产红霉素C的糖多孢红霉菌A226G-突变体的构建

产红霉素C的糖多孢红霉菌A226G-突变体的构建 作者:袁华,黄训端,张部昌,刘道琴,赵皓 单位:安徽大学生命科学学院，安徽省生态工程与生物技术重点实验室， 合肥230039 【摘要】 糖多孢红霉菌eryG基因编码产物为红霉素3"O(EryG)，失活eryG基因能阻断红霉素A的生物合成，积累其中间产物红霉素C。以糖多孢红霉菌A226基因组DNA为模版，用重叠PCR方法扩增出eryG基因两侧约1600bp DNA片段(ΔG)，其中去除了EryG上S 域对应的290bp DNA片段。将该片段克隆于质粒pWHM3，构建了同源重组质粒pWHMΔG。PEG介导原生质体转化法将pWHMΔG转入糖多孢红霉菌A226中，通过染色体同源重组突变染色体上eryG基因。利用薄层层析、PCR和质谱方法筛选出一株eryG基因突变的糖多孢红霉菌A226G-突变体，此突变体主要积累中间产物红霉素C而不再合成红霉素A。通过eryG基因的功能补偿，糖多孢红霉菌基因工程菌A226G-G+可以恢复红 霉素A的合成能力。 【关键词】 糖多孢红霉菌; 红霉素; 3"O 酶; 同源重组; 功能补偿 Construction of Saccharopolyspora erythraea A226G- mutant accumulating erythromycin C duan, Zhang Buchang, Liu Dao Yuan Hua, Huang Xun qin, Zhao Hao, Kong Xiaowei and Zhang Shuxiang (School of Life Sciences of Anhui University, Anhui Key Laboratory of Ecoengineering and Biotechnology, Hefei 230039) ABSTRACT Saccharopolyspora erythraea erythromycin 3" Omethyltransferase (EryG), encoded by the eryG gene, could play an important role in erythromycin biosynthesis, and the inactivation of eryG gene would lead to erythromycin C accumulation in the eryG mutant fermentation culture. Taking Sac. erythraea genomic DNA as a template, about 1,600bp DNA fragment with deletion of a 290bp fragment which contained Sadenosylmethionine binding domain in eryG gene was amplified by overlap PCR and cloned into the vector pWHM3 to construct homologous recombination plasmid pWHMΔG. It was then introduced into Sac. erythraea by PEGmediation, and two integrants (I and II) were selected. After integrant I had grown for three generations on R3M media without thiostrepton (Thio), they were protoplasted and plated on R3M media without Thio. One mutant, A226G-, was screened and identified by TLC, PCR and MS analyzes. The A226G- mutant accumulated erythromycin C instead of erythromycin A in the culture. By introducing eryG ge ne expression vector into A226G- mutant, erythromycin A production was restored, but the yield was somewhat lower than that of its parent strain A226. KEY WORDS Saccharopolyspora erythraea; Erythromycin; 3"Omethyltransferase; Homologous recombination; Function compensation 红霉素(erythromycin，Er)是由革兰阳性细菌糖多孢红霉菌 (Saccharopolyspora erythraea)合成的次生代谢产物，为一类 大环内酯类抗生素，包括红霉素A(ErA)、红霉素B(ErB)、红霉 素C(ErC)和红霉素D(ErD)等。这四种红霉素均有抑菌活性，但 在临床上抑菌活性最高，用途最广泛的是ErA,1，2,。 红霉素的生物合成分为两大部分:红霉素母核6 酯B(6dEB)的合成和6dEB的后修饰。前者由1分子丙酰 辅酶A和6分子甲基丙二酸单酰辅酶A在聚酮合成酶复合体(PKS)的催化作用下完成，其过程类似于饱和脂肪酸的合成反应;随后6dEB在红霉素C6位羟基化酶及在C3位和C5位羟基糖基化酶作用下形成了第一个有活性的中间产物ErD;ErD可以先在C12位羟基化酶EryK作用下形成ErC，再在3" OEryG作用下形成ErA，还可以通过另一条次要途径，即ErD先在EryG作用下形成ErB，再在EryK作用下形 1，2,。 成ErA, 红霉素生物合成的基因以单一拷贝、成簇形式存在于糖多孢红霉菌的环形染色体上，质粒不参与红霉素的生物合成,1，3,。 糖多孢红霉菌红霉素EryG是一种S(SAM)依赖性甲基化酶，在ErA生物合成过程中对中间产物ErC和ErD进行甲基化修饰，在降低红霉素的毒性和提高红霉素的活性方面起着重要的作用,1,4,。利用基因敲除技术阻断EryG编码基因(eryG)功能可以积累ErA生物合成的中间产物ErC。本研究构建了红霉素eryG基因失活的糖多孢红霉菌突变体A226G-，为进一步研究EryG与其底物(SAM、ErC和ErD)的定量关系以及EryG的其它相关酶学性质奠定了基础。 1 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 与方法 1.1 材料 (1)菌种和质粒 糖多孢红霉菌A226、大肠埃希菌ET12567,5,和同源重组质粒pWHM3,6,由中国医学科学院医药生物技术研 究所王以光教授惠赠;糖多孢红霉菌染色体整合型 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达载体pZMW,7,、大肠埃希菌DH5α,8,和克隆质粒pUC18为本室保存;质粒pUCΔG、pWHMΔG、糖多孢红霉菌突变体A226G-、质粒pZMWG和糖多孢红霉菌基因工程菌A226G-G+为本研究构建。 (2)培养基、缓冲液和试剂 LB培养基按Sambrook等,8,方法， ,TSB培养基按Hopwood等,9,方法，R3M培养基按Summers等,10方法，PEG3350T缓冲液和改进P缓冲液按Yamamoto等,11,方法配制。 硫链丝菌肽(thiostrepton，Thio)、安普霉素(apramycin，Am)和PEG3350为Sigma公司产品，溶菌酶为Fluka公司产品，蛋白酶K为Amresco公司产品，TSB为Difco公司产品，限制性内切酶、T4 DNA连接酶和DNA Marker(DL 2000和DL 15000)为大连宝生物公司产品，RNase A、dNTP、pfu和Taq DNA聚合酶为上海生工公司产品，质粒提取试剂盒和PCR产物回收试剂盒为道普生物科技(北京)有限公司产品，其它试剂为分析纯。 1.2 方法 (1)大肠埃希菌的培养、感受态细胞的制备、质粒酶切、连接、转化等按Sambrook等,8,方法或产品说明 书 关于书的成语关于读书的排比句社区图书漂流公约怎么写关于读书的小报汉书pdf 进行;质粒提取、PCR产物纯化按道普生物科技(北京)有限公司产品说明书进行。 (2)糖多孢红霉菌A226的培养和基因组DNA的提取按Hopwood等,9,方法进行。 (3)ΔG DNA片段重叠PCR引物的 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 为删除糖多孢红霉菌染色体上红霉素3"O 酶编码基因eryG中间部分290bp DNA序列(对应于GenBank登记号AM420293序列中的823972,824261nt)，在删除位点两侧各扩增一段同源片段。为了两同源片段间进行重叠PCR扩增，上游片段Fra1的反向引物和下游片段Fra2的正向引物完全互补，这样经重叠PCR扩增的DNA片段是不含有EryG SAM结合位点DNA ,。 的约1600bp ΔG DNA片段,16 上游片段Fra1引物: P11:5′accGAATTCtgtacaacctggcggtccggcacg(大写字母表示EcoRI识别位点); P12:5′ctccaccgggatgccgccggacagcggtcaggtcga cgccgacgatcctggcc。 下游片段Fra2引物: P21:5′ggccaggatcgtcggcgtcgacctgaccgctgtccg gcggcatcccggtggag; P22:5′gaAAGCTTgggcaccgccggcgagatcg(大写字母表示HindIII识别位点)。 (4)eryG基因PCR引物的设计是根据GenBank公布的糖多孢红霉菌红霉素eryG基因序列(GenBank登记号AM420293)，设计并合成了1对引物: 上游引物P1:5′cggCATATGagcgtgaagcaga agtcagc(大写字母表示NdeI识别位点); 下游引物P2:5′gtgAAGCTTGATATCtacgcg ccgggcttg(大写字母表示HindIII和EcoRV识别位点)。 (5)ΔG DNA片段和eryG基因片段的PCR扩增按文献,12,操作。 (6)糖多孢红霉菌A226原生质体的制备和转化按文献,13,操作。 (7)糖多孢红霉菌A226::pWHMΔG整合体I和II及糖多孢红霉菌A226G-突变体的筛选按文献,14,操作。 (8)糖多孢红霉菌A226::pWHMΔG整合体I和II及A226G-突变体发酵液中红霉素成分的薄层层析(TLC)分析按文献,4,操作。 (9)糖多孢红霉菌A226::pWHMΔG整合体I和II的PCR鉴定按文献,14,操作。 (10)糖多孢红霉菌A226G-突变体PCR鉴定的引物序列设计按1.2(4)节中设计的引物序列。 (11)糖多孢红霉菌A226G-突变体发酵液中红霉素成分的质谱(MS)分析按文献,14,操作。 2 结果与分析 2.1 同源重组质粒pWHMΔG的构建 以糖多孢红霉菌A226基因组DNA为模板，PCR先扩增出上游片段Fra1和下游片段Fra2，再以Fra1和Fra2为模版、P11和P22 为引物，用重叠PCR扩增出全长约1600bp的DNA片段ΔG，克隆到pUC18载体上构建质粒pUCΔG。序列分析表明，所克隆的ΔG DNA片段序列与GenBank公布的序列完全一致(290bp DNA片段已被删除，测序图略)。 pWHM3质粒,6,为穿梭型质粒，在糖多孢红霉菌中不能稳定存在，故可作为糖多孢红霉菌的同源重组质粒。pUCΔG质粒中外源DNA用EcoRI和HindIII酶切后连于pWHM3质粒相应酶切位点上，转化大肠埃希菌DH5α获得了pWHMΔG质粒(Fig.1)。 为避免糖多孢红霉菌对外源基因的限制性作用(甲基DNA限制),15,，将pWHMΔG质粒转化大肠埃希菌ET12567， 得到了无甲基化修饰的pWHMΔG质Identification of pWHMΔG cut by EcoRI/HindIII粒。 2.2 糖多孢红霉菌A226::pWHMΔG整合体I和II的筛选 将糖多孢红霉菌A226制成原生质体，用pWHMΔG质粒转化，在含30μg/ml Thio的R3M固体培养基上进行筛选。因pWHMΔG质粒在糖多孢红霉菌中不能复制，只有整合到染色体上才能赋予菌体稳定的Thio抗性。从转化平皿中挑取110个单菌落涂含30μg/ml Thio的R3M斜面，有2个菌落可正常生长，分别命名为A226::pWHMΔG整合体I和II。提取整合体I和II基因组DNA做模板，分别以质粒pWHMΔG和出发菌株A226基因组作为阳性和阴性对照，PCR扩增pWHMΔG 质粒上Thio抗性基因tsr进行鉴定。1.2%琼脂糖凝胶电泳结果显示，整合体I和II的PCR产物与阳性对照一样，大小位于768bp附近，与预期相符，而阴性对照并无此条带(Fig.2)，表明pWHMΔG质粒已整合到A226的染色体上。 糖多孢红霉菌红霉素生物合成基因在染色体上以单一拷贝、成簇形式存在，其中eryAI、eryAII、eryAIII、eryCII、eryCIII、eryBII和eryG为一条多顺反子，共同受到eryAI启动子的控制,1,。若pWHMΔG质粒与A226染色体在同源片段Fra1内发生同源重组，那么eryG基因的表达将会受到抑制，整合体发酵液就会积累ErA生物合成的中间产物ErC;若在同源片段Fra2内发生同源重组，那么eryG基因的表达将不会受到影响，整合体仍然可以合成ErA。 为了确定pWHMΔG质粒的整合位置，提取整合体I和II发酵液中的红霉素进行薄层层析(TLC)，TLC结果显示整合体I是在同源片段Fra1内发生同源重组的， 而整合体II是在同源片段Fra2内发生同源重组的(Fig.3)。 2.3 糖多孢红霉菌A226G-突变体的筛选 同源重组质粒pWHMΔG在染色体上不稳定，在无抗生素选择压力时会自发发生染色体内二次重组而脱落。若第二次重组与第一次重组发生在同一同源片段内，质粒脱落后染色体会回复到质粒整合前状态，菌株恢复ErA合成能力;若第二次重组与第一次重组发生在不同的同源片段内，质粒脱落后eryG基因DNA序 列会发生删除突变，突变株将失去ErA合成能力，发酵液中会有ErC的积累。 糖多孢红霉菌A226::pWHMΔG整合体I在无Thio的R3M斜面上连续生长三代后，将制得的原生质体不同浓度稀释液涂无Thio的R3M平皿。从平皿中挑取约1000个单菌落，各连续涂含30μg/ml Thio的R3M斜面和无Thio的R3M斜面，其中有5个菌落仅可以在无Thio的R3M斜面上生长，表明这5个克隆中同源重组质粒pWHMΔG已从A226染色体上脱落下来。提取这5个克隆的红霉素做TLC，结果显示只有4号克隆仅可以积累ErC，此克隆被命名为A226G-(Fig.4)。其余4个克隆都为回复突变，即恢复了ErA的合成能力。 将A226G-突变体进行液体培养，提取基因组DNA，以eryG基因上游引物P1和下游引物P2进行PCR扩增，A226G-突变体PCR产物的条带明显地比A226的要小(Fig.5)。对A226G-突变体的PCR产物直接进行序列分析也表明此突变株eryG基因中间部分预期的290bp DNA片段已被删除(测序图略)。 2.4 糖多孢红霉菌A226G-突变体发酵产物的质谱(MS)鉴定经乙酸乙酯萃取和水浴浓缩后用质谱(MS)方法 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 发酵产物中红霉素成分。MS仅检测到了ErC的质谱峰(Fig.6):720.17m/z为,ErC,H+，702.17m/z为,ErCH2O,H+。在发酵液中也没有检测到上一步中间产物ErD，说明糖多孢红霉菌红霉素C12位羟基化酶EryK可以完全地把ErD转化成产物ErC。 2.5 A226G-突变体中eryG基因的功能补偿 (1)糖多孢红霉菌表达质粒pZMWG的构建 以糖多孢红霉菌A226总DNA为模板，以P1和P2为引物PCR扩增出eryG基因，克隆到pUC18载体上构建了质粒pUCG。序列分析表明，所克隆的eryG片段序列与GenBank公布的序列完全一致(测序图略)。 将pUCG中的eryG DNA片段亚克隆至糖多孢红霉菌表达载体pZMW中，构建了质粒pZMWG。NdeI和EcoRV酶切pZMWG质粒后获得预期大小的两个片段(Fig.7)。 (2)互补试验 将糖多孢红霉菌突变体A226G-制成原生质体，用pZMWG质粒转化，在含125μg/ml Am的R3M固体培养基上进行筛选。从转化平皿中挑取6个单菌落涂含125μg/ml Am的R3M斜面，这6个克隆均可正常生长， 命名为A226G-G+ I、II、III、IV、V和VI。接种A226G-G+ I和A226于100ml TSB培养基/500ml三角烧瓶中，30?振荡培养120h，提取发酵产物红霉素，TLC结果显示A226G-G+ I恢复了ErA的生产能力(Fig.8)。 3 讨论 基因敲除技术是20世纪80年代末发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术，因此基因敲除技术在特定基因功能的研究中显示出越来越重要的地位。通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，达到基因敲除、失活的目的。 1991年Haydock等,16,对糖多孢红霉菌红霉素3"O 编码基因eryG进行了测序，并通过比对EryG和其它几种甲基转移酶的氨基酸序列发现，eryG开放阅读框(ORF)由921对核苷酸组成，编码产物EryG有306个氨基酸;大多数甲基转移酶的氨基末端都有一个富含甘氨酸(Gly)的SAM结合位点 ,。本研究发现，在A226G-基序，保守区序列为VLE/DXGXGXG,16 发酵液中未检测到任何ErA的特征性质谱峰，说明A226G-突变体中的eryG基因已彻底失活，其编码产物EryG不再具有甲基转移酶活性。 Reeves等,17,通过S1核酸酶保护实验预测红霉素eryG基因可能有单独的启动子，但迄今为止并没有有力的文献证实。在本研究中，整合体I红霉素发酵液乙酸乙酯提取物经TLC分析仍可见到少量的ErA斑点(Fig.3)，MS分析也表明发酵液中既有ErC又有ErA(图谱略)，说明即使是在同源片段Fra1内发生同源重组也没有完全阻断eryG基因的表达。糖多孢红霉菌A226G-突变体发酵液中只有ErC的积累，所以综合这两点可以说明eryG基因确实有单独的启动子。 糖多孢红霉菌表达质粒pZMWG能够恢复A226G-突变体ErA的合成能力，但通过TLC和红霉素敏感菌枯草芽孢杆菌PUB110(Bacillus subtilis PUB110)抑菌试验进一步分析发现，基因工程菌A226G-G+中ErA的产量比野生菌A226的产量低，原因推测有如下三条:?质粒pZMWG整合到染色体上某一位置可能 会影响红霉素基因簇的转录。有文献报道,18,糖多孢红霉菌染色体上至少有7个ΦC31 attB类似位点(attBlike locations)可与pZMWG质粒中的ΦC31 attB位点发生位点特异性重组，但是这些attB类似位点无一含有较好的一致序列。所以pZMWG质粒经位点特异性重组整合到染色体上某一ΦC31 attB类似位点或者经同源重组整合到eryG位点上可能会影响红霉素基因簇的整体转录水平;?质粒pZMWG中eryG基因所用的启动子与红霉素基因簇中基因的启动子争夺RNA聚合酶全酶(即其中的sigma factor)和/或调控蛋白因子。本实验室构建的表达载体pZMW,7,中表达外源基因的启动子，为红霉素抗性基因ermE启动子的一部分片段，此片段恰巧含有ermEP1、P2和eryCIP1、P2，所以这些调控序列可能会与红霉素基因簇中的启动子等调控序列争夺共用的调节因子;?micRNA(mRNA interfering complementary RNA)，红霉素基因簇中ORF5推测为硫酯酶基因，ORF5插入失活导致红霉素产量严重降低,17,，由于ORF5与红霉素eryG基因3′端有24nt重叠，所以基因工程菌体内过多的eryG mRNA 3′端降解片段可能会干扰ORF5的表达。 巨大霉素,19，20,和红霉素A的生物合成有着共同的中间产物红霉素C，所以本研究构建的eryG基因失活的糖多孢红霉菌A226G-突变体，不但为进一步深入研究EryG相关的酶学性质奠定了基础，而且也为研究巨大霉素生物合成中红霉素C相关的修 饰酶提供了一个研究系统。 【参考文献】 ,1, 张昌，赵志虎，马清钧. 红霉素生物合成的分子生物学,J,. 生物技术通讯，2001，12(2):151,160.

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