牛初乳中sIgA双抗夹心ELISA检测方法的建立

牛初乳中sIgA双抗夹心ELISA检测 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 的建立 牛初乳中sIgA双抗夹心ELISA检测方法的 建立 vv,w.chinadairy.net zgrpgy@163com 中国乳品工业 da/ryINDUSTRY 牛初slgAJlJ~抗夹IU?ELISA检测方法的建立 朱洪艳,赵红宇,周盛华,高学军 (1.黑龙江康普生物科技有限公司,哈尔滨150000;2.东北农业大学乳品科学教育部重点实验室,哈尔滨150030) 摘要:为定量检测牛初乳中slgA,建立双抗夹?~;ELISA方法.以牛初乳中的sI为抗原,免疫新西兰白兔,制得抗血清,经纯化后作为 包被抗体;利用简易过碘酸钠法对兔抗牛sI标记辣根过氧化物酶(HRP),制得酶标抗体;通过方阵滴定法确定ELISA最佳工作条件; 进行特异性,重复性,稳定性实验并且检测牛初乳粉样本中的sIgA含量结果:成功建立了一种定量检测牛初乳中sIgA的双抗夹心 ELISA~法.该方法线性范围:15.625~i000b~g/L;最低检测限(LOD)为15.625jxg/L;精密度为:批内CV=4.8%;批间CV=6.5%. 关键词:ELlSA,slgA,牛初乳 中图分类号:TS252.7文献标识码:A文章编号:1001—2230(2011)03—0050—03 EstablishmentofasandwichELISAforquantitivemeasurementofslgA ZHUHong—yan,ZHAoHong—yu,ZHoUSheng—hua,GAoXue-jun 1.HeilongjiangKanpurebiotechnologyCo.Ltd.,Harbin150000;2.KeyLaboratoryofDairy ScienceMinistryofEduca— tionNortheastAgriculturalUniversity,Harbin150030,China) Abstract:ToestablishaneffectiveELISAmathodforthedeterminationofbovinecolostrums lgA.Rabbitwasimmunizedbybovine colostmmsIgAtOobtaintheantiserum.Useingthepurifiedantiserumascoatingantibody.A ?theanti—slgawerelabeledwithhorseradish peroxidasebysodiumoxidationmethod,andtaketheHRPlabeledanti— slgAforlabeledantibody.TheoptimalconcentrationsofELISA weredefinedbytitration.Forspeciticityreproducibilityandsensitivityexperimentandmeas uredtheslgAlevelsofbovinecolostrumwiththis assay.ResultsasandwichELISAassayfordetectingsIgAinbovinecolostrumwasestablishe dsuccessfully.Theassayresultwashnearovera concentrationrangeof15.625, 1000g/Lwithalimitofdetection(LOD)of15.625b~g/L.Thecoefficientsofvariationwas4.8 %withinassay and6.5%betweenassay. Keywords:ELlSA,sIgA,measurement 0引言 sIgA.~#b分泌液中存在的主要抗体.它具有和人 初乳相同的免疫源性,是呼吸道,消化道,泌尿生殖道 等抵御病毒,细菌等病原及有害物质入侵的第一道免 疫屏障.研究发现sIgA能聚集细菌和病毒形成复合物, 而易被黏膜屏障所阻挡或通过粪便,痰液及鞘膜液等 分泌作用排出体外,是人体黏膜免疫的主要抗体l1_31 然而.目前牛初乳类产品国内外缺乏必要的检测方 法.此种方法的建立为牛初乳类产品的工业化开发与 检测提供一种准确,快速,稳定的检测手段. 1实验 1.1材料 牛sIgA蛋白,兔抗牛sIgA多克隆抗体(自制),可溶 收稿日期:2010—11—08 作者简介:朱洪艳(1983一),女,本科,主要从事蛋白纯化研究. 通讯作者:赵红宇 型单组{~TMB底物溶液,辣根过氧化物酶,牛初乳粉, 96孔酶标板(Nunc);BovineIgAELISAQuantitation Kit试剂盒.SeperdexG-25,BCA蛋白浓度测定试剂盒, 其他试剂均为进口分装或国产分析纯化学试剂.实验 室用水均为去离子水 1.2仪器 酶标仪(BIO—RAD680),微量移液器,高速冷冻 离心机 1.3方法 1.3.1包被抗4#-的制备 取4只6,8周龄,雄性,健康新西兰白兔.分成2组, 第一组3只,为被免疫兔,第二组1只设为阴性对照.采 用颈,背部皮下多点注射的方法进行免疫,每只兔每 次2rag(以蛋白量计)牛sIgA~自免疫原,每隔15d免 疫1次第3次免疫后10d,耳静脉取血,间接ELISA法 检测兔血清效价.当效价达到1:10000时心脏采血, 制备抗血清 抗血清经饱和(NH4)2SO盐析后,过SeperdexG一 25柱除盐,收集除盐后的溶液,PEG-6000透析浓缩, Dl,/—:两卷第244,甥 InspectionMethods测定方法 浓缩后的溶液即为兔抗牛sI抗体,检测效价后,分 装,--20o(=冻存.J~BCA蛋白浓度测定试剂盒检测纯 化后抗体浓度. 1.3.2酶标抗体的制备 采用简易过碘酸钠法对纯化的兔抗牛slgA抗体 标记辣根过氧化物酶(HRP),加甘油分装后,-20? 冻存. 1.3.3双抗夹心ELlSA方法的建立 以方阵滴定法分别确定包被抗体的最佳稀释度 和工作条件:最适封闭液和作用时间:酶标抗体的最 佳稀释度和作用时间:底物溶液的最佳反应时间建 ~ELISA的最佳实验条件 1.3.4 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 曲线的建立 以牛slgA蛋白为标准品,系列稀释质量浓度: 1000,500,250,125,62.5,31.25,15.625p.g/L,按照已确 定的ELISA最佳实验条件进行检测.同时设定样品稀 释液为阴性对照,TBST为空白对照,平行测定20次. 以标准蛋白slgA的质量浓度为自变量.其所对应的 OD45o一值平均值减去空白OD45o一值为应变量,利用 ELISACalc数据分析专用软件绘制标准曲线确定标 准曲线的最低检测限和线性范围 1.3.5特异性实验 选取与待检蛋白性质相近的另外几种乳蛋白:牛 免疫球蛋白G(IgG),牛免疫球蛋[hM(IgM),乳铁蛋白 (LF),酪蛋白进行特异性实验,每种蛋白重复两个孔. 设置样品稀释液为阴性对照.sIgA的最低检出限为阳 性对照. 1.3.6重复性实验 随机抽取14个批次的牛初乳粉样.同时进行批内 和批间检测,批内设两个平行.批间设10个平行,设置 阴性对照和空白对照.对所得数据进行统计学分析 1.3.7稳定性实验 包被抗体的破坏性实验:将已包被的酶标板.置 于37?72h.取出,以1.1.3建立的程序检测slgA标准 品溶液(62.5ng/mL),设两个平行,计算所测得的sIga 质量浓度占sIgA标准溶液初始质量浓度的百分比:酶 标抗体的破坏性实验:1:3ooo~释酶标抗体后.分成 小支,约1mL/fi~,置于37oC72h,取出,按1.1.3建立 fl@ELISAS~序实验,检测sIgA标准品溶液(62.5g/L), 设置两个平行,计算所测得f~JsIgA质量浓度占slv标,A 准溶液初始质量浓度的百分比 1.3.8牛初乳粉样本的检测 随机抽取50个牛初乳粉样.用建立的ELISA2/Y~ (设为A方法)测定其中的sIgAF~量浓度,在相同条件 下与BovineIgAELISAQuantitationKit试剂盒(设为B 方法)的检测结果作对照.用统计学方法分析这两种 方法的符合性 2结果 2.1抗血清纯化前后效价的测定 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 1为抗血清纯化前后效价对比结果.由表1可以 看出.纯化前后血清效价均可以达到1:10o0obR上. 采用BCA蛋白质量浓度测定试剂盒检测纯化后抗体 冻存,备用. 质量浓度为3g/L.分装, 表1前后效价对比结果 纯化前抗血清纯化后抗血清 2.2双抗夹心ELISA最佳实验条件的确定 方阵滴定法确定的双抗夹心ELISA的最佳实验条 件为:每孑L100?L质量浓度为1mg/L包被抗体,37? 1h包被酶标板:pH8.0TBST洗板3次,每次间隔 3min;200m】每孔1%BSA37oC0.5h封闭;洗板3次; 加抗原或标准品37oC1h,每孔100L;洗板5次;酶 标抗体1:3ooo-~释,每孔100L(37oC,1h);洗板5 次;加TMB底物溶液12latin:浓度为2mo1/L的H,SO 终止反应;酶标仪450rim(主)及630nm(辅)的双波长 读IYcKOD值 2.3标准曲线的建立 表2为sIgAELISA检测结果.根据表2的sI ELIsA检测数据建立的标准曲线如图1所示.该曲线为 4参数Lo百stic拟合;方程:Y=一D)/【1+(x/C)B] +D;A=2.10897;B=一1.63730;C=371.61047;D =0.04871:=0.99689.从结果可以看出:最低检测限 15.625b~g/L;检测范围15.625~1000I.zg/L. 表2sIgAELISA检测 sIgA/(Ixg?L)OD50 1000 500 250 125 62.5 31.25 15.625 1.165 0.986 0726 0,636 0.516 0.397 0.090 X值 图1slgAELISA检测标准曲线 2.4特异性实验 表3为特异性实验结果由表3可以看出.阳性 OD45o一值与这4种蛋白的OD45o值的比值均大于2.0, 说明本研究建立的ELISA~Y法不与这几种蛋白反应. 有较好的特异性 f.八;D7一 测定方法InspectionMethods 2.5重复性实验 根据SPSS10.oK计软件中的随机单位组设计资料 的s—N—K方差分析方法进行分析:批间比较,F= 0487,P=0.673>0.05;批E内比较,F=2.16,P=0.259>0.05, 二者差异均无显着意义说明建立的双抗夹心ELISA 方法在批内和批间检测同一样品时差异不显着根据 公式CV=S/Xx100%计算批内和批间的变异系数均小 于10%可见用该方法检测样品具有较好的重复性 表3特异性实验结果 2.6稳定性实验 表4为稳定性实验结果.由表4可以看出,放置 37?(72h)后所测slgAN量分数基本不变,根据《中' 国生物制品检定规程》:一般37?72h破坏,与4?放 置相比较.渎值下降不超过20%.认为其效期在6个月 左右.由此可以断定本实验具有较好的稳定性. 表4稳定性实验结果 2.7实际牛初乳粉样本的检测 表5为牛初乳粉样本检测结果分别以A方法和B 方法检测随机抽取的5O个牛初乳粉样.依据表5所得数 据做图.结果如图2所示.进行统计学分析:分别对两种 方法所测数据进行F和佥验.置信度为95%时算<Fa,这 两种检测方法的精密度无显着性差异.再进行t检验:查 值表,户48,95%置信度时#<喙,故这两种方法的测定 结果无显着性差异.两种方法的检出符合率为92%. 表5牛初乳粉样本检测结果 壬 SIgA)~量分数/% 一 A方法检出个数;一一B方法检出个数 图2A方法与B方法的比较 3讨 影NELISA实验结果的因素很多.需要加强各个 环节的质量才能充分发挥其方法学的优点特别是固 相载体的包被难达到各个体之间的一致.因此在本实 验中每批测试均须用一系列不同质量浓度的参考标 准品,在相同的条件下制作标准曲线标准曲线稀释 的最适比例可以直接影响到检测样本中sIgA质量浓度 的最终检出值.因此选择标准曲线的最适稀释比例对 于定量检测非常重要[101本研究所测的slgA属于大分 子量物质.故选择的标准曲线范围较宽.曲线最高点 的吸光度接近2.0以检测物的质量浓度为横坐标.以 吸光度为纵坐标.将各质量浓度的值逐点连接.所得 曲线一般呈s形,其头,尾部曲线趋于平坦,中央较 呈直线的部分是最理想的检测区域所以最后所确 定的标准品的最适稀释比例应落在这个区域中基 于以上原因.本研究最后确定的最佳稀释质量浓度为 1000,500,250,125,62.5,31.25,15.625g/L. 目前国内还没有定量检测牛初乳中sIgA的标准方 法.本研究选择双抗夹心ELISA/r'g为检测牛初乳中 sIgA的方法.该方法简单,快速,灵敏性高,有较好的重 复性,结果判断较客观.为检测工业产品中slgA的含量 提供了参考 参考文献: …杨致邦初乳sIgA研究进展【M】.国外医学:流行病学,传染病学分册, 2004,31(3):188-190 【2]曹劲松,王晓琴牛初乳功能性食品的开发现状和前景UJ_食品科学, 1999(5):14-17 l3】高丽霞,郭爱萍牛初乳中的活性成分及其开发利用U1.农产品加工学 刊.2010(4):46—57 周惠珍,龚志木,乔伯英,等辣根过氧化物酶标记葡萄球菌A蛋白的简 易过碘酸钠法[11中国人民解放军军医进修学院.I984.04:171— 173 『51项开合牛乳铁蛋白单克隆抗体的制备及双抗夹bELISA方法的建 立『D].吉林:吉林大学,2007 [6]ZHANGSH,LILs,0uYX,etalUseofMonoclonalAntibodiesin DetectionofClostridiumbomlinumTypeBToxinbyELISA?]. JournalofMedicalCollegesofPLA.1986(03):246—252. 【7】桑卓奇ABC—ELISA定量测定红细胞趋化因子受体及其意义U].黑 龙江医学,2007,31(6):504—604. [8]刘丽萍,Rb~1'1.定量检测Pr0MBP双抗体夹心方法的建立U1南京医 科大学,2008,28(7):836—840. 19]张志强,何萍双抗体夹bELISA定量检测血清Cap43蛋白方法的建 立与评价[y】中国现代医学杂志,2007,17(13):1561—1564 [10]白雪.牛朊蛋白双抗夹心EusA方法的建立ID].吉林:吉林大学,2008 52—20—11第一卷第l期r苴第?期)