高分辨阿达玛变换显微荧光图像分析（Ⅲ）——系统分辨率和图像恢复过程对单细胞分析结果的影响

高分辨阿达玛变换显微荧光图像分析（Ⅲ）——系统分辨率和图像恢复过程对单细胞分析结果的影响 高分辨阿达玛变换显微荧光图像分析(?)——系统分辨率和图像恢复过程对单细胞 分析结果的影响 Vo1.26 2005年1月 高等学校化学 CHEMICALJOURNALOFCHINESEUNIVERSITIES No.1 3I,34 高分辨阿达玛变换显微荧光图像分析(?) 系统分辨率和图像恢复过程对单细胞分析结果的影响 唐宏武,李涛,罗美娜,吴琼水,陈观铨 (武汉大学化学与分子科学学院测试中心,武汉430072) 摘要提出了一种改进的阿达玛变换(HT)显微荧光图像分析系统,以单细胞试样分析为基础,分别对系统 的分辨率和解码后的图像恢复过程进行了讨论.结果 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明,该系统可应用于单细胞形态分析和定量分析.图 像在和Y方向的像素分辨率相同,并达到了同一成像物镜下的空间分辨率水平,因此在获取微米级单细 胞试样的微弱荧光信号的二维图像时,系统的成像能力较好,可用于单细胞形态分析.对花粉细胞的荧光衰 退过程的定量分析结果表明,对不同HT图像提供的同一系列试样的定量数据进行比较时,必须对所有该系 列试样的图像恢复过程进行归一化处理. 关键词阿达玛变换;光谱成像;荧光显微术;图像恢复;单细胞分析 中图分类号0657文献标识码A文章编号0251—0790(2005)01—0031—04 阿达玛变换(HT)作为一种多通道光谱调制技术,具有多通道同时检测能力,多通道成像能力以 及适用于数据处理等优点.近年来,阿达玛变换光谱和成像技术在分析化学领域的研究和应用越来越 广泛,主要用于化学和生物试样的拉曼[】]和荧光[2]成像分析,人脑的磁共振高分辨成像技术[引,毛细 管电泳[4]和芯片电泳技术[5]以及飞行时间质谱[6等领域. 在成像技术方面,完全采用阿达玛变换技术实现高分辨成像有一定难度,其关键在于对信号进行 多通道空间编码(用伪随机阿达玛序列编码)的阿达玛 模板 个人简介word模板免费下载关于员工迟到处罚通告模板康奈尔office模板下载康奈尔 笔记本 模板 下载软件方案模板免费下载 的设计.与传统的光学成像技术相比,阿达 玛编码成像的优势在于最大限度地提高了信噪比,因此它特别适合于对微弱光信号进行检测.最近, 我们口q采用一维编码方式,以线阵CCD为检测器,研制成一种可快速,灵敏,准确测量单细胞试样 的新型HT显微图像探测系统,可用以获取单细胞的高分辨图像(511×512像素).由于采用的是简单 的光路设计,图像在和Y方向的像素分辨率不同,二者相差4,虽然在视觉上这种差异并不显着, 也不影响单细胞定量分析结果,但对于细胞的形态学分析是不利的. 在前期研究的基础上,我们进一步减小一维模板的尺寸,以加快编码速度,缩短成像时间;同时 优化光路设计,以提高系统的分辨能力,并使HT图像在和Y方向有相同的像素分辨率;在单细胞 定量分析方面,对解码后的图像恢复过程进行研究,使不同图像提供的数据之间能进行比较. 1实验部分 1.1仪器 实验装置如图1所示.落射式荧光显微镜(重庆光学仪器厂),以高精度直流稳压供 电的100W超 高压汞灯为荧光激发源,透射光视场用溴钨灯(用直流稳压电源供电)照明.$7031—0907型CCD检测 器(日本滨松),含512×122有效像元;阿达玛变换装置(包括模板,光阑,机械传动装置,步进电机驱 动板和计算机接口等)及成像与分光装置等自制,用2个步进电机分别控制模板的移动和波长扫描.软 件用VisualC++6.0编写,可实现数据采集,编码,快速解码,图像生成,图像处理,光谱扫描和单 细胞定量分析等功能.阿达玛模板制作参考文献[8]方法,但单元缝宽减半,即单个码元宽12.5m, 收稿日期:2003—12-29. 基金项目:国家自然科学基金(批准号:20075019)资助. 联系人简介:唐宏武(1969年出生),男,博士,副教授,从事分子光谱分析和光谱仪器研究.E—mail:hwtang@whu.edu.ca 高等学校化学 高14mm.透镜Ll和L2将显微物镜提供的细胞试 样的放大实像进一步扩束或压缩成适当大小的虚 像,使其与阿达玛光阑和模板的大小匹配(光阑和 模板内接于该圆形虚像内),511次编码的图像信 号经透镜L3压缩,再经透镜L4准直成平行光后经 光栅G(600线/ram)分光,由透镜L5聚焦,并由线 阵CCD采集光谱和单色光信号. 1.2实验方法 用吖啶橙(AO)标记单细胞内DNA.AO质量:. 浓度为50btg/mL(用pH7.4的PBS配制,含1 TritonX一100).所有细胞试样均采用 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 细胞生物 学方法进行处理.打开显微镜光源(汞灯或溴钨 灯),将试样的载玻片置于载物台上,使用适当物 SchematicdiagramofthesystemofHadamard transformmicroscopicopticalimaging P:DichroicbeamsplltterlL1,L2,L3,L4,L5, L6:lensM1,M2,M3:mirrors;A:aperture; G:grating. 镜,调焦至可清晰观察到细胞试样,运行软件,获得512×511像素分辨率的灰度图像(灰度等级0, 255).用单细胞的总荧光强度(总灰度)进行单细胞定量分析. 2结果与讨论 2.1改进的HT显微成像系统的分辨率 本系统空间分辨率()实际上是指系统显微镜的分辨率,即显微镜可以分辨的2个质点的最短距 离.与物镜的数值孔径(N.A.)成反比,与光源波长成正比,即一0.612/N.A..HT图像的像素 分辨率()指图像中每个像素点所能分辨的空间尺寸,其在z和Y方向的分辨能力应该是相同的,因 此每个像素点也可被视为一个正方形,其面积为P×P.当<时,像素分辨率低于显微镜分辨率,像 素分辨率不理想,但P代表的尺寸是真实的;当一时,二者相当,P代表真实的尺寸;当p>3时, 像素分辨率超过空间分辨率,表明像素分辨率已经达到特定物镜及照明条件下的显微镜分辨能力的极 限,其代表的尺寸并不真实,这一结果是该仪器光学系统对物镜采集试样图像(实像)进一步放大的结 果.理想的情况是二者相当,或P略大于.像素分辨率过大毫无意义,P超过的部分仅起图像放大 作用,当一2时,'相当于仪器光学系统对物镜采集试样的图像(实像)放大了2倍.因此显微镜仍然 是实现清晰成像的关键.表1列出了使用不同物镜时本系统的显微镜空间分辨率和HT显微图像的像 素分辨率.由表1可知,在同一物镜下,相差1倍时,也相差1倍,虽然此时P值与无关,但并不 意味着此时图像的清晰度相同.同样使用40倍物镜,虽然HT图像的像素分辨率相同,但由于数值孔 径不同,所以其分辨能力和图像清晰度也不相同.因此,在图像分辨率一定时(512×511像素),图像 清晰度由显微视场的照明波长,物镜的数值孔径和放大倍率共同决定. Table1Spatialresolutionofthemicroscope(6)andpixelresolution(p)oftheHTmicroscopici mage underdifferentobjectives(pm/pixe1) Magnification410254040(oil)100(oil) N.A.ofobjective0.10.250.650.651.01.25 Pixelresolution.p(p.m/pixe1)3.751.50.60.3750.3750.15 Spatialresolution.6"/t~m=275nm0.6710.6710.2580.2580.1680.134 三!竺:!:::!:: *CalculatedaccordingtO一O.61)./N.A.Illuminationwith275nmlightsourceisunavailableunderaconventionaloptical micro~ope. 2.2单细胞HT显微荧光图像和单细胞形态分析 2.2.1单细胞HT显微荧光图像与前文L7q不同,本系统采用光路校正的方式,将单细胞试样的显 微镜视场图像(原始图像)中心正方形区域的z和Y方向分别充满线阵CCD的512个像元和一维阿达 玛模板的5l1个码元,虽然CCD像素和模板码元的尺寸不同,但获得的512×5ll像素的HT图像是对 特定正方形区域编码成像的结果,因此图像的每一像素均为长宽比为512:511的近似正方形,可以认 唐宏武等:高分辨阿达玛变换显微蔓光图像分析(?)33 的峰值十分接近-3个花粉粒atb和c的总荧光强Fig.2Hd.rdtr.iosifI.sc 度分别为559.5,633.9和,'132.4(单位为10总灰imaEenf哺reeAOinedZephrmthcandida 度).(L/n.)Herb.p0IIenErainscapluredwitha 2.2.2单细施形态参数涮是使用2j倍物镜时像25×objeclive(N.A.0.65)at530nm 素分辨率为0.6J1m+因此容易测量各个花粉粒的 CCDintegraltime:40['omldalaandimagea~uisi一 形态参数.由于细胞壁与细胞核是分离的+细胞核"""' AO—DNA复合物荧光很强,此处仅对细胞核进行测定.花粉粒a,b和C细胞核各形态参数分别为最大 径49.80,48.00和50.40Jn1;最小径33.00,35.dc)和3240m;周长ll1.64.1】2.91和112.69 gm;面积l249.90,l226.20和1170.O0m. 2.3图像恢复过程对单细胞定量分析结果的影响 2.3.1解码和图像恢复线阵CCD的512个光敏单元相当于512个独立的检测器.在模板平移5H 次即编码结束时,共采集512×511个编码的信号.即一次成像过程需采集261632个原始数据.埘 512个光敏单元的j11个数据分别进行相同的快速阿达玛(FHT)解码,得到512行511列共261632 个解码信号,这是源于单细胞试样的真实信号,将其按照512×511的规则排列可得到试样的屁微图 像.但在恢复图像时,所有解码信号均被相应地换算成0,255灰度等级+生成j12×511像素分辨率 的灰度图像.解码信号的最小随和最大值分别对应于0和255灰度级. 2.3.2图像恢复过程对单细胞定量分析结果的影响每一幅图像的像素灰度级均分布在0~255范围 内.使图像有适当的对比度,这有利于图像的灰度统计和对同一图像中的试样进行 形态和定量分析. 但在实际分析中.往往需对大批量试样进行定量和统计分析,或者对个别特定试样进行动态跟踪分 析.因此,对不同图像中的分析对象进行比较是必不可少的,必须对同一序列试样的图像恢复过程进 min Fig.3FIuore$~'eilP~bleachingof811AOstained Zephyranthestondida(Lindf.)Herb.pollen grainunder1wenty—minutecontinUeSilILimi- nallag 行归一化处理. 在刘同一序列试样进行成像分析时.预先设定 一 个最大随和最小值(最小值一般为0),使所有成 像过程的解码信号均不超过这一范围.对同成缘 过程可分别保存2幅图像.即不定标图像【自动生 成,灰度等级0~255)和定标图像(按上述方法预设 标准.最大灰度可能低于255),两种图像可分别用 于常规图像处理分析和系列试样的定量分析和比 较. 图3为对图2中的花粉粒b的总荧光强度连续 测定20次的结果.图3曲线n和6分别为在图像恢 复过程中定标前后的花粉总荧光强度随激发光【汞 !…'Thxperime~:condifion:灯B激发+蓝色光)连续照射2Oi时的变化情….lecellwasi . mapende {or[Itll~S~itlmutsettm""矗.目.j线I.}l晶妄:gstandardIhen~ximrlde7U…[va:r'廿JJ"fJ'【圆孔"'I'口仃t cudsign;de一…一u…m……s_hcmndt.度值是单细胞20次独立威像的结果?从原理上看, …wth…y?一.该荧光强度值应该是恒定不变的.对于图3曲线6, 34高等学校化学Vo1.26 所有2O次测定均以第一次成像的解码最大值作为最大标准来恢复图像,因此2O次连续测定的荧光强 度具有可比性.结果表明,花粉b受长时间照射时,其荧光强度显着衰退,经过20min照射,该花粉粒 的总荧光强度衰退了36.3.因此图3曲线b的结果是真实可靠的,它表明在以荧光分子标记为基础 的单细胞定量分析中,存在不同程度的荧光衰退现象,要提高测定结果的准确度,除设法减缓荧光衰 退以外,同一系列试样的测定还必须在相同的实验条件下进行,而激发光照射时间是一个容易被忽略 而又十分重要的因素.图3曲线n的结果是不真实的,在20min内,该花粉细胞的荧光强度不仅未衰 减,反而略有增大,这是由于花粉在受到长时间照射时其形态有所变化,由球形逐渐变成圆饼状,导 致表观面积(总像素点数量)增大,因此通过各点累加得到的总荧光强度值有所增大. 上述结果表明,对采用不同HT图像提供的同一系列试样的定量数据进行比较,必须对所有该序 列试样的图像恢复过程进行归一化处理,才能得到准确可靠的分析结果. [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] 参考文献 DeVerseR.A.,HammakerR.M.,FateleyW.G..J.Mo1.Struct.[J],2000,521:77—88 HanleyQ.S.,VerveerP.J.,JovinT.M..App1.Spectrosc.EJ],1999,53(1):1,1O FletcherD.W.,HaselgroveJ.C.,BolingerH..MagneticResonanceImaging[J],1999,17(1O) :1457—1468 KanetaT..Ana1.Chem.EJ],2001,73t540A一547A HataK.,KichiseY.,KanetaT.eta1..Ana1.Chem.EJ],2003,75:1765—1768 FerndndezF.M.,VadilloJ.M.,KimmelJ.R.eta1..Ana1.Chem.[J],2002,74:1611—1617 TangH.W.,ChenG.Q.,ZhouJ.S.eta1..Ana1.Chim.Acta[J],2002,468;27—34 CHENGuan—Quan(陈观铨),TANGHong—Wu(唐宏武),ZHOUJin—Song(周锦 松)eta1..Chem.J.ChineseUniversities(高等学 校化学)EJ],2001,22(7):11l41116 TANGHong—Wu(唐宏武),ZHOUJin—Song(周锦松),wuQiong—Shui(吴琼 水)eta1..Chem.J.ChineseUniversities(高等学校 化学)EJ],2002,23(12):2250--2252 High—resolutionHadamardTransformMicroscopic FIuorescenceImageAnalysis(?) InfiuenceofSystematicResolutionandtheProcessofImageRecoveryonSingleCellAnalysi s TANGHong-Wu,LITao,LUOMei-Na,WUQiong-Shui,CHENGuan—Quan (CenterofAnalysisandMeasurements,CollegeofChemistryandMolecularScience. WuhanUniversity,Wuhan430072,China) AbstractAnimprovedsystemofHadamardtransform(HT)microscopicfluorescenceimagi ngwaspre— sented.Basedonthemeasurementsofsingle— cellsamples,theresolvingabilityofthesystemandthepro— cessofimagerecoverywerediscussedrespectively.Theresultsshowthatthesystemcanbeus edforboth single— cellmorphologicalandquantitativeanalysis.PixelresolutionoftheHTimagesisidenticalinandy two— dimension,andreachestOtheresolvingpowerofthemicroscopeunderthesameimaginglens,hence thesystemSimagingabilityisreliablewhenthetwo—dimensionalHTimageofmicron— scalesingle—cellsam— piesshouldbeobtained,andthesystemcanbeeffectivelyappliedtothesingle— cellmorphologicalanalysis. Thequantitativemeasurementoffluorescencebleachingofpollencellsdemonstratesthattheprocessofim— agerecoveryforallthesesamplesshouldbeinitialized,whenthequantitativedataofasameseriesofsam— piesprovidedbydifferentHTimagesshouldbemathematicallycompared. KeywordsHadamardtransform;Spectralimaging;Fluorescencemicroscopy;Imagerecovery;Single—cell analysis (Ed.:K,X,Z)