医学论文-小凹蛋白在清道夫受体AI介导的巨噬细胞源性泡沫细胞形成过程中的作用

医学论文-小凹蛋白在清道夫受体AI介导的巨噬细胞源性泡沫细胞形成过程中的作用 医学论文-小凹蛋白在清道夫受体AI介导的巨噬细胞源性泡 沫细胞形成过程中的作用 作者:王蓉蓉,朱炳阳,严鹏科,廖端芳 【关键词】 小凹;蛋白;清道夫受体AI;氧化性低密度脂蛋白;巨噬细胞;泡 沫细胞 Role of caveolin1 in SRAI mediated formation of foam cells derived from macrophages 【Abstract】 AIM: To investigate the role of caveolin1 in scavenger receptor ai (SRAI) mediated formation of macrophagederived foam cells induced by oxidized lowdensity lipoprotein (oxLDL). METHODS: RAW 264.7 macrophages were treated with 75 mg/L oxLDL for different hours. Next, macrophages were pretreated with SB202190 and SRAI antisense oligonucleotides before 75 mg/L oxLDL treatment for 24 h. Western blot analysis was used to detect protein expression. High performance liquid chromatography (HLPC) analysis was performed to determine the cellular cholesterol content. Oil red O staining was used to show the lipid droplets in foam cells. RESULTS: Western blot analysis showed that SRAI expression increased with 75 mg/L oxLDL treatment for 12, 24 and 48 h. 75 mg/L oxLDL treatment for 6, 12, 24, 48 and 96 h decreased the expression of caveolin1. When oxLDL treatment was over 24 h, descended expression of caveolin1 in macrophages was observed and lasted for 96 h. Pretreatment of SB202190 and SRAI antisense oligonucleotides decreased the expression of SRAI and increased the expression of caveolin1. Meanwhile, the cellular cholesterol content was also decreased (P<0.01 vs oxLDL treatment groups). Oil red O staining showed that the SB202190 pretreatment group and SRAI antisense oligonucleotides group formed less lipid droplets than oxLDL treatment group did. CONCLUSION: There appears a negative relationship between caveolin1 and SRAI during the accumulation of lipidladen foam cells. 【Keywords】 Caveolae; caveolin1; Scavenger receptor AI; Atherosclerosis; Oxidized lowdensity lipoprotein; cholesterol; macrophage 【摘要】 目的:研究小凹蛋白在清道夫受体AI介导的巨噬细胞源性泡沫细 胞形成过程中的作用. 方法:用75 mg/L氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)与巨噬细 胞共同孵育不同时间. 清道夫受体AI反义寡核苷酸、P38阻断剂SB202190预处 理巨噬细胞,然后给予75 mg/L oxLDL处理24 h. Western blot法检测清道夫 高效液相色谱法检测细胞内胆固醇的含量,油红O受体AI和小凹蛋白的 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达. 染色观察细胞内脂滴的形成情况. 结果:经75 mg/L oxLDL处理巨噬细胞不同时 间,oxLDL呈时间依赖性促进清道夫受体AI的表达,而呈时间依赖性抑制小凹 蛋白的表达. 用清道夫受体AI反义寡核苷酸抑制清道夫受体AI的表达,小凹蛋 白的表达明显增加. 该组细胞内胆固醇含量为:119?7: mg/g,与oxLDL处理组 比较显著减少:P<0.01),细胞内脂滴亦明显减少. P38MAPK抑制剂SB202190能 明显抑制清道夫受体AI的表达,而增加小凹蛋白的表达. SB202190处理组细胞内胆固醇含量为:173?14: mg/g,与oxLDL处理组比较显著减少:P<0.01:,细胞内脂滴亦明显减少. 结论:小凹蛋白与清道夫受体AI协同参与了oxLDL诱导的巨噬细胞泡沫化的形成过程. 【关键词】 小凹;蛋白;清道夫受体AI;氧化性低密度脂蛋白;巨噬细胞;泡沫细胞 0引言 泡沫细胞的形成是动脉粥样硬化发生发展的核心环节. 巨噬细胞和平滑肌细胞表面的清道夫受体AI:scavenger receptor AI, SRAI:能不断摄取修饰的脂蛋白,致使胆固醇及胆固醇酯在细胞内聚集,是泡沫细胞形成的重要机制之一,1,. 同时,氧化型低密度脂蛋白:oxLDL:损伤细胞的胆固醇自平衡机制,抑制胞内胆固醇流出,是泡沫细胞形成的另一重要机制,2,. 但细胞摄取胆固醇和胆固醇酯的同时,为什么会导致胆固醇流出障碍尚不清楚. 小凹:Caveolae:及小凹蛋白:caveolin1:是存在于细胞膜上的特异性内陷结构,在介导细胞内胆固醇的转运和流出、维持细胞内外胆固醇平衡过程中起着重要的作用,3-4,. 本研究我们探讨了小凹蛋白在SRAI介导的巨噬细胞源性泡沫细胞形成过程中的作用. 1 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 和方法 1.1材料小凹蛋白1抗体(sc2894,Sigma公司,美国)、 SRAI:2F8:抗体:Serotec公司, 英国:; P38阻断剂SB202190:Calbiochem公司,美国:. 其 他试剂均为国产分析纯. 鼠源单核细胞源性巨噬细胞RAW264.7细胞:中科院上海细胞生物所细胞中心:;蛋白电泳系统:美国Bio Rad公司:;80P7型超速离心机:日本Hitachi公司:; 高效液相色谱仪:美国惠普公司:; 自动凝胶成像系统:美国UVP公司:. 1.2方法 1.2.1RAW264.7细胞培养及分组用含100 mL/L小牛血清的DMEM培养液调细胞密度至1×107/L,24 h后换入1 mL/L小牛血清的DMEM培养液,处理前细胞静止24 h. 实验分为:空白对照组、oxLDL处理组、SRAI正义寡核甘酸处理组、SRAI反义寡核甘酸处理组及SB202190处理组. 1.2.2低密度脂蛋白的制备及修饰正常人血浆低密度脂蛋白采用序列超速离心法制备,5,. 所得天然低密度脂蛋白置于PBS溶液中,4?透析36 h;再放入含10 μmol/L CuSO4的PBS溶液:pH 7.2:,37?透析20 h进行氧化修饰. oxLDL置于100 μmol/L EDTA的PBS中,4?透析24 h,终止氧化. 1.2.3SRAI寡核苷酸的 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 和合成SRAI反义寡核苷酸:SRAI ASODN: 序列为:5′TACCTCGTCACCCTAGTGAAA3′. 为了排出SRAI ASOND可能的非特异性作用,设立了SRAI正义寡核苷酸:SRAI NSOND:对照序列. SRAI NSOND的序列为:5′ATGGAGCAGTGGGATCACTTT3′. 寡核苷酸均进行全硫代磷酸化修饰,由上海生工生物 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 公司合成. 使用时SRAI ASOND和SRAI NSOND的终浓度均为10 μmol/L. 1.2.4Western blot印迹法检测小凹蛋白及SRAI蛋白表达收集细胞, 4000 g离心,BCA试剂测定蛋白含量,用10 g/L SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,转膜, 封闭;按1?1000加入鼠抗人cavelin1一抗或按1?100加入鼠抗人SRAI:2F8:一抗,4?过夜;1?2000加入辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗,室温1 h;显影. 用Labworks图像分析系统对Western blot结果进行吸光度扫描并分析. 1.2.5油红O染色将细胞培养于预先放有无菌盖玻片的6孔培养板,处理结束后用PBS冲洗盖玻片3次,每次5 min,500 mL/L异丙醇固定1 min,油红O染色10 min,蒸馏水冲洗3次,每次1 min,苏木素染色5 min,分色和返蓝后,HPIAS1000型图像分析系统收集图像. 1.2.6细胞内胆固醇的检测待细胞处理结束后,PBS洗3遍,加入1 μmol/L NaOH 500 μL,反复冻融3次裂解细胞,蛋白定量后,7.2 g/L三氯乙酸沉淀蛋白,800 g离心10 min,留上清进行胆固醇检测. 以豆甾醇为内标并作 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 曲线,取100 μL上清液,加入8.9 mol/L KOH溶液200 μL,水解胆固醇酯后为细胞内总胆固醇样品. 各样品分别与内标样混匀,用正已烷和无水乙醇抽提后,1.5 mol/L的三氧化铬进行氧化衍生并真空干燥,100 μL乙晴异丙醇:80?20:溶解样品,上样于高效液相色谱仪. 采用C18柱,柱温4?,流速1 mL/min, 250 nm紫外光检测,胆固醇以峰面积定量,内标校准,以细胞蛋白中的含量mg/g为单位.统计学处理: 实验数据以x?s表示,由SPSS 13.0统计软件完成. 2结果 2.1oxLDL不同作用时间对SRAI及小凹蛋白表达的影响随着oxLDL 75 mg/L作用时间的延长,SRAI的表达呈时间依赖性递增,其峰值在24 h. 而oxLDL 75 mg/L抑制小凹蛋白的表达,处理时间越长,抑制作用越明显:图1:. 图1oxLDL作用不同时间对SRAI及小凹蛋白表达的影响:略: 2.2SRAI ASODN,P38阻断剂SB202190对SRAI及小凹蛋白表达的影响SRAI ASODN处理组的SRAI表达明显减少,小凹蛋白的表达则显著增加,与oxLDL处理组比较有显著性的统计学差异:图2:. p38阻断剂SB202190处理组SRAI表达减少,而Caveolin1表达相应增加:图2:. 2.3细胞内胆固醇含量的变化巨噬细胞经oxLDL 75 mg/L处理24 h后,胞内胆固醇含量显著增加,由:66?6: mg/g上升至:204?5: mg/g. 油红O染色可见细胞内大量脂滴形成. 经p38阻断剂SB202190和SRAI反义寡核苷酸预处理24 h,细胞内胆固醇含量分别为:173?14: mg/g和:119?7: mg/g,与oxLDL处理组比较均显著减少,细胞内脂滴明显减少:图3:. 而经SRAI正义寡核苷酸预处理24 h,再给予相同量的oxLDL处理后,细胞内的胆固醇含量与oxLDL处理组比较无统计学差异. 3讨论 SRAI参与动脉粥样硬化的发生、发展等各个阶段的病理改变. 高表达SRA的家族易患正常胆固醇血症黄瘤病,且家族成员体内的巨噬细胞易形成大的泡沫细胞,6,. 说明SRAI在泡沫细胞形成和动脉粥样硬化发展中有着重要的作用. oxLDL使巨噬细胞胆固醇含量明显增加,巨噬细胞上SRAI的表达递增,最终形成典型的泡沫细胞. 小凹是细胞膜上胆固醇储存和出入的重要部位.小凹蛋白是胆固醇流出的重要调节蛋白. 本实验结果显示oxLDL促进SRAI表达的同时明显抑制小凹蛋白的表达. 如果抑制SRAI的蛋白表达,小凹蛋白的表达则增加. 提 示在泡沫细胞的形成过程中,SRAI和小凹蛋白均参与了巨噬细胞泡沫化的形成过程. 图2,图3 略 小凹是细胞膜上对细胞外各种信号分子的识别、分隔、传导的一个中心区域. 小凹蛋白的氨基酸序列有一段高小凹蛋白对细胞内信号传导有负性调控作用. 度保守的骨架区域:Scaffolding domain, 82~101个氨基酸残基:,这一骨架区域使小凹蛋白像分子伴娘一样,结合细胞内重要的信号分子并使他们处于失活状态. 研究表明, oxLDL可通过细胞内MAPK信号通路途径调控SRAI的表达,7-8,. oxLDL激活酪氨酸蛋白激酶,活化蛋白激酶MAPK信号通路中的P38MAPK和JNK两条通路,刺激核内蛋白转录而促进SRAI mRNA的表达. Kifor等,9,报道,小凹蛋白是MAPK蛋白激酶活性及其信号通路的重要负性调节蛋白. 因此,小凹蛋白在一定程度下调控着SRAI的正常表达. 如果小凹蛋白被破坏,其对SRAI表达的负性调控作用就被取消. 我室前期工作亦表明,小凹蛋白在SRAI转基因小鼠体内表达下调,10,. 因此,在泡沫细胞的形成过程中,oxLDL不断的破坏小凹蛋白,使其负性调控作用减弱或取消,抑制SRAI的表达后,由于细胞经由SRAI摄取的oxLDL大大减少,则可见小凹蛋白的表达明显增加. P38 MAPK阻断剂SB201290预处理后,可见SRAI的表达明显减少,并伴随着小凹蛋白的表达明显上调. 提示:P38 MAPK途径参与了SRAI吞噬的oxLDL对小凹蛋白表达的抑制作用. 本研究结果表明,SRAI和小凹蛋白均参与了巨噬细胞泡沫化的形成过程, oxLDL不断地刺激巨噬细胞SRAI的表达,并伴随着小凹蛋白的表达下调,使细 胞胆固醇流出受阻并在细胞内聚集,促进泡沫细胞的形成. 提示小凹及小凹蛋白 的病理改变在动脉粥样硬化的发生发展中也扮演着重要的作用. 【参考文献】 1, VanEck M, DeWinther MP, Herijgers N, et al. Effect of human , Scavenger receptor Class A overexpression in bone marrowderived cells on cholesterol levels and atherosclerosis in ApoEdeficient mice ,J,. Arterioscler Thrombos Vasc Biol, 2000, 20:12:: 2600-2606. ,2, Herijgers N, DeWinther MP, VanEck M, et al. Effect of human Scavenger receptor class A overexpression in bone marrowderived cells on lipoprotein metabolism and atherosclerosis in low density lipoprotein receptor knockout mice ,J,. 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