蛋清卵类粘蛋白的分离纯化

蛋清卵类粘蛋白的分离纯化 一(实验器材 1.仪器 :pH计、恒温磁力搅拌器、蛋白质核酸分析仪、自动部份收集器、梯度混合器、层析柱、紫外可见光分光光度计 、真空冷冻干燥机、电泳仪、电泳槽、恒温震荡摇床、透析袋、冷冻离心机、 真空干燥箱、分析天平 2.试剂:新鲜鸡蛋、Sephadex G-25凝胶填料、DEAE-32纤维素离子交换填料、卵类粘蛋白标品、三氯乙酸(TCA)、丙酮、氯化钠、NaHP0、NaHP0、考马斯亮蓝G-250、考马斯亮2424 蓝R-250、丙烯酰氨、过硫酸胺、甘氨酸、Tris-base、十二烧基硫酸钠、乙醇 、冰醋酸 、碳酸氧钠 、氯化铁 、硫酸胺 3.主要溶液的配制及材料的处理: 10%三氯醋酸(pH 1.15): 先把称好的TCA加总体积2/3的水溶解,再用10 mol/LNaOH调节pH至1.15,最后加水至所需体积。 0.02 mol/L, pH 6.5磷酸缓冲液: 先配成10倍的母液,用时稀释至0.02 mol/L; 磷酸氧二钠-磷酸二氧钠缓冲液(0.02 mol/L, pH 6.5, 25?)配制方法: 0.2 mol/L 磷酸氢二钠:NaHP0 12H0 71.64 g/1000 mL, 31.5 mL; 242 0.2 mol/L 磷酸二氧钠:NaHP0 2H0 31.21 g/1000 mL, 68.5 mL; 242 胰蛋白酶标准液(0.5mg/mL): 用0.001 mol/LHCl配制(每次50ml,用完再配); BAEE 底物缓冲液(内含 0.05 mol/L CaCb): 用 0.05 mol/L 的 Tris-HCl 溶解,调pH至7.8; 1 mmol/L BAEE底物溶液: 34 mg BAEE定容至100 mL底物缓冲液中,临用前配置。 Sephadex G-25葡聚糖凝胶层析填料的处理: 称取30 g Sephadex G-25,用0.02mol/L, pH 6.5 磷酸缓冲液500 mL热溶胀2 h或者室温溶胀24 h。脱气后装柱。 DEAE-32纤维素离子交换填料的处理: 称取DEAE-纤维素粉(DE-32) 10 g,以150 mL 0.5 mol/L NaOH-0.5 mol/L NaCl溶液浸泡20 min,转移到布氏漏斗中抽滤,用蒸馏水洗至中性(大约pH8.0),抽去水分,移至烧杯中,再用150 mL 0.5 mol/LHCl浸泡20 min,然后移至布氏漏斗中抽滤,以蒸馈水洗至中性(大约pH6.0)。最后倒在烧杯中用150 mL 0.02 mol/L, pH 6.5磷酸缓冲液浸泡片刻。于真空干燥器内脱气,装柱。 二(实验方法 1. CHOM粗品的制备 1.1 TCA沉淀杂蛋白 取50mL鸡蛋清,加等体积的10%三氯醋酸(pH 1.15)溶液,这时出现大量的白色沉淀,搅拌均匀后在pH酸度计上检查pH值,此时的pH值应是3.5。若提取液的pH值偏离pH 3.5?0.2,则要用5 mol/L NaOH或5 mol/L HCl把pH值调回到pH3.5?0.2的范围以内。由于提取液非常粘调,要防止局部过酸或过碱。调好pH值后,在室温下静置4 h以上。 1.2离心去除杂蛋白沉淀 待清蛋白完全沉淀后,以3000 r/min离心10 min。弃去沉淀物,上清再用滤纸过滤。以滤除上清液中的脂类物质及其他不溶性物质。 1.3冷丙酮沉淀CHOM粗品 收集滤液转移到一个烧杯里。检查滤液的pH值是否是pH 3.5,若相差较大要调回到pH 3.5。放置冰浴中冷却片刻,缓慢加入3倍体积的预冷丙酮(放在冰箱的冷藏室预冷)。用玻璃棒轻轻揽匀。用塑料薄膜盖好,尽量减少丙酮的挥发。在冰浴里放置4 h以上。 1.4离心收集CHOM粗品并除残留丙酮 待CHOM完全沉淀后,以4000 r/min离心5 min,倾出上清夜。将沉淀物放在真空干燥器类,抽气除去残留丙酮。然后用20mL蒸馏水溶解(若溶解液浑油,则用滤纸除去不溶物),即得CHOM粗提液。 2. Sephadex G-25 层析柱脱盐 取20 mL CHOM粗提液上柱脱盐(上样量不超过柱床体积的1/6)。用0.02 mol/L,pH 6.5磷酸缓冲液平衡并洗脱。收集洗脱峰。 3. DEAE-32纤维素离子交换法纯化CHOM 将经Sephadex G-25脱盐的CHOM粗提液上柱吸附。用0.02 mol/L, pH 6.5磷酸缓冲液淋洗去除杂蛋白。流出液在核酸蛋白 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 仪上绘出稳定的基线。然后改用0.3 mol/LNaCl-0.02 mol/L, pH 6.5磷酸缓冲液洗脱。并收集活性峰。 4. CHOM纯品的制备 4.1透析除盐 将上述收集到的溶液全部装入透析袋内。用蒸馏水进行透析。间隔一段时间更换一次蒸傾水, 直到用l%AgN03检查无氯离子为止。 4.2调整透析液的pH及冷丙酮沉淀CHOM纯品 将透析液转移到烧杯里,用1 mol/LHC1调节至pH 4.0,然后加入3倍体积的预冷丙酮。盖上 塑料薄膜,在冰浴里静置4 h以上。 4.3 CHOM纯品的离心和干燥 待CHOM全部析出后,倾出上清,剩余的沉淀物于4000 r/min离心5 min。弃去上清夜,沉淀物 干燥,就得到透明胶状物一CHOM纯品。 5.产品鉴定与纯度 5.1 十二烷基硫酸钠-聚丙燭酷胺凝胶电泳(SDS-PAGE) 浓缩胶浓度5%,分离胶浓度12%。样品(2mg/mL)溶于上样缓冲液,上样量10uL,浓缩胶电泳恒 压80 V,分离胶电泳恒压120V。凝胶用50%乙醇和10%冰醋酸固定30 min, 0.1%考马斯亮蓝 R-250染色30 min, 25%乙醇和8%冰醋酸混合液进行脱色。 6.总蛋白含量测定 以牛血清白蛋白为标准蛋白质,用考马斯亮兰法测蛋白质含量。具体操作步骤如下: 6.1标准曲线的绘制 取7只干净试管,编号,并胺照下 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 所示加入试剂、混匀,室温静置3min,以第一管为空白在 595nm波长下测定读取吸光度值,以吸光度为纵坐标,各标准液浓度为纵坐标绘图得标准曲 线。 编号 1(空白) 2 3 4 5 6 7 标准蛋白液加入量/mL - 0.1 0.2 0.3 0.4 0.6 0.8 0.9 %NaCl 加入量/mL 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.4 0.2 考马斯亮蓝染液加入量/mL 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 蛋白质浓度(Hg/mL) 0 10 20 30 40 60 80 A595 nm 6.2待测样品的测定 取一只千净试管,加入1.0 mL样品液及4.0 mL考马斯亮蓝染液、混匀,室温静置3min,于波长 595 nm下比色读取吸光度值。由标准曲线查得待测液中蛋白质含量。 大连软件园1号楼及周边改造地块项目 3#楼炉渣回填施工技术交底 编制人: 马 广 军 审核人: 邹 旭 2014年 11月 26 日 大连软件园1号楼及周边改造地块项目 技术交底记录 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 名称 大连软件园1号楼及周边改造地块项目 施工单 施工单位项目经理责任书施工单位质量保证措施施工单位进场交底施工单位进场流程施工单位进场资料 位 大连亿达建设工程有限公司 分项工程名称 炉渣回填施工 2014.11.26 交底日期 交底提要 回填，炉渣 交底主要内容: 一、 主要材料 3炉渣:宜采用烟煤炉渣，表观密度应为800kg/m以内;炉渣内不应含有机杂质和未燃尽的煤块，粒径不应大于40mm，且不可大于垫层厚度的1/2;炉渣粒径在5mm以下者，不得超过炉渣总体积的40%。 二、 主要机具 (1) 机械:搅拌机、手推车、平板振捣器。 (2) 工具:铁锨，扫帚等。 三、 作业条件 (1)结构工程已经验收，控制标高水平线已弹好， (2)与垫层有关的电气管线，设备管线及埋件安装完毕，并固定牢靠。 (3)垫层施工前应经隐蔽工程验收。 四、作业条件 工艺流程: 基层处理? 按体积比拌合? 铺设拌合好的炉渣? 上杠找平控制标高? 滚压并找平?拍边修整? 养护 (1)基层处理:正式施工炉渣垫层前，把基层上粘结的杂物认真清除，清除后撒水湿润。 (2)拌合:水泥炉渣宜采用1:6(质量比)。搅拌前应先按比例计量加水拌合，干料入机后先干搅1min，再加入适量的水搅拌1.5,2min，使水泥浆分布均匀。 1 大连软件园1号楼及周边改造地块项目 其干湿程度以便于滚压密实，有少量浆不泌水为宜; (3)控制标高:回填至-0.070m标高处，水平线已经在梁上弹好。 (5)铺设与滚压:虚铺和压实厚度的比例一般是1.3:1，铺炉渣垫层时，先在铺设基层面上撒水湿润;装铺炉渣熟料，全部铺好后滚压，在滚压中局部撒垫调整平整度，经反复进行滚压平整出浆，厚度符合设计 要求 对教师党员的评价套管和固井爆破片与爆破装置仓库管理基本要求三甲医院都需要复审吗 ;对墙根、边角、管根周围不宜滚压处，应用木拍板拍打平实。本工程厚度较大时宜分层铺压。水泥炉渣垫层的施工应随拌、随铺、随压实，全部操作过程应在2h内完成。 五(质量标准 (1)保证项目: 1)炉渣垫层使用的水泥、炉渣材料质量必须符合设计要求及有关标准规定。 2)施工配合比，铺压密实度应符合设计和施工验收规范要求。 3)炉渣垫层与基层间不得有空鼓和表面松动现象。 (2)允许偏差项目:见表1。 炉渣垫层允许偏差 表1 项目 允许偏差(mm) 检验方法 表面平整度 10 用2m靠尺楔形塞尺检查 标高 ?10 用水准仪检查 厚度 个别地方不大于设计厚度1/10 尺量检查 六(成品保护 (1)垫层施工操作和运输中不应碰撞门口、管线、垫层内埋设件和已完的装饰面层。 审核人: 交底人: 接受交底人: 2