropped

过氧亚硝酸根离子诱导DNA断裂机理的研究_cropped 0&,1$+2 %&1 !无机化学学报第 期 ! _3/1 2!""’ 345%6 789%< 8= 5%8>%53 34?56@A ((:;:;(:年 月 !""’! 过氧亚硝酸根离子诱导 & $%断裂机理的研究 ! 胡燕黄开勋 !华中科技大学化学系"武汉 !"##$!# C在体内 AB 和超氧阴离子生成的过氧亚硝酸根离子&BABB*N:/G-d=4/949:$是一种强氧化性物质*它可以诱导 LAU 单链断 C裂使 发生损伤+ 为了探讨 断裂 的作用机理以质粒 为研究对象采用琼脂糖凝胶和硫代巴比妥 **LAU BABBLAU LAU NYZ$$ !CCC酸显色反应等方法对 与 的反应进行研究+ 结果 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明 能明显使 发生断裂*而且随着 浓度的 PVYUQBABBLAU BABBLAU BABBC增加断裂的程度增加在酸性和中性条件下 断裂 的能力明显高于碱性介质而 对该反应有显著的抑制 AU BABBLAU B*L**‘$ CR作用*显色反应进一步证实该反应为自由基机理*其机理为 与 形成 *然后裂解为二氧化氮自由基VYU BABBXBABBX&($ 和羟基自由基&($*继而对 造成损伤+ABBXLAU $ 关键词 硫代巴比妥酸自由基过氧亚硝酸根$%& !% ’ 分类号 !("(# (*"( !!!!’’’(!!"() ’C H 在体内 AB 和超氧阴离子&B$ 能够以接近被应% BABB 也可以与 LAU 反应使 LAU 链断裂对 ** ( E H&H& 动扩散的速度&D.&+F(2G5(8$ 极快地反应生成 %碱基进行化学修饰H一种新的氧化性和细胞毒性都要比其自身大得多的 有关 BABB与 LAU 反应的研究虽然已经有一 HI&J些报道*但其反应机理还不是十分清楚%本文通过在 离子过氧亚硝酸根离子&BABB$% 这个反应速 )) (H H 率常数是 KBL 酶催化 B分解反应的速率常数的体外对 BABB 与质粒 LAU NYZ 的反应能力反 !((- ( HH将近 6M 倍由此而知机体内的 BABB浓度是相当 影响因素的研究试图对 BABB与 LAU 反 !**应条件-*H应的机理作进一步的了解+ 高的+ BABB的 N!O)6’EP(M /Q*它在正常的生理条 3 件下可以稳定的存在*加上它的半衰期相对较长&约 实验部分 !C为 &6E 8$ 使得 BABB成为体内一种寿命相对较长 *C的强氧化性物质% 据报道*BABB主要与苯环类物质 !"! 主要试剂和仪器发生硝化反应 尤其容易与蛋白质的酪氨酸残基发 *主要试剂NYZ(( LAU 购自大连宝生物 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 !!C生硝化反应产生 #AB酪氨酸除此之外BABB可 !,*( 有限公司*琼脂糖购自西班牙 Y4G:89 公司*溴化乙 [IJ(引起脂质过氧化*在动脉粥样硬化中起重要作用, 锭&\Y$-二乙撑三胺五醋酸&LVWU$-溴酚蓝均购自 与巯基发生单电子或双电子的氧化反应 破坏体内 *8423二甲苯青 ^^ 购自 UZKB脱氧核糖核酸 ]*_\*‘正常的巯基水平%此外*它还可以在细胞水平上起作 购自上海长阳制药厂I!J* 硫代巴比妥酸&VYU$ 购自上 用它可以使甘油醛#三磷酸脱氢酶失活抑制细胞 **海生化试剂厂*其它均为国产分析纯试剂+ RRR膜上 A3STUVW 酶的活性* 使细胞膜上 A3通道失 活% H有研究表明 BABB与蛋白质的反应为自由基 北京六一厂的 Laa##Y 型稳压稳 !主要仪器!I’JH机理* 即 BABB与氢离子生成共轭酸 BABBX* 进 流定时电泳仪和 LaW#* 型电泳槽* 上海顾村电 ‘!‘一步分解为(AB和(BX*(AB与 蛋 白 质 上 的 酪 氨 ( ( 光 仪 器 厂 b^#E+ 型 暗 箱 式 紫 外 透 射 仪 W 公 司 *\酸残基发生硝化反应* 而BX 引起脂质过氧化反 (F32c3 Y4G#+ 型紫外#可见分光光度计+ ;’ "# 过氧亚硝酸根离子的制备 !IMJ采用淬灭流动反应方法合成*’ 时 +6D 2G5 /( 收稿日期###$% 收修改稿日期$#&&#& !!""!""!""!"’ 国家自然科学基金资助项目#%&’(%!)*+&#$% 通讯联系人 #*+,---./0123456789676<= "(),,:;! 第一作者胡 燕>女> 岁>硕士研究生?研究方向@生物无机化学 !(’" $%$%$%$% $% $% " !,-(!#&T"" !,-(!#&%*/,,-(!#& 浓度分别为 #&’( ) "*+ ,-(!#&.与 "*/ ,-(!#010.溶 !! ! $%液 各 %" # 经 2 型 玻 璃 管 上 口 流 入 "" 的 %*3 9*! -(# " 总 体 积 为 %" !#";& 分 别 为 T*" 和 ,!,,!$% T*T# 其余同 %*M$%%# -(#01.& !" # 由底部流入" 以淬灭前两种溶 ,!,&/41液的反应保持三者流量与流速的一致#反应完毕迅 "!"2 $%$$与脱氧核糖核酸的 3,( 显色反应 速在反应液中加入少量的 5振荡 % 65 以 清 4.",在 含 有 %"*/3 ,I 脱 氧 核 糖 核 酸 的 %"" ,,-(! !$% 除 残 存 的 微 量 & 真 空 抽 滤 黄 色 液 体 即 是 ."" #的磷酸盐缓冲液中分别振荡加入 " !#&!""!#& !!$$$9 #&M #&3 # 的 0溶液 使 0 ""!""!""!..."... 0置于$ 过夜并保存# 其浓度的测定采用..."!"!$%$%$% 的 浓 度 分 别 达 到 "*3 ,,-(!# &"*T ,,-(!# &%*% 78 分光光度计 以 % (#01& 为参比 "-."!",!9"!$%$%$%$%它们的总体积均为 (#&%*M (# 3 # --"",,,,,!!%+" #-(:# /,,!!&;& 分别为 +*M和 3*T" 在 9+ 下反应 !" 65 后"每 !,"# %引起的 % 链的断裂 !$$$(’ 份样品均加入 % # "*/ N的硫代巴比妥酸和 % # ,,实验 <=9 由紧密闭环螺旋态$:(->? :6@:A(1@ ;!!的冰醋酸" 再在沸水浴中加热 9" 65" 样品冷却后 ,B-@"% 转 变 成 开 环 螺 旋 态 C-?5 :6@:A(1@ B-@" ,’’;,"$G/+H测其在 39! 5 处的吸收# ,D的多少来检测 0断裂 E0F 的能力# 室温 ....’&$ "5 6$对 $%$$诱导 *# 单链断裂的 !,-... 下 0加入到含有 3 5 E0F 以及 *% ( ...!"I"-,,!/01 影响$% $% #EJKF 的 &L+*M 的 %"" -(#的磷酸盐缓冲 ;,,!$%$%$%室 温 下 " 在 含 有 !3" 5I E0F&"*% ,,-(!# 液中" 使其终浓度分别为 " !-(#&%" !-(#& ,!,!$% $EJKF 和 "*3 ,,-(!#.0..的磷酸盐 $%"" ,,-(! $%$%$%3" !,-(!# &"*!3 ,,-(!# &"*+3 ,,-(!# &9*+3 $%(# 总体积为 % ## 反应液在 9+ 下反应 -""!,,!! 每份反应液中加入 电泳上样缓 随后% 65# # ""! !, 冲液 $"*!3 N溴酚蓝""*!3 N二甲苯青 OO"M" NC!P $% # % $;& L3*T%" 缓 冲 液 中分 别 加 入 不 同 浓 度 的"Q蔗糖水溶液%#反应液和上样缓冲液共 %! !# 点入 $% 01&’." 使 其 在 溶 液 中 的 终 浓 度 分 别 为 "&3" 制备好的 %N的琼脂糖凝胶中$含 "*3 !I!!#R<%" 9$%$%$%$%-(#&"*3 -(#&3 -(#&3" -(#" 总 !,,,,,,,!!!!在 "*3#J$硼酸$REJF%的缓冲液中以 S" 8 电 体积为 %" !#"反应液在 9+ !下反应 %" ,65 后"每 压电泳 电泳完毕把胶置于紫外透射仪上 3" 65" " , 份样品加入 ! !# 上样缓冲液"点入制备好的 % N 的 观察并照相# $% &琼脂糖凝胶中$ 含 "*3 !I!!#R<%" 在 "*3#J 缓冲体系% !$室温下 0振荡加入到含有 3" 5 E0F 以 ...!I $% 及 "*% ,,-(#EJKF 的 J@6> 盐缓冲液中" 使其终 ! 胡 燕等过氧亚硝酸根离子诱导 断裂机理的研究 !"#$第 ! 期 %09 ’ ’ 8A’&&&的反应浓度分别为 7<< ?@$A62 ?@ #>(>>!’’8A8A($96% >>?@’(" 比在中性和酸性条件下的相应的 反 应 浓 度 要 大 # 但 是 可 以 看 出 ! 在 碱 性 条 件 下 8 &#&& 对 9%% 的 损 伤 能 力 较 之 于 酸 性 和 中 性 ,-.8条件下明显减弱# 当 &#&&浓度为 8A8A8A 7<< !>?@($ A62 >>?@($96% >>?@(时"可以分’’’ 别观察到 ,4= 8图 A &#&&的浓度对其诱导的 ,-.9%% 损伤的影响 767 时的 &/ 带窄于 ,4=76< 时的 &/ 带" 即在 ,4= DEF5A #EGHE*F ?I 9%% JK +L?MK*ELNE+N E* NO+ E*GPJN?E* ,-.,)88 767 时 &#&&对 的损伤比在 =76< 时 &&&"#,4#:EMNPL+ >对 的损伤要小# 比较图 %和 图 9可以清楚地 "#":()*+ A QO?RQ ,-.9%% E* ,O?Q,O)N+ JPII+L )@?*+6 8观察到 在碱性条件下同样浓度的 &#&&产生的 "" *+ % N? *+ 2 QO?R 9%% E*GPJN+S REON NO+ ()(),-.)损伤要比在中性和酸性条件下小得多# 因此我们可 A’8’I?@?R@E*F ,+L?MK*ELNE+N G?*G+*NL)N?E*T A< !>?@(U 以得出 &#&&在酸性条件下的对 "#: 的损伤能力 8A8A8A’’’1< !>?@(U <5%1 >>?@(U <531 >>?@(U 大 于 在 中 性 和 碱 性 条 件 下 的 " 而 在 碱 性 条 件 下 8A8’!531 >>?@(5 &#&&损伤 # 的能力尤其弱# ": ’由以上的这些实验结果"我们可以初步地认为" " #$ 值对 %&%%诱导 # 链断裂的影响 !!()*!!8’&#&&在反应过程中很可能是以其共轭酸的形式参 从图 %中可以看 出!同样浓度的 &#&&的条件 与反应的" 因此它的反应能力与 ,4 值有如此密切 下"()*+ %中 ,-.!%% &/ 态的量少于 ()*+ ! 中 &/ 的相关性# 态的量"()*+ 0 中 &/ 态的量少于 ()*+ 1 中 &/ 态 的量"()*+ 2 中 &/ 态的量少于 ()*+ 3 中 &/ 态的 量 # 而 ()*+ %$()*+ 0$()*+ 2 均 为 在 中 性 条 件 下 ’ %,4 350&&#&& 与 ,-.!%% 反 应 的 结 果 "()*+ !$ ()*+ 1$()*+ 3 均为在酸性条件下%,4 8 167& &#&&与 ,-.9%% 反应的结果# 由此我们可以’得出在酸性 条件下 &#&&断裂 "#: 的能力远大于 其在中性条 件下的能力# 8 在碱性和中性条件下 &#&&诱导 ,-.9%% 损伤的 图 9 图 9 显 示 的 是 在 76< 和 =767 条 件 下 ,4;,4比较 ’ &#&& 与 9%% 反 应 的 情 况 # 在 这 个 实 验 中 ,-.".P,NPL+ ?I ,-.9%% JK ,+L?MK*ELNE+N E* )@H)@E*+ JPII+L DEF59 ()*+ A )*S @)*+ 7 QO?R ,-.9%% E* ,4=75< )*S ,4= 757 BLEQ JPII+L )@?*+ L+Q+GNVE+@K5 ()*+ % ) *S ()*+ 9 , 8A ’QO?R 9%% EGPJN+S REON 7<< ?@+L?M,-*)>(,! .! K*ELNE+N E* ,4=75< )*S ,4=757 JPII+L L+Q,+GNVE+@K5 ()*+ 0 )*S ()*+ 1 QO?R ,-.9%% E*GPJ)N+S REON A52 8A ’>>?@(,+L?MK*ELNE+N E* ,4=757 )*S ,4=75< JPII+L L+Q,+GNVE+@K5 ()*+ 2 )*S ()*+ 3 QO?R ,-.9%% E*GP! 8图 % 在酸性和中性条件 下 &#&&诱导 %% 损伤的 ,-.!8A ’J)N+S REON 95% >>?@(,+L?MK*ELNE+N E* ,4=757 )*S 比较 =75< JPII+L L+Q+GNVE+@K5 ,4,DEF5% #EGHE*F ?I ,-.!%% JK ,+L?MK*ELNE+N E* )GES )*S *+PNL)@ JPII+L ’" %&%%与脱氧核糖核酸的 + 显色反应 !*(,()*+ A )*S @)*+ 7 QO?R ,-.!%% E* ,4=350 )*S 8为了探讨 &#&&与 "#: 反应的机理" 我们进 8,4=157 ,O?Q,O)N+ JPII+L )@?*+ L+Q,+GNVE+@K5 行了 &#&&与脱氧核糖核酸作用的 B-: 显色反应# 8)*+ % ) *S )*+ 9 QO?R 9%% E*GPJ)N+S REON ((,-.这个反应的原理是!在 &#&&与脱氧核糖核酸反应 8A ’%<< >?@+L?MK*ELNE+N E* 4=350 )*S 4=157 !(,,,的过程中如果有羟自由基%’&4&生成"则’&4 会进 攻糖环而产生丙二醛 丙二醛可与硫代巴比妥酸生 "JPII+L L+Q,+GNVE+@K5 ()*+ 0 )*S ()*+ 1 QO?RQ ,-.9%% 8A 成复合物"此物质在 C9% *> 下有明显的光吸收# 因 E*GPJ)N+S REON 7<< >?@(,+L?MK*ELNE+N E* ,4=350 !’8此"我们检测 &#&&与脱氧核糖核酸的反应产物与 S =157 JPII+L L+Q+GNVE+@K5 + 2 S + 3 )*,4,()*)*()* 8A B- 在 C9% *> 是否有明显的光吸收值" 就可看出 :’QO?R 9%% EGPJN+S REON 95% ?@+L?MKE ,-*)>>(,*!. NLE+N E* 4=350 )*S 4=157 JPII+L L+Q+GNVE+@K5 ,,, %在 #$##发生作用的过程中是否有!#& 产生"从而 "而导致 3$* 链的断裂# 脱落而产生各种坏死位点%’可以推测 #$##是否在体内以自由基机理发生作 !"# $%对 %&%%诱导 ()*+!! 单链断裂的 ! 影响 用# 实验结果见图 # ’ %5#对 #$##诱导 6)7,!! 单链断裂影响的实 ! 验结果如图 + 所示# 从图 + 可以看出" 在没有 5#! %1 %存在下8+ 9:的 #$##对 67 产生单链 "";),!!..! 断裂而使 67 55 组分的减少和 #5 组分的增 ),!! 加是明显的" 在加入了不同浓度的 $<&5#后"#5 , 组 分 明 显 减 少 "55 组 分 明 显 增 加 67 被 "),!!%#$##损伤的程度明显被抑制# 当 $<&5#的浓度 , %1%为 + 9:对 6 的损伤几乎被完 ";"#$##)7,!!..!%全抑制# 因此"可以得出 5#对 #$##诱导 3$* 的 ! 单链损伤有抑制作用# %图 #$##和 3$ 的反应物与 形成复合物后在 ’ *()* %的光吸收随 浓度和不同 下变 +,! -. #$##6& 化的比较 ?@A8 BCDCEFG 9C 6& " 9: $<&5#@- 6&Q+84;!.; 在酸性条件下所产生的!#& 的量大于中性条件下 , LMCDCI8 ;<-D , GO9PG 6)7,!! @-EML + " !.9:;$<&5#@- , % 产 生 的#& 量 #可 见 "#$## 是 以 其 共 轭 酸 !6&Q+84 LMCDCI8 " 8+ ..9:; 的机理进行的" 而#& 产生的机理可以用下式表 !$<&5#@- 6&Q+84 LMCDCI8 ;<-D + GO9PG 6)7,!! , 示& %1 @-EML + ..9:! % /#$##&#$##& $# #& %1 / /! !!! !; $<&5#@- 6&Q+84 LMCCDI8 ;<-D = GO9PG ,% 这个实验进一步证实了前人所提出的 #$##%1 !6)7,!! @-EML "01!1,2%反应的自由基机理# 由于 #$##在发挥作用的 %1 !+" 9:;$<&5#@- 6&Q+84 LMCCDI8 .., 过程中产生了!#& 和!$#"所以它还可以修饰 3$* !%对于 5#抑制 #$##损伤 3$ 的机理可能也 * !的碱基" 生成以 4!$#鸟嘌呤和 4!#& 鸟嘌呤为主 ! % %与 我 们 在 前 面 提 到 的 #$##的 自 由 基 机 理 有 关 # 的各种碱基修饰物# 因而"#$##与 3$* 反应导致 %01+201’2#$##与 5#发生作用的机理如下式& ! 3$ 链断裂的原因可以从以下两个方面来解释& *% 一 方 面 "#$## 与 3$ 反 应 的 过 程 中 产 生 的#& *!% % % !#$##5##$##5# $#5#/ / ! !! ! ! ! ,可能进攻 3$ 链中的脱氧戊糖" 与脱氧核苷反应" *即 在 5#存 在 下 " 它 可 以 与 5#生 成 复 合 物 ! ! 在这个反应过程中"在核糖的 5" 发生了抽氢反应" ’% #$##5#"此物质的最大吸光度值在 =+" -.# 此复 继 而 发 生 5",!5"’ 及 5"1!环 氧 键 的 裂 解 而 产 生 碱 ! !% 基!丙烯醛类物质" 使 3$* 发生断裂 另一方面" ’合物可以均裂为和 5# 据文献报道 大约$##"! ! , %#$##可以与 3$ 中的碱基发生氧化和硝化反应 % 01=2 *"1>, 的 #$##5#可以产生自由基# ! 对碱基产生各种修饰作用"从而使得碱基突变"易于 %/比较 #$##分别与 &和 5#的相互作用"我们 ! %可以看出 在 5的存在下 原本在 的作用 "#"#$## ! 途 径 中 产 生 的!$#和!#& 转 变 成 为 了!$#和 !! 胡 燕等&过氧亚硝酸根离子诱导 & 断裂机理的研究 (’第 ! 期 %H ,! ! $ $ !! #即羟自由基消失了 取而代之的是 #因情况下导致细胞新陈代谢紊乱免疫损伤和器官受"" """"’ ! ! $$此" 可以认为 "#可以抑制 #&##诱导 ’&( 单链 损的一个重要因素# #&##能够导致 ’&( 单链断 % 断裂的原因就在于它的存在抑制了# 的产生"而 )!裂"因此一旦过氧亚硝酸根离子在体内生成"它可以 穿过细胞膜"引起细胞核内的 ’&( 单链断裂从而激 !$ "#不能够对 &( 产生损伤#新产生的 ’ 72=8!活 456造成细胞急性损伤和死亡# ("$在上面我们已提出 #&##诱导 & 发生单链 ’( 断裂可能的原因有两个" 一个是!#) 进攻 ’&( 的 另一个原因是 和&修饰 & 的参 考 文 献##()’!!脱氧戊糖" % $碱基# 由于"#抑制 #&##诱导 & 单链断裂中""’( % $ !728 >?@ 5A BAC 4DEDFD 6A "#$% &()*% &$+% -0%C ""#C ).!’,../!# 减少的量和 #增加的量是同等的" 而&#)"!! ! % !$C2GHA 的量不变" 因而可以认为!#) 在使 ’&( 发生单链 $7%58 D E? 5AC @JKDL MA 6AC >3N OA PAC QR@@DL A A 1"23% I.I.I(损伤的过程中作用大于&## #&##和 "#反应的 !%% , 12124)23$% 4)536+7C %C&$$CS2A --""!,.速度极快" 速率常数为 !!*+-/03"而且在体 !.!12内 "#浓度相当高$约为 2 /0-%"因此"在体内 ..!78 3DTD 6A 89):% $3 MA 6AC Q ?J? WA MAC 40D?3V@ E 6A PA =)*"-*3$.)*’: 1 "#对 #&##的反应能力有非常重要的影响#有报 % >-/"0’:C %""’C():%;C2HHA 道 当碳酸氢盐的浓度较高时 细菌和寄生虫受"" 7H8 PD 3>./V/ )AC 6?@3 )A ,3$.7 &$+7 ?-9)*’:C %"")C"C%X%A 1#&##的细胞损伤有明显地减少# 7X8 PDR?D WAC O/L? 6AC W?>3@YY@ -AC Z?0D0? (A 4A 4)-*3$7 ..1在体内"#&##诱导 ’&( 单链断裂具有重要的 4)-536+7 &$+7 -07C %""(C*+:;C2 +%HA ,../,!生理意义# 例如&467聚$腺苷二磷酸"核糖%聚合 (57=8 #N3N?D AC W?0T?@V R [A @"$$7 A)*7 4)7 $7C +C&C )’(-=(""").酶8 是大量存在于细胞核内的一种导致蛋白质修饰 2 !+HA 和核苷酸聚合的酶"而 ’&( 单链断裂是激活 4(56 7S8 @R?/0] ^AC /3N?@ AC 5>T?/ MAC #N3 N?D A @B4C7 $</:;C -_# W>DL‘")>D:; C3$0DE/ 酶; 分解为 4"核糖$ 腺苷二磷酸"核糖% 和烟酰 (!’F/’9/$ G/ C3$0DE/ H/:) >)0I3’0 :J"-D"$++7 4)-*3$.7 胺# 接下来46 又把分解产生的 4"核糖连接 "(5(’4)-536+7;C +""-C&,:%;C*H+A 到各种类型的蛋白质上包括细胞核内的各种蛋白 "’7*+86>?K [AC 6N3>K@ OA @B4C7 $<33aL [AC 6?@3 )A K/*:$)*7 1*)(+7 组蛋白以及 4(56 自身的自动修饰区域# 通过这种 A$+7C +"")C&.:%*;C, *+HA 方式456 就把 4"核糖扩展为类似于核酸聚合 "((’ 7*%85?JN@3/L "A BAC P>0E@ R4AC /bRa ^A ZAC [L/0E OA _A >7 I‘物的物质(聚 (’4 核糖# 4(56 的显著激活能迅 (9917 3$7 C-*7C %""$C%%C=*%A .,.速地消耗储存于细胞间的底物 &使 &浓度 ("(’’ 减小)减慢糖酵解的速度"并减慢线粒体电子转移的 7*!8W/0E3V@?L 6AC "cDY3K? WAC -?LE MAC P@ RLa@? WA ,3$7 A$+7 .速度和 <4 生成的速度# 这个过程可以引发细胞内 (?-9)*-:7C %"""C%&C*%A ! 的严重的能量危机" 导致急性细胞功能失调和细胞 7*8>RL@a 6AC D>0d?@0E MA A <<)07 A$+7C %C&C=A ,I"-=/’-"""..! 7*H8Z?0D0.? (A 4AC 5D/ PA _A @"$$7 A’()*7 4)-7 =$(7C %""’C&- 坏死#同时 456 通过伴随着各种转录因子和转 (:%;C!!*A 录辅助激活因子的作用" 也在一系列的免疫调节中7*X8I/L?L? BA ^AC )>R3V MA OA L0-"D ,3$7C %""$C-’C%G,A .起着重要作用#最近证实此酶是在过度的氧化应激 "7*=8"3DTD 6A @"$$7 A()*7 4)-7 =$(7C %"")C&%:X;CSHHA ’ "#$%& "& &% 3"45 64&78& 95#&5 <&4=%"4%"& !’() *+,*-)’(/ 012 -)--’),:; (;). !#$ %& #$ +&,! ’()*-.’ !""#$%&"& * +"-&%0 12345 6-7"%-& * 89-"9" 3 "9<50 23 01 !(),./,)((./)((:;,())/=,(/""/’’ #: : )2 34&567 8,69 26; <,4=> ?43;@<’,63,64 A2)22 BC & ? ;843D.= ;@,>&’6 ,’ E,E;F G43;@<’,63,64 5&’ ,’>.54 H)( ! 7,’I=4!763&’>4> J34&K&I47F G=&7L,> ?MN0!! ,7 .74> 6; 76.>< 694 L459&’,7L ;D H)( 763&’> J34&K&I47 ,’>.54> J< :?43@<,63,64F &374 4= &> OM 34E4&=, 5=3 34&56, ,7 &=7 >4E4=?4>F O945 5=7, 797 69&6 ;(I;I(I;;.;;;;.;;82)22’’’’’’5&’ J34&K H)( 763&’>7 ;JE,;.7= 4I344 ;D H)( 763&’> J34&K&I47 ,7 &.IL4’6,’I 8,69 694 5;’54’63&6,;’ ;D ?43;@<’,63,64 ,’534&7,’IF O94& J,=,6< ;D ?43;@<’,63,64 J34&K,’I H)( 763&’>7 ,’ &5,> &’> ’4.63&= 7;=.6,;’ ,7 9,I943 69&’ ,’ &=K&=,’4 7;=.6,;’F P25&’ ,’9,J,6 694 34&56,;’F OM( 34&56,;’ >4L;’763&647 694 34&56,;’ ,7 D344 3&>,5&= ! : R L459&’,7LQ 2)22# ,7 D;3L4> 894’ 2)22 34&567 8,69 # &’> 694’ 5=4&E47 ,’6; #)2&’> #2# 6; >&L&I4 ! H)(F >&;?(45’@ A&4(=;)%"4%"& 01B CD2 1E /4&& 4F5%,FG #$%&%*$+#$*+$#%#&0*1!"’(),(- (.!!"/ 234567 358 95 <<= $:;/ %& $0$0!( +:>?@4AB @54#8 )3 5"# A(6"%348& )* + :;,-!"# $%&%’( )* +,- ./ 0(1)2/34154(5 %3$ 5 *1 1%$46% 71%6543 6%348 * "(((()&("&)@15%3 =1%B%#8 C36 D12! ;(’;:(;./ () 012341545 45 1 1875# ()/(9"+-9(((:;,/345145( *1)& %’%1)8( ’(7 %3; <=- 1(>(%743’ 6)7! )1 1(%65)43? EF G%3H EF-,I JK4!L:3 !"#$% &% ’$()*% !"+,% ;<<=H;54(7/H 9"4(7 5"( 435(3! ’ UV84/5 )* 5"( -!.(&4884)3 48 43 61(%843’ N& GC @"):![:3H YCF G43’!Y4%3’H ST 1(7%>5(47/? <"( 6)7)1 )* W$I(X"<.48 MVOQE 43!4K3H GF +43!@3H \-,I[’]-,’"(’ (6)&43 1((3 4361(%8(7/? .’’^X,I [4K3!E:KH EF-,I YK3’!E:K3 !"#$% &% ’$()*% !"+% ;<<=H;$? <48 &K! )-‘)(("be3’748"i 5(14K7 (2"4Z458 5"( 01(*(1(354K7 435(1‘K7K! 54>45 *)1 OHN!Z(3d(3($4K1Z)27K5( *1)& /‘/YC Y(4H AX +K3H YFX f43’!@)3’ &42$ 0K418 * 1K34 K4$8? ())’‘‘ "#$% &% $()*% "+% <<=H