【精品文档】血小板衍生微粒对脐血粒巨噬祖细胞的促增殖作用医学论文_医药学论文_39309

【精品文档】血小板衍生微粒对脐血粒巨噬祖细胞的促增殖作用医学论文_医药学论文_39309 论文范文 题目:血小板衍生微粒对脐血粒巨噬祖细 胞的促增殖作用医学论文_医药学论文 编辑:小小 作者:费菲～陈宝安～黄成垠～李翠萍～裴孝平～仲悦娇～高峰～高冲 【摘要】 本研究探讨血小板衍生微粒(PMP)对脐血粒巨噬祖细胞集落形成单位,CFU-GM,的促增殖作用。采用不同浓度的凝血酶激活血小板释放出PMP～采用流式细胞术检测PMP的释放量～确定凝血酶的最佳实验浓度。应用Ficoll分离脐血单个核细胞,MNC,～在含有不同浓度PMP的甲基纤微素半固体培养基中培养7天～观察CFU-GM集落形成情况。结果 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明: 2.0、1.5、1.0 和0.5 U/ml凝血酶激活血小板后的PMP释放率分别为: 28.7%、47.7%、50.1%和43.9%,CFU-GM集落产率与PMP呈剂量依赖关系～PMP为10、50、100 μg/ml时的CFU-GM集落产率,个/2×105 MNC,分别为:119.8?32.2、142.8?45.2、180.8?85.1。50、100 μg/ml PMP组的集落产率与空白对照组,103.0?24.8,相比～P值均<0.05,而10 μg/ml PMP组的集落产率略高于空白对照组～但P值>0.05。结论: 用1.0 U/ml的凝血酶激活血小板释放的PMP较为均一～而且释放量最大。PMP可促进人脐血粒巨噬祖细胞的增殖。 【关键词】 血小板衍生微粒 Abstract This study was aimed to investigate the effect of platelet-derived microparticles (PMP) on stimulating the proliferation of granulocyte-macrophage progenitors (CFU-GM) from umbilical cord blood. Different concentrations of thrombin were adopted to activate the platelets for releasing PMP. Flow cytometry was adopted to evaluate the efficiencies of different concentrations of thrombin to produce PMP. Umbilical cord blood mononuclear cells (MNC) were obtained from healthy donors and the MNC were isolated by Ficoll density gradient centrifugation. MNC were cultured in 2.7% methylcellulose containing different concentration of PMP and colonies were counted under an inverted microscope after 7 days. The result showed that the release rate of PMP activated by 2.0～1.5～1.0 and 0.5 U/ml thrombin were 28.7%～47.7%～50.1% and 43.9% respectively. The PMP enhanced colony formation in dose-dependent manner. The number of colonies per 2×105 MNCs in groups of PMP at different concentrations (10～50 and 100μg/ml) were 119.8?32.2～142.8?45.2 and 180.8?85.1 respectively. The number of colonies in the groups of PMP at 100 μg/ml and 50 μg/ml were statistically significant when compared with control group (103.0?24.8) (P<0.05). The number of colonies per 2×105 MNC in the group of PMP (10 μg/ml) was 119.8?32.2 which was higher than that in control group～but there was no statistical significance between two groups. It is concluded that platelet activated with 1.0 U/ml thrombin can get the best release efficiency of PMP and PMP can enhance the proliferation of granulocyte-macrophage progenitor cells of umbilical cord blood Key words platelet-derived microparticles; cord blood; granulocyte-macrophage progenitor cell 血小板衍生微粒,platelet-derived microparticles～PMP, 是血小板激活后产生的直径为0.1-1.0 μm的小囊泡颗粒～含有多 种特异性膜糖蛋白和生物学活性的受体～可通过与靶细胞的相互作 用启动靶细胞的生物学效应。研究表明～PMP可影响人类造血干细 胞的多种功能:PMP可通过转移CD41抗原增强骨髓来源的造血干细 胞对胶原蛋白的黏附能力,通过其表面CD40配体来增强骨髓来源的 造血干细胞的生存能力,促进骨髓移植后免疫系统和造血功能的恢 复等,1,。本实验将PMP与人脐血造血干细胞共同孵育～以观察PMP对脐血粒巨噬祖细胞集落生长的影响。 材料和 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 样品来源 10份脐血样品由南京大学医学院附属鼓楼医院产科提供。选择健康足月妊娠的产妇～胎儿娩出后立即结扎脐带～消毒后穿刺脐静脉～通过重力作用将脐血收集于200 ml抗凝的采血袋中,采血量为80-100 ml～4?保存～8小时内分离单个核细胞,mononuclear cells～MNC,,血小板悬液由江苏省血液中心成份科提供～均为血细胞分离机采集的健康供血者的血小板。 试剂与仪器 重组人粒巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)购自厦门特保生物工程股份有限公司,白介素,3(IL-3)购自晶美公司,甲基纤维素为Sigma公司产品,IMDM为Gibco公司产品,淋巴细胞分离液,Ficoll～1.077,购自上海恒信公司,流式细胞仪为Becton Dickinson公司产品,标记抗体CD61-FITC为Immunotech公司产品,BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物技术有限公司。 脐血单个核细胞的分离 留取的脐血样品经1 100×g离心10分钟～去除部分红细胞,混悬后～缓慢加入到含5 ml淋巴细胞分离液的15 ml离心管中(Ficoll液?脐血,1?2)～常温条件下～1 100×g离心20分钟。然后用吸管吸取中间白膜层的MNC至另1无菌试管内～用生理盐水洗涤2次后～再加入IMDM溶液洗涤1次,均400×g离心～8分钟,～调整细胞浓度为8×106/ml备用。 血小板衍生微粒的制备 将血小板悬液经1 100×g离心10分钟,22?2?,～沉淀悬浮于缓冲液中(9 mmol/L Na2EDTA、26.4 mmol/L Na2HPO4、 140 mmol/L NaCl)～并用缓冲液洗涤2次。最后将洗涤的血小板悬浮于Tyrode缓冲液中(137 mmol/L～NaCl、12 mmol/L NaCHO3、 5.5 mmol/L 葡萄糖、 2 mmol/L KCl 、1 mmol/L MgCl、0.3 mmol/L NaHPO4)。调整血小板浓度为8×108/ml。分别采用2、1.5、1.0和 0.5 U/ml的凝血酶激活血小板,放37?恒温摇床上振荡30分钟,。激活后的血小板离心,4?～2 800×g离心20分钟,～分离上清于另1试管中～于4?～28 000×g离心1小时～并洗涤1次～然后沉淀悬浮于Tyrode缓冲液中,5～7,。 PMP的鉴定及定量 用等量1,多聚甲醛固定PMP后采用CD61标记PMP～选择直径1 μm的微粒以确定PMP直径阈值～并设定同型对照～用流式细胞仪 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 不同浓度凝血酶作用后PMP释放的情况及PMP制备的纯度。采用BCA蛋白定量试剂盒检测PMP的浓度～按试剂盒说明书操作。凝血酶激活的血小板用2,戊二醛固定～取1滴血小板悬液置于多聚-L-赖氨酸包被的玻片上～1,四氧化锇后固定～经乙醇逐级脱水、烘干、包埋、真空干燥、喷金后于扫描电镜下观察。 粒巨噬祖细胞集落(CFU-GM)培养 106/ml)0.1 培养体系含脐血血清0.6 ml～MNC(细胞浓度为8×ml～甲基纤维素,浓度为27 g/L,1.0 ml～IL-3和GM-CSF各0.1 ml(浓度为400 ng/ml)～PMP 0.1 ml～加IMDM培养液至总体积2 ml～混匀后置24孔培养板中～每孔加0.5 ml～设3个平行孔～于37?、5, CO2饱和湿度的培养箱中培养7天～倒置显微镜下观察计数CFU-GM集落数,细胞数?40为1个集落,～结果取3个孔的平均值。 PMP对脐血CFU-GM的促增殖作用 实验分4组。?空白对照组:MNC常规CFU-GM培养,?10 μg/ml PMP组:MNC在含10 μg/ml PMP的CFU-GM培养体系中培养,?50 μg/ml PMP组:MNC在含50 μg/ml PMP的CFU-GM培养体系中培养,?100μg/ml PMP组:MNC在含100 μg/ml PMP的CFU-GM培养体系中培养。 统计学处理 采用SPSS统计软件进行结果统计分析～实验数据用均数?标准差,X?D,表示～统计方法采用方差分析～组间比较采用q检验。 结果 凝血酶浓度的选择及PMP纯度的鉴定 流式细胞仪检测结果表明: 2.0、1.5、1.0和0.5 U/ml凝血酶作用后的PMP释放率分别为:28.7%、47.7%、50.1%和43.9%。以1.0 U/ml浓度凝血酶激活血小板释放PMP的产率最大, 28 000×g离心1小时后PMP的纯度>98,。扫描电镜观察:凝血酶激活血小板后～血小板以出芽方式形成囊泡或伪足断裂而形成直径<1.0 μm 1,～在血小板周边形成许多伪足～并环绕大量直径在PMP ,图 0.1-1.0 μm PMP～微粒主要位于伪足或囊泡的末端～而血小板本身因大量PMP的形成而破损。 PMP促进脐血粒巨噬祖细胞的增殖 10份脐血样品CFU-GM培养结果见图2。100 μg/ml和50 μg/ml PMP 组的CFU-GM集落产率,个/2×105 MNCs,分别为:180.8?85.1和142.8?45.2～与空白对照组,103.0?24.8,相比有明显的差异,P<0.05,,10 μg/ml PMP组CFU-GM集落产率为119.8?32.2～虽大于空白对照组～但二者间无统计学意义,P>0.05,。100 μg/ml PMP 组与10 μg/ml PMP组比较亦有明显的差异,P<0.05,。从形态学上比较～100 μg/ml及50 μg/ml PMP组形成的CFU-GM集落亦大于对照组和10 μg/ml PMP组。 讨论 血小板受强诱导剂作用可通过向细胞外出芽方式形成囊泡或伪足断裂而形成直径<1.0 μm的血小板衍生微粒(platelet-derived microparticles～PMP),1,。PMP除了具有抗凝和促凝活性外还与造血调控有关～具有促进造血细胞增殖、黏附和抗凋亡等多种功能。Baj-Krzyworzeka等,2,报道PMP促进人CD34，及造血干细胞系的增殖～抑制CD34，细胞凋亡～促进造血干细胞黏附及趋化作用。Janowska-Wieczorek等,3,比较了动员的外周血、未动员的外周血及骨髓来源的CD34+细胞表面血小板特征性抗原CD41和CD61表达情况。结果表明:动员后的外周血CD34+细胞抗原表达显著高于未动员的外周血和骨髓来源CD34+细胞的抗原表达。考虑到在动员过程中血小板被激活～且造血干细胞的黏附能力通过与血小板激活后释放的PMP接触而增强～因而促进了造血干细胞移植后的植入。本实验结果表明～PMP能明显促进脐血粒巨噬祖细胞的增殖～并与PMP呈剂量依赖关系。 造血干细胞表面的黏附分子的活性与造血干细胞的“归巢”有关。 脐血造血干细胞移植后造血功能的恢复比骨髓和外周血来源的造血 干细胞移植要慢～这可能与脐血造血干细胞表面许多黏附分子的表 达,如:CD62P～CXCR4,比骨髓来源的造血干细胞要低,4-7,～另 外～造血干细胞可表达血小板连接抗原～如CD162和CD11b。许多 实验表明～血小板可能通过多种生物学效应影响造血干细胞的活 性。Liu等,8,报道23名接受脐血移植的儿童白血病患者中性粒 细胞的恢复时间与CXCR4表达情况密切相关～而血小板恢复情况与 CD62P和CXCR4有关。PMP表达CD41、CD62P和CXCR4等黏附分子～ 而CD34+细胞表达血小板连接抗原CD162和CD11b～与PMP共同孵育 后的CD34+细胞可更有效地黏附于人脐静脉内皮细胞和黏连蛋白～ 提示PMP可以提高脐血移植中供者造血细胞与受者骨髓之间的黏附 性～从而促进造血的恢复。 脐血造血干细胞已经成为造血干细胞移植的细胞重要来源～但单份 脐血中造血干细胞数量往往不足以支持成人的造血重建。PMP具有 促进脐血造血干细胞增殖、黏附和归巢作用～故PMP在造血干细胞 移植领域中可能具有很好的应用前景。 【参考文献】 1Hughes M～Hayward CP～Warkentin TE～ et al. Morphological analysis of microparticle generation in heparin-induced thrombocytopenia. Blood～2000; 96: 188-194 2Baj-Krzyworzeka M～Majka M～Pratico D～et al. Platelet-derived microparticles stimulate proliferation～ survival～adhesion～and chemotaxis of hematopoietic cells. Exp Hematol～2002; 30: 450-459 3Janowska-Wieczorek A～Majka M～Kijowski J～et al. Platelet-derived microparticles bind to hematopoietic stem/progenitor cells and enhance their engraftment. Blood～2001: 98: 3143-3149 4Gluckman E～Rocha V～Chastang L～et al. Cord blood hematopoietic stem stem cell biology and transplantation. Education Program Florida. Washington～DC: American Society of Hematology～1998: 1-4 5Voermans C～van-Hennik PB～van-Der-Schoot CE. Homing of human hematopoietic stem and progenitor cells: new insights～new challenges? J Hemtother Stem Cell Res～ 2001;10:725-738 6刘斌～廖灿～赵民等. 脐血CD34+细胞表面粘附因子受体和趋 化因子受体表达的检测. 中华器官移植杂志～2001; 22: 329-330 7Watanabe T～Dave B～Heimann DG～et al. Cell adhesion molecule expression on CD34+ cells in grafts and time to myeloid and platelet recovery after autologous stem cell transplantation. Exp Hematol～1998; 26:10-18 8Liu B～Liao C～Chen JS～et al. Significance of increasing adhesion of cord blood hematopoietic cells and a new method: platelet microparticles. Am J Hematol～2003; 74:216-217 转贴于