下毛目分子系统进化研究和鬃棘尾虫再描述(可编辑)
下毛目分子系统进化研究和鬃棘尾虫再描述
第 27 卷 第 1 期 Vol. 27 ,No. 1
动 物 分 类 学 报
2 0 0 2 年 1 月 J an, 2 0 0 2
AC TA ZOO TAXONOMICA SIN ICA
1
下毛目分子系统进化研究和鬃棘尾虫再描述
纤毛动物门 :下毛目 :尖毛虫科
2
朱飞云 余育和 沈韫芬
中国科学院水生生物研究所 武汉 430072
摘要 作者自武汉东湖采集的样本中分离出鬃棘尾虫 Stylonychia p ust
ulata ,利用活体观察与蛋白
银染色技术进行了形态学研究 ,并测定了核糖体小亚基 RNA 基因全序列 ;以邻接法 Neighbor2
J oining ,NJ 和最大简约性法 imum Parsimony Method , MP对该物种与 GenBank 中所有其它
下毛目物种进行了分子系统发育分析。结果显示 :所研究下毛目种类皆聚为一支 ,支持下毛目为
单系观点 ;尖毛虫属和棘尾虫属物种聚类相互交错 ,因此结合形态学上分
类标志的分析 ,对这两个
属存在的合理性提出异议。根据本文对同种不同种群的小腔游仆虫 Euplotes aedicalat us、 尖毛虫
Oxytricha granulifera 以及鬃棘尾虫 Stylonychia p ust ulata 分子进化分析 ,说明在研究系统问题时同
时给出模式种的形态学及分子生物学两方面资料的必要性。
关键词 下毛目 , 鬃棘尾虫 , 核糖体小亚基 RNA基因 , 形态学 , 系统进化.
中图分类号 Q9591116
下毛目 Hypotrichida 纤毛虫为原生动物中结构最复杂、 进化地位最高等的一个类群。自
1859年 Stein 设立下毛目以来 ,其系统分类已经进行过多次较大的修订 Corliss , 1979 ;
J ankowski , 1979 ; Hemberger , 1982 ; Small &L ynn , 1985 。然而由于物种多样性丰富 ,且其
结构复杂 ,目前依据形态学特征所做的下毛目分类系统的修订和更正版本很多 ,目下各阶元分
类地位存在明显的混乱。1985 年 ,Small &L ynn 提出一个新的纤毛虫分类系统。在这个系统
中 ,他们根据亚显微结构将下毛类中的盘头类 Discocep halina 和游仆类 Euplotina 提升为两个
独立的亚目 ,并将这两个亚目归属于 Cytop hora 亚门的篮管纲 Nassop
hora ,而其它下毛目则归
于 Postciliodesmatop hora 亚门的旋唇纲 Spirotricha。Coliss 于 1994 年提出的原生生物新系统
中纤毛门下分八个纲 Corliss , 1994 ,所有传统的下毛目都分隶于多膜纲 Polylymenop horea 旋
唇亚纲 Spirotrichia。我国学者依据下毛类纤毛图式以及形态发生上的特征将下毛目划分为 5
个亚目 20 个科 施心路 ,1999 。迄今为止 ,依据显微结构 纤毛图式 、 亚显微结构及形态发生
所构建的下毛类分类系统中 ,无一为学者所普遍接纳。因此 ,一个理想的分类系统的建立有赖
于更多的特征加入 ,而生物大分子就是重要选择之一。利用近几年发展起来的分子系统进化
分析方法 ,进一步研究下毛目的各种、 属、 科间的相互关系 ,有可能完善现有的分类系统。
核糖体小亚基 RNA基因序列 small subunit ribosome RNA gene ,ssrDNA 于 1985 年首次
用于分析纤毛虫的系统进化 Elwood , 1985 。由于核糖体小亚基 RNA 基因序列具有较高的
1 国家自然科学基金重点及面上基金资助项目编号 397300 ; 396701562 通讯作者 E2mail :yhyu @ihb. ac. cn.
收稿日期 :2001O 07O 13 ,修订日期 :2001O 08O 29.
241994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All
rights reserved ////0>.
1 期 朱飞云等 :下毛目分子系统进化研究和鬃棘尾虫再描述 纤毛动物门 :下毛目 :尖毛虫科 25
保守性 ,而且序列长达约 117 千个碱基对 ,可以提供足够的信息以分析不同分类阶元的进化关
系。在较低的阶元上如对草履虫属 Pa rameci um 各种间的进化关系分析 Struder2Kyp ke
2000 ,在较高的阶元如对肾形纲 Colpodea 下各目间进化关系的分析 Lynn , 1999 。这些研究
与形态学分类系统保持一定程度的一致性 ,并解决了部分存在意见分歧的分类学问题 Green2
wood , 1991 。目前已经有部分下毛目的 ssrDNA 进化关系得到了研究 Schle gel , 1991 ;
Schlegel , 1988 ,但尚未见有完整的关于下毛目进化框架的研究报道。
鬃棘尾虫的 ssrDNA 序列 Elwood 于 1985 年有过报道 Elwood , 1985 ,但由于当时尚未有
足够的此类序列资料 ,因此对于该种及其它下毛目的系统进化关系没有详细的分析。本文测
定了中国一个种群的鬃棘尾虫的 ssrDNA 序列 ,结合 GenBank 中所有下毛目纤毛虫 ssrDNA 的
序列资料 下毛目种类依据 Corliss , 1979 的系统 ,详细分析了包括种群
间、 属间及科间的下毛
目的分子系统发育及分类情况。
1 材料与方法
111 鬃棘尾虫 Stylonychia pustulata 分离培养
从武汉东湖采集的水样中分离得到鬃棘尾虫。单个虫体置于 0125 % w/ v Cerop hyl
Sigma , StLouis , MO培养液中 ,饲以细菌进行克隆培养 30 ? 。所得克隆培养一部分用
于活体显微观察与蛋白银染色制片 ;另一部分用于基因扩展测序。
112 蛋白银染色
采用史新柏改进的蛋白银染色方法 Shi , 1990 对细胞、 核器及其
表
关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf
膜下结构进行显示、
观察及记录。
113 核糖体小亚基 RNA基因扩增
克隆培养的鬃棘尾虫以无菌水清洗浓缩后用于基因扩增测序。以常规的酚 ?氯仿法提取
基因组 DNA。基因扩增使用的引物为纤毛虫通用的核糖体小亚基 RNA 基因 ssrDNA 全序
列的扩增引物 Medlin , 1988 ,引物序列分别为 5′TGA TCCTTCTGCA GGTTCACCT 3′和
5′ AACCTGGTTGA TCCTGCCA G 3′。 100μl 的扩增反应溶液包括 :约 50 ng 的基因组 DNA , 2
μ μ
U Taq DNA 聚合酶 ; 5′ 端和 3′ 端引物各 011 mol/ L ; 250 mol/ L dN
TP。在 Perkin2Elmer 9600
的 PCR 仪上进行扩增反应 ,反应参数为 :开始为 94 ? 10 min 的预变性 ,接着为 35 次循环 :
94 ?1 min , 48 ?1 min ,72 ?2 min ,最后为 72 ?10 min 的延伸。
114 基因片断的克隆及测序
PCR 反应的产物以 1 %的琼脂糖凝胶电泳分离 ,经 EB 染色后将所需条带 约 117 Kb 切
下 ,用试剂盒 Glassmilk DNA Purification Kit BioStar 提纯此 DNA片段。纯化得到的 DNA连
接于 M13 载体 Promega 上转化入大肠杆菌 HB101 菌株的感受态细胞中。克隆培养后检测
所得阳性克隆 ,即含目的基因克隆在 BioAsia 公司进行测序。
115 系统发育分析
测得的鬃棘尾虫 Stylonychia p ust ulata 的 ssrDNA 序列与截止到 2001 年 5 月为止 Gen2
Bank 中所有的下毛目 24 个种以及下毛目以外的纤毛虫 6 个纲中 6 个种 作为外类群 的相同
基因的序列进行系统发育分析。以 Clustal W 进行序列的对准排列 ,用 Phylip 软件包构建系
统树。所用统计方法为基于 Kimura 的双参数模型的邻接法 Neighbor2J
oining , NJ 和最大简1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved ////. 26 动 物
分 类 学 报 27 卷
约性法 imum Parsimony Method , M P ,并用 Bootstrap 法对系统树进行
评估。
分析中使用的 GenBank 数据有 :下毛目的大 纤虫 Aspidisca stei ni AF305625 , 双眉虫
Diophrys appendiculata A Y004773 ,恩格曼虫 Engelma n niella mobilis AF164134 , 小腔游仆虫21
Euplotes aediculat us21 AF164136 , 小腔游仆虫 Euplotes aediculat us M14590 , 拟游仆虫 Euplo2
tidi um a rena ri um Y19166 , 杯状腹柱虫 Gast rostyla stei nei AF164133 , 全列虫 Holosticha multi2
stylata AJ277876 , 四角翁柯虫 O nychodromus quadricor n ut us X53485 ,
尖毛虫 Oxyt richa gra n2
ulifera21 AF164122 , 尖毛虫 Oxyt richa gra n ulifera X53486 , 尖毛
虫 Oxyt richa t rif allax
AF164121 ,似尖毛虫 Oxyt richa longa AF164125 , 尖毛虫 sp2B Oxyt richa sp2B AF164683 , 尖
毛虫 sp2F Oxyt richa sp2F AF164684 , 尖毛虫 Oxyt richa nova M14601 X03948 ,浮萍棘尾虫
Stylonychia lemnae AF164124 ,贻贝棘尾虫 Stylonychia mytil us
AF164123 ,鬃棘尾虫21 Stylony2
chia p ust ulata21 M14900 X03947 , 柔似尾枝虫 Pa ra urostyla weissei
AF164127 ,扁毛虫 Phaco2
di ni um metchnikoff i AJ 277877 , 瘦尾虫 U rolept us galli na
AF164130 , 鱼形瘦尾虫 U rolept us
pisces AF164131 , 胖尾刺虫 U ronychia t ra nsf uga AF260120 以及非下毛目的茂爽口虫 Clima2
costomum vi rens X65152 ,膨大肾形虫 Colpoda i nf lata M97908 ,圆纹虫 Furgasonia blochma n ni
X65150 ,条纹鸟喙虫 Loxodes st riat us U24248 ,扭头虫 Metop us contort
us Z29516 ,展开四膜虫
Tet rahymena pat ula X56174。
2 结果
211 形态学特征
活体观察时 ,虫体腹面观为长椭圆形 ,虫体坚硬 ,运动时不弯曲 ,尾棘毛明显。运动时以虫
体纵轴为中心旋转向前 ,有时于基质表面滑行或静止不动。
μ μ
蛋白银染色制片显示 :虫体约 7715~117 m × 35~55 m ,口围长与体长比近似 2? 1
1~2 4 813μm ×1912μm 图 1
图 ;口内膜与口侧膜平行排列 图 ;大核两个 ,长椭圆形 ;小
核两个 ,位于大核左侧紧密相连 图 3 ;额棘毛、 腹棘毛、 横棘毛及尾棘毛数目分别为 8、 5、 5、 3
图 1、 6、 7 ;左缘棘毛与右缘棘毛在尾部未交汇 图 5 ;背触毛 6 列 图 2 :1~4 列较长 ,第 4
列未延伸至体前端 ,与 Wirnsberger 所描述的鬃棘尾虫略有差异 Wirnsberger , 1985 。
212 序列
鬃棘尾虫核糖体小亚基 RNA 基因的全序列测定 ,共得到总长 1771 bp 的基因序列 , Gen2
Bank 中登录号为 :AF396973。
213 系统发育分析
依据 Corliss 1994 年的原生动物新系统选用其姊妹群的几个种作为其外类群 ,包括核残迹
纲的条纹鸟喙虫 ,多膜纲的茂爽口虫和扭头虫 Mcontort us ,肾形纲的膨大肾形虫 ,篮管纲的
圆纹虫 F. blochma n ni 和寡膜纲的展开四膜虫。
图 9~10 分别基于 Kimura 的双参数模型邻接法与最大简约性法所建立的分子系统进化
树。这两个重建的进化树结果相同 :所有下毛目种类全部聚为一支 ,且自举检验值分别高达
98 % NJ 树和 99 % M P树 。所分析的 25 种下毛虫纤毛虫中 ,除大 纤虫、双眉虫 D. ap2
pendiculata、小腔游仆虫 Euplotes aediculata21、小腔游仆虫 Euplotes aediculat us、拟游仆虫
E. a rena ri um、胖尾刺虫及扁毛虫 P. metchnikoff i 外 ,其它 19 个种以 100 % NJ 和 100 %
M P的自举检验值聚为一支。尖毛虫 Oxyt richa 和棘尾虫 Stylonychia 两个属的各物种似尖1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing
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1 期 朱飞云等 :下毛目分子系统进化研究和鬃棘尾虫再描述 纤毛动物门 :下毛目 :尖毛虫科 27
图 1~8 Stylonychia p ust ulata
11腹面观 ventral view 21背面观 dorsal view 31大核 Ma 及小核 Mi 41波动膜 UM ,包
括口内膜和口侧膜 include EM and PM 51虫体末端 示左、 右缘棘毛不交汇 61示尾棘毛 3 根
caudal cirri 71示腹棘毛ventral cirri 81大核复制带 Ma replication band1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing
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毛虫、 尖毛虫 sp2B、 尖毛虫 Onova、 尖毛虫 sp2F、 尖毛虫 Ot rif allax、 浮萍棘尾虫、 鬃棘尾
虫及贻贝棘尾虫相互混杂在一起 自举检验值为 93 %和 67 % ;并且此分支中还包括了与尖毛
虫 Ot rif allax聚为一支的杯状腹柱虫、 与尖毛虫 sp2F 聚类的四角翁柯虫以及与尖毛虫 sp2
B 聚类的柔似尾枝虫。
小腔游仆虫 Euplotes aediculat us 的两个种群以 100 % NJ 和 100 % M P的高检验值聚
为独立的一支 ;在 NJ 树中尖毛虫 Oxyt richa gra n ulifera 的两个种群的分支也聚类为一支 ;然
而在两种系统进化树中 ,两个群体的鬃棘尾虫 Stylonychia p ust ulata
均未成一单支 ,而是鬃棘
尾虫 Stylonychia p ust ulata 先与尖毛虫 Oxyt richa nova 聚类后再与鬃棘尾虫 Stylonychia p ust u2
lata21 聚在一起 ,这与形态学分类矛盾 ,将在讨论中作出解释。
3 讨论
如前所述 ,测定的基因全序列 ,与 Genbank 中目前已知的 24 种下毛类一起 ,现共 25 种下
毛目纤毛虫核糖体小亚基 RNA基因全序列已经清楚。作者将这 25 种下毛类 ,与作为外类群
的 6 个种一起进行了分子发育系统研究。以邻接法和最大简约性法构建的分子进化树 ,都毫
无例外的将所分析的 25 种下毛类构成一支 ,而将用作比较单元的其它 6 种纤毛虫排除在外
图 9~10 。这说明下毛目是单系的 ,本研究支持所分析下毛虫归属下毛目这
个高阶元的设
置。但在低级阶元方面与形态分类学对有关阶元的归属及地位有些出入。
311 关于尖毛虫属 Oxytricha 和棘尾虫属 Stylonychia 的地位
尖毛虫属和棘尾虫属隶于散毛亚目尖毛虫科 ,从形态学上区分这两个属的特征一般是尖
毛虫属的虫体外形柔软可弯曲 ,尾棘毛细弱以及普遍存在表膜下颗粒。然而有学者提出用活
体状态下表膜的软硬程度来区分腹毛类 ,如尖毛虫与棘尾虫等具有一定的主观性。以尾棘毛
的发达与否来区分这两个属同样缺少一客观衡量尺度。因此从形态学上看两属并无明显可界
定的特征。以前有学者以基因序列分析对这两个属进行了分子进化研究 ,但由于每个属下选
用的种数目过少 ,因此构建的分子进化树中未能反应出尖毛虫属和棘尾虫属的复杂交错的进
化关系 Baroin2Tourancheau , 1992 ; Hoff man , 1997 。在本文研究中 ,尖毛虫属和棘尾虫属的
物种并未泾渭分明地形成独立的两个分支 ,而是构成了交织在一起的同一个分支的主干 除了
尖毛虫 Ogra n ulifera ,100 次的自举检验值达 93 % NJ 和 67 % M P 图 9~10 。据此认为
尖毛虫属和棘尾虫属的确立缺乏足够的依据。
312 关于腹柱虫、 尾枝虫及翁柯虫归属及其所属亚目地位
四角翁柯虫 O nychodromus quadricor n ut us、杯状腹柱虫 Gast rostyla stei nei 和柔似尾枝虫
Pa ra urostyla weissei 3 个种的分类归属一直是有争议的问题。杯状腹柱虫 Gast rostyla stei nei 的
分类地位仅依据形态学和形态发生的研究被不同学者划归散毛亚目或排毛亚目 Eigner &
Foissner , 1994 ; 施心路等 , 1999 ;徐朝晖等 , 2000 ,此属的分类地位一直未能确定。研究结果
揭示 ,杯状腹柱虫 Gast rostyla stei nei 与散毛亚目物种的关系密切 ,构成一个姊妹群 ,而非排毛
亚目 图 9~10 ,这支持施心路等的观点 ,应将此属划归散毛亚目 ;柔似尾枝虫分类上现属于
排毛亚目 施心路等 ,1999 ; Small & L ynn , 1985
,但研究中与散毛亚目的多个种形成独立的
分支 图 9~10 ,表明该物种散毛亚目亲缘关系密切。有研究显示此属背触毛的形态发生模
式 ,相比于其它下毛类 ,与尖毛虫 Oxyt richa 属更为相似 Grimes , 1978 ,这说明尾枝虫 Pa2
ra urostyla 的形态发生学研究与由形态学特征分析所得结果相悖 ,可能暗示尾枝虫与散毛亚目1994-2010 China Academic Journal Electronic
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1 期 朱飞云等 :下毛目分子系统进化研究和鬃棘尾虫再描述 纤毛动物门 :
下毛目 :尖毛虫科 29
图 9 基于 Kimura 的双参数模型邻接法 Neighbor2J oining ,NJ 建立 25
个下毛类
及六个纤毛虫 作为外类群 的 ssrDNA系统进化树
Phylogenetic tree inferred f rom ssrDNA sequences of 25 hypotrichous
and 6 other ciliates
using Neighbor2J oining method with Kimura 22parameter distance
支上数值为 Bootstrap 100 次评估所得超过 50 %的自举检验
值 ,Bootstrap percentages derived
f rom 100 replications were indicated above branches
物种的关系密切。因此 ,研究结果与 Grimes 是一致的 ,即尾枝虫 Pa ra
urostyla 应置于散毛亚
目 ;四角翁柯虫 O nychodromus quadricor n ut us 通常归入排毛亚目 ,
但有人对此提出质疑。Sz2
abo等根据形态发生学研究认为此种与尖毛虫属 Oxyt richa 以及棘尾虫属
Stylonychia 为一共
同的进化系 Szabo , 1995 。本研究的结果也将四角翁柯虫 O nychodromus
quadricor n ut us 与1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved ////. 30 动 物
分 类 学 报 27 卷
图 10 基于最大简约性法 MP 建立 25 个下毛类及 6 个纤毛虫 作为外类
群 的 ssrDNA系统进化树
Phylogenetic tree inferred f rom ssrDNA sequences of 25 hypotrichous
and 6
other ciliates using imum Parsimony Method
支上数值为 Bootstrap 100 次评估所得超过 50 %的自举检验值Bootstrap percentages derived
f rom 100 replications were indicated above branches
杯状腹柱虫 Gast rostyla stei nei、 三种尖毛虫 Oxyt richa 及两个种
群的鬃棘尾虫 Stylonychia p us2
t ulata 以高置信度聚为一支。结合以上形态发生学研究结果 ,以及本文中
重建的系统进化树 ,
认为下毛目的排毛亚目、 散毛亚目以及腹柱亚目的系统进化过程和个体的
形态学特征即其高
度特化的纤毛结构图式没有一致性 ,相同的形态不能代表相同的进化过程。
这可能与下毛目1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing
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1 期 朱飞云等 :下毛目分子系统进化研究和鬃棘尾虫再描述 纤毛动物门 :下毛目 :尖毛虫科 31
形态的复杂性相关 ,需要进一步补充更多种属的 ssrDNA资料进行深入研
究。
313 关于另一种“异物同名” 及其避免
措施
《全国民用建筑工程设计技术措施》规划•建筑•景观全国民用建筑工程设计技术措施》规划•建筑•景观软件质量保证措施下载工地伤害及预防措施下载关于贯彻落实的具体措施
在以形态特征为根据的分类学中 ,有一种异物同名现象。在系统发育研究
中 ,依据形态特
征所做的研究与依据大分子所做的研究 ,大都一致 ,但也有不吻合甚至完全冲突的结果。出现
这种冲突 ,除了可能由于所选择的形态特征或目标大分子不当外 ,还有一个原因就是两个研究
是在不同的时空进行 ,研究样本 种群 原本就不同 , 其中还不排除两个不同物种的可能 , 而
人们却是利用这种资料来对一个实体进行分析。上述差异也有可能由这种异物同名引起。本
研究涉及的 3 个种中 ,小腔游仆虫的两个种群以高检验值聚为独立一支 图 9~10 ;在 NJ 树
中尖毛虫 Ogra n ulifera 的两个不同种群分支也聚类为一支 图 9 ;但鬃棘尾虫 Stylonychia
p ust ulata 的两个群体与尖毛虫 Onova 合为一支。由于下毛目纤毛虫的高度进化以及种内形
态学多态性存在 ,文中分子进化的种内差异大于种间差异现象 ,可能与种群间形态学特征差异
相关 ,但由于本文中引用另一种群的鬃棘尾虫 Stylonychia p ust ulatal
及尖毛虫 Onova 原作者
没有给出相应的形态学及生物统计学资料 ,所以这种费解也可能是由异物同名引起。因此 ,为
详细了解下毛目分子系统进化与形态学的相关关系 ,研究者在分析分子信
息的同时给出对应
种群的具体形态学、 生物统计学资料是非常必要的。新属报道时 ,如果能
将模式种的大分子序
列资料与形态学特征一并提供 ,那将对后续的系统学研究非常有益。
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