定量pcr检测酚氯仿抽提效率[终稿]

定量pcr检测酚氯仿抽提效率[终稿] 荧光定量PCR检测酚氯仿抽提效率 摘要: 探讨荧光定量PCR检测sf9细胞内杆状病毒拷贝数测定过程中酚氯仿抽提的效 果。 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 :用荧光定量PCR检测在酚氯仿抽提DNA的过程中无关DNA(鱼精DNA)对 DNA的抽提效果的影响。结果:经过荧光定量PCR检测杆状病毒的拷贝数，在含有50ng/ul 无关DNA的检测样品中抽提率为73.6%，在不含有无关DNA的检测样品中抽提率为2.82%; 在含有25ng/ul、50ng/ul、100ng/ul、200ng/ul无关DNA的检测样品中抽提率已100ng/ul最 为显著结论:荧光定量PCR检测 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 液中杆状病毒准确灵敏，可精确的反应出在抽提过程 中DNA的抽提效果，与使用传统抽提方法相比，在抽提过程中加入无关DNA 可显著提高 目的DNA的抽提效率。 关键词:无关DNA 荧光定量聚合酶链式反应 酚氯仿抽提效果 Abstract: this paper studies the FQ-PCR detection sf9 quantitative fluorescence inside cells cn sindbis virus during the process of determining the effect of phenol chloroform extraction. Methods: using fluorescence quantitative PCR detection in phenol chloroform extraction DNA process irrelevant DNA (the fish for pure DNA) the extraction effect. Results: after fluorescence quantitative PCR detection baculovirus cn, in the 50ng/ul irrelevant containing DNA testing samples for extraction rate 73.6%, in does not contain DNA testing samples irrelevant for the extraction rate 2.82%; In 25ng/ul, containing 50ng/ul, 100ng/ul, 200ng/ul irrelevant DNA testing samples of extraction rate has 100ng/ul in the most significant conclusions: fluorescent quantitative PCR detection standard fluid baculovirus accurate sensitive to accurately reflect in the extraction process of DNA extraction effect, and use traditional extraction method compared, in the extraction process to join irrelevant DNA can significantly improve the purpose of DNA extraction efficiency. 基因组DNA在分子生物学研究中应用广泛。酚氯仿抽提DNA的方法在上个世纪八十 年代就已经开始应用，陈子桂在微量提海洋尾丝虫DNA的过程中使用酚氯仿抽提微量DNA 效果显著(1)，因其操作简单，实验成本低廉，重复性好，所以在中小规模实验室一直使用。 本实验旨在对酚氯仿抽提DNA过程中加以改进，并运用荧光定量PCR检测技术检验，更 为精确的计算DNA的准确拷贝数。因在酚氯仿抽提DNA过程中有DNA存在最低检出量(还 没有报导过)，但是在低于这个检出量时，抽提效率非常不稳定仅为13.4%(2)，为了解荧 光定量PCR检测sf9细胞内杆状病毒拷贝数准确的数量，本实验应用荧光定量PCR技术检 测在酚氯仿抽提过程中有无无关DNA及其含量对DNA抽提效率的影响。 1. 材料与方法 1.1 材料与试剂 7 6 5 4 杆状病毒测定标准品4.27*10copies/ul、4.27*10copies/ul、4.27*10copies/ul、4.27*10 3 copies/ul、4.27*10copies/ul、无关DNA(鱼精DNA)由西安华广生物公司提供;蛋白酶裂 解液、蛋白酶K、酚氯仿DNA抽提液、NaAC、无水乙醇、70乙醇、TE8.0、2.5XSYBRGREEN MIX、庆大霉素抗性基因引物、ddHO均由陕西华广生物公司提供 2 1.2 实验仪器 伯乐IQ5荧光定量PCR仪 1.3 方法 1.3.1 DNA的抽提 1.3.1.1 DNA的抽提预处理(蛋白酶K消化) 1)蛋白酶裂解液放入37?水浴中预热5min，并在室温下融化蛋白酶K; 2)取标准品及供试品40ul，分别向其中加入160ul无关DNA或者TE缓冲液，再全部滴加 ?水浴消化2h(最好过夜);200ul蛋白酶裂解液和蛋白酶K，轻弹混匀后放入37 3)向上述管中加酚氯仿400ul，剧烈震荡5min; 4)12000rpm离心10min，,取上清，加入1/10体积的3M NaAC和600ml无水乙醇，轻轻混匀后放入-20?冰箱中放置至少2h; 5)12000rpm离心10min，弃上清，用70%乙醇洗沉淀2次，37?恒温箱干燥10min，使沉淀成潮湿状; 6)200ul TE(pH8.0)缓冲液溶解沉淀，充分溶解后置-20?冰箱备用。 1.3.2 荧光定量PCR检测杆状病毒方法 标准品、标本和对照品的处理: 将10ul 2.5XSUBRGREEN MIX 庆大霉素抗性基因上下游引物每样12ulddHO混合并将1ul2标准品、抽提后的标本及对照品分别加入反应管中，低速离心10s，取出后置于荧光定量PCR扩增仪上。PCR条件为95? 3min 、95? 10s 、53.5? 30s 、68? 30s、68? 5min 40 个循环。根据大于引物阴性参照曲线的数据进行定量结果 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 。 2. 结果 2.1 荧光定量PCR检测有无无关DNA对酚氯仿抽提效率的影响 荧光定量PCR在抽提过程中有无无关DNA(50ng/ul)扩增效果图和数据结果:Unkn-1图1 7 和Unkn-2分别是40ul 4.27*10copies/ul+160ul 50ng/ul无关DNA或TE缓冲液结果，Unkn-3和Unkn-4分别是未知浓度的病毒液40ul+160ul 100ng/ul无关DNA或TE缓冲液结果，Unkn-5和Unkn-6是未知浓度的病毒液不经过抽提直接进行荧光定量PCR结果 结果显示: 由Unkn-1、2已知拷贝数的的标准液在经过添加无关DNA进行抽提后抽提率为73.6%， 然而在相同条件下将等量的TE代替无关DNA，抽提率仅为2.82%; 由Unkn-3、4、5、6可知添加无关DNA进行抽提的效率是不添加无关DNA抽提效率的54倍，是不经过抽提的病毒原液的1966倍。 2.2 荧光定量PCR检测无关DNA含量多少对酚氯仿抽提效果的影响 图2 在抽提过程中添加无关DNA 25ng/ul、50ng/ul、100ng/ul、200ng/ul进行荧光定量PCR扩增效果图和数据结果:Unkn-1、2、3、4分别是40ul未知样品+160ul不同浓度的无关DNA，Unkn-5为不经过抽提直接荧光定量PCR结果 结果显示:在含有100ng/ul、200ng/ul无关DNA抽提效率明显高于50ng/ul无关DNA 抽提效果。 3.讨论 荧光定量PCR检测是DNA拷贝数的最敏感的技术，荧光定量PCR检测DNA拷贝数可反映准确的DNA数量，然而在传统老工艺酚氯仿抽提DNA的过程中DNA的损失很多，尤其是抽提微量的DNA。用DNA抽提试剂盒中依然存在这个问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 ，导致DNA拷贝数计算的不准确。在具体研究DNA含量的实验中具有十分重要作用。 参考文献 (1)海洋尾丝虫的DNA微量提取研究 陈子桂 蓉立 动物学报 47(6~8)，2001 (2)四种微量石蜡组织DNA提取方法比较 黄幼生 宋伟伟 罗志飞 专业好文档精心整理 欢迎下载