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【讨论】胶体金免疫层析技术论坛 医学资料【讨论】胶体金免疫层析技术论坛 现在BioDot的价格有没有下调呀,很感兴趣，但太贵了 现在有个型号是ZX1000价格还可以,XYZ系列的还是老样子. IVD是威海的吗?WXW 为什么我自己组装的试条跑样品时,总感觉跑的比较慢,而买的别人的产品跑样品的速度很快,是不是他们的纤维素滤膜加了什么特殊的东西啊?烦请大家能给我指点一下迷津,谢谢! 测一下爬速度,方法秒 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 测时.与正常产品比较. 可能原因: 1.主观感觉 2.使用的膜型号爬速差异 3.在使用同一型号情况下,看是否是膜表面经过处理,方法将对比产品的膜调换到你的产品中. 以上比较应以测试数值为 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 . 免疫胶体金技术(Immune colloidal gold technique) (一) 原理 免疫胶体金技术是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术。胶体金是由氯金酸(HAuCl4)在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，称为胶体金。胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。 胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其它生物大分子结合，如SPA、PHA、ConA等。根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。 (二) 胶体金的制备 根据不同的还原剂可以制备大小不同的胶体金颗粒。常用来制备胶体金颗粒的方法如下。 1(枸橼酸三钠还原法 (1)10nm胶体金粒的制备:取0.01,HAuCl4水溶液100ml，加入1,枸橼酸三钠水溶液3ml，加热煮沸30min，冷却至4?，溶液呈红色。 (2)15nm胶体金颗粒的制备:取0.01,HAuCl4水溶液100ml，加入1,枸橼酸三钠水溶液2ml，加热煮沸15min,30min，直至颜色变红。冷却后加入0.1Mol/L K2CO30.5ml，混匀即可。 (3)15nm、18nm,20nm、30nm或50nm胶体金颗粒的制备:取0.01,HAuCl4水溶液100ml，加热煮沸。根据需要迅速加入1,枸橼酸三钠水溶液4ml、2.5ml、1ml或0.75ml，继续煮沸约5min，出现橙红色。这样制成的胶体金颗粒则分别为15nm、18,20nm、30nm和50nm。 2(鞣酸-枸橼酸钠还原法 A液:1,HAuCl4水溶液1ml加入79ml双馏水中混匀。 B液:1,枸橼酸三钠4ml，1,鞣酸0.7ml，0.1Mol/L K2CO3液0.2ml，混合，加入双馏水至20ml。 将A液、B液分别加热至60?，在电磁搅拌下迅速将B液加入A液中，溶液变蓝，继续加热搅拌至溶液变成亮红色。此法制得的金颗粒的直径为5nm。如需要制备其它直径的金颗粒，则按表15-1所列的数字调整鞣酸及K2CO3的用量。 表15-1鞣酸-枸橼酸钠还原法试剂配制表 金粒直径(nm) A液 B液 1,HAuCl4 双馏水 1,枸橼酸三钠 0.1Mol/L K2CO3 1,鞣酸 双馏水 5 1 79 4 0.20 0.70 15.10 10 1 79 4 0.025 0.10 15.875 15 1 79 4 0.0025 0.01 15.9875 3(制备高质量胶体金的注意事项 (1)玻璃器皿必须彻底清洗，最好是经过硅化处理的玻璃器皿，或用第一次配制的胶体金稳定的玻璃器皿，再用双馏水冲洗后使用。否则影响生物大分子与金颗粒结合和活化后金颗粒的稳定性，不能获得预期大小的金颗粒。 (2)试剂配制必须保持严格的纯净，所有试剂都必须使用双馏水或三馏水并去离子后配制，或者在临用前将配好的试剂经超滤或微孔滤膜(0.45µm)过滤，以除去其中的聚合物和其它可能混入的杂质。 (3)配制胶体金溶液的pH以中性(pH7.2)较好。 (4)氯金酸的质量要求上乘，杂质少。最好是进口的。 (5)氯金酸配成1,水溶液在4?可保持数月稳定，由于氯金酸易潮解，因此在配制时，最好将整个小包装一次性溶解。 (三) 胶体金标记蛋白的制备 胶体金对蛋白的吸附主要取决于pH值，在接近蛋白质的等电点或偏碱的条件下，二者容易形成牢固的结合物。如果胶体金的pH值低于蛋白质的等电点时，则会聚集而失去结合能力。除此以外胶体金颗粒的大小、离子强度、蛋白质的分子量等都影响胶体金与蛋白质的结合。 1(待标记蛋白溶液的制备 将待标记蛋白预先对0.005Mol/L pH7.0 NaCl溶液中4?透析过夜，以除去多余的盐离子，然后100 000g4?离心1h，去除聚合物。 2(待标胶体金溶液的准备 以0.1Mol/L K2CO3或0.1Mol/L HCl调胶体金液的pH值。标记IgG时，调至9.0;标记McAb时,调至8.2;标记亲和层析抗体时，调至7.6;标记SPA时，调至5.9,6.2;标记ConA时，调至8.0;标记亲和素时，调至9,10。 由于胶体金溶液可能损坏pH计的电板，因此，在调节pH时，采用精密pH试纸测定为宜。 3(胶体金与标记蛋白用量之比的确定 (1)根据待标记蛋白的要求，将胶体金调好pH之后，分装10管，每管1ml。 (2)将标记蛋白(以IgG为例)以0.005Mol/L pH9.0硼酸盐缓冲液做系列稀释为5µg/ml,50µg/ml，分别取1ml，加入上列金胶溶液中，混匀。对照管只加1ml稀释液。 (3)5min后，在上述各管中加入0.1ml 10,NaCl溶液，混匀后静置2h，观察结果。 (4)结果观察，对照管(未加蛋白质)和加入蛋白质的量不足以稳定胶体金的各管，均呈现出由红变蓝的聚沉现象;而加入蛋白量达到或超过最低稳定量的各管仍保持红色不变。以稳定1ml胶体金溶液红色不变的最低蛋白质用量，即为该标记蛋白质的最低用量，在实际工作中，可适当增加10,,20,。 4(胶体金与蛋白质(IgG)的结合 将胶体金和IgG溶液分别以0.1Mol/L K2CO3调pH至9.0，电磁搅拌IgG溶液，加入胶体金溶液，继续搅拌10min，加入一定量的稳定剂以防止抗体蛋白与胶体金聚合发生沉淀。常用稳定剂是5,胎牛血清(BSA)和1,聚乙二醇(分子量20KD)。加入的量:5,BSA使溶液终浓度为1,;1,聚乙二醇加至总溶液的1,10。 5(胶体金标记蛋白的纯化 (1)超速离心法:根据胶体金颗粒的大小，标记蛋白的种类及稳定剂的不同选用不同的离心速度和离心时间。 用BSA做稳定剂的胶体金-羊抗兔IgG结合物可先低速离心(20nm金胶粒用1 200r/min，5nm金胶粒用1 800r/min)20min，弃去凝聚的沉淀。然后将5nm胶体金结合物用6 000g，4?离心1h;20nm,40nm胶体金结合物，14 000g，4?离心1h。仔细吸出上清，沉淀物用含1,BSA的PB液(含0.02,NaN3)，将沉淀重悬为原体积的1,10，4?保存。如在结合物内加50,甘油可贮存于-18?保存一年以上。 为了得到颗粒均一的免疫金试剂，可将上述初步纯化的结合物再进一步用10,,30,蔗糖或甘油进行密度梯度离心,分带收集不同梯度的胶体金与蛋白的结合物。 (2)凝胶过滤法:此法只适用于以BSA作稳定剂的胶体金蛋白结合物的纯化。将胶体金蛋白结合物装入透析袋，在硅胶中脱水浓缩至原体积的1,5,1,10。再经1 500r/min离心20min。取上清加至Sephacryl S-400(丙烯葡聚糖凝胶S-400)层析柱分别纯化。层析柱为0.8 cm×20cm，加样量为床体积的1,10，以0.02Mol/L PBS液洗脱(内含0.1,BSA，0.05,NaN3，pH8.2者用IgG标记物)，流速为8ml/h。按红色深浅分管收集洗脱液。一般先滤出的液体为微黄色，有时略混浊，内含大颗粒聚合物等杂质。继之为纯化的胶体金蛋白结合物，随浓度的增加而红色逐渐加深，清亮透明，最后洗脱出略带黄色的为标记的蛋白组分。将纯化的胶体金蛋白结合物过滤除菌、分装,4?保存。最终可得到70,,80,的产量。 6(胶体金蛋白结合物的质量鉴定 (1)胶体金颗粒平均直径的测量:用支持膜的镍网(铜网也可)蘸取金标蛋白试剂，自然干燥后直接在透射电镜下观察。或用醋酸铀复染后观察。计算100个金颗粒的平均直径。 (2)胶体金溶液的OD520nm值测定:胶体金颗粒在波长510nm,550nm之间出现最大吸收值峰。用0.02Mol/L pH8.2 PBS液(含1,BSA，0.02,NaN3)将胶体金蛋白试剂作1:20稀释，OD520,0.25左右。一般应用液的OD520应为0.2,0.4。 (3)金标记蛋白的特异性与敏感性测定:采用微孔滤膜免疫金银染色法(MF,IGSSA)。将可溶性抗原(或抗体)吸附于载体上(滤纸、硝酸纤维膜、微孔滤膜)，用胶体金标记的抗体(或抗原)以直接或间接染色法并经银显影来 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 相应的抗原或抗体，对金标记蛋白的特异性和敏感性进行鉴定。 (四) 胶体金标记技术在免疫学中的应用 胶体金标记技术由于标记物的制备简便，方法敏感、特异，不需要使用放射性同位素，或有潜在致癌物质的酶显色底物，也不要荧光显微镜，它的应用范围广，除应用于光镜或电镜的免疫组化法外，更广泛地应用于各种液相免疫测定和固相免疫分析以及流式细胞术等。 1(液相免疫测定:将胶体金与抗体结合，建立微量凝集试验检测相应的抗原，如间接血凝一样，用肉眼可直接观察到凝集颗粒。利用免疫学反应时金颗粒凝聚导致颜色减退的原理，建立均相溶胶颗粒免疫测定法(Sol particle immunoassay ,SPIA)已成功地应用于PCG的检测，直接应用分光光度计进行定量分析。 2(金标记流式细胞术:胶体金可以明显改变红色激光的散射角，利用胶体金标记的羊抗鼠Ig抗体应用于流式细胞术，分析不同类型细胞的表面抗原，结果胶体金标记的细胞在波长632nm时，90度散射角可放大10倍以上，同时不影响细胞活性。而且与荧光素共同标记，彼此互不干扰。 3(胶体金固相免疫测定法 (1)斑点免疫金银染色法(Dot,IGS,IGSS)是将斑点ELISA与免疫胶体金结合起来的一种 方法。将蛋白质抗原直接点样在硝酸纤维膜上，与特异性抗体反应后，再滴加胶体金标记的第二抗体，结果在抗原抗体反应处发生金颗粒聚集，形成肉眼可见的红色斑点，此称为斑点免疫金染色法(Dot,IGS)。此反应可通过银显影液增强，即斑点金银染色法(Dot,IGS,IGSS)。 (2)斑点金免疫渗滤测定法(dot immuno,gold filtration assay,DIGFA)此法原理完全同斑点免疫金染色法，只是在硝酸纤维膜下垫有吸水性强的垫料，即为渗滤装置。在加抗原(抗体)后，迅速加抗体(抗原)，再加金标记第二抗体，由于有渗滤装置，反应很快，在数分钟内即可显出颜色反应。此方法已成功地应用于人的免疫缺陷病病毒(HIV)的检查和人血清中甲胎蛋白的检测。 单克隆抗体技术 抗原提纯与动物免疫 对抗原的要求是纯度越高越好，尤其是初次免疫所用的抗原。如为细胞抗原，可取1×107个细胞作腹腔免疫。可溶性抗原需加完全福氏佐剂并经充分乳化，如为聚丙烯酰胺电泳纯化的抗原，可将抗原所在的电泳条带切下，研磨后直接用以动物免疫。 选择与所用骨髓瘤细胞同源的BALB/c健康小鼠，鼠龄在8,12周，雌雄不限。为避免小鼠反应而不佳或免疫过程中死亡，可同时免疫3,4只小鼠。 免疫过程和方法与多克隆抗血清制备基本相同，因动物、抗原形式、免疫途径不同而异，以获得高效价抗体为最终目的。免疫间隔一般2,3周。一般被免疫动物的血清抗体效价越高，融合后细胞产生高效价特异抗体的可能性越大，而且单克隆抗体的质量(如抗体的浓度和亲和力)也与免疫过程中小鼠血清抗体的效价和亲和力密切相关。末次免疫后3,4天，分离脾细胞融合。 骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备 选择瘤细胞株的最重要的一点是与待融合的B细胞同源。如待融合的是脾细胞，各种骨髓瘤细胞株均可应用，但应用最多的是Sp2/0细胞株。该细胞株生长及融合效率均佳，此外，该细胞株本身不分泌任何免疫球蛋白重链或轻链。细胞的最高生长刻度为9×105/ml，倍增时间通常为10,15h。融合细胞应选择处于对数生长期、细胞形态和活性佳的细胞(活性应大于95,)。骨髓瘤细胞株在融合前应先用含8-氮鸟嘌呤的培养基作适应培养，在细胞融合的前一天用新鲜培养基调细胞浓度为2105/ml，次日一般即为对数生长期细胞。 在体外培养条件下，细胞的生长依赖适当的细胞密度，因而，在培养融合细胞或细胞克隆化培养时，还需加入其他饲养细胞(feedercell)。常用的饲养细胞为小鼠的腹腔细胞，制备方法为用冷冻果糖液注入小鼠腹腔，轻揉腹部数次，吸出后的液体中即含小鼠腹腔细胞，其中在巨噬细胞和其他细胞。亦有用小鼠的脾细胞、大鼠或豚鼠的腹腔细胞作为饲养细胞的。 在制备饲养细胞时，切忌针头刺破动物的消化器官，否则所获细胞会有严重污染。饲养细胞调至1×105/ml，提前一天或当天置板孔中培养。 细胞融合 细胞融合是杂交瘤技术的中心环节，基本步骤是将两种细胞混合后加入PEG使细胞彼此融合。其后吧培养液稀释PEG，消除PEG的作用。将融合后的细胞适当稀释，分置培养板孔中培养。融合过程中有几个问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 应特别注意。?细胞比例:骨髓瘤细胞与脾细胞的比值可从1:2到1:10不等，常用1:4的比例。应保证两种细胞在融合前都具有较高活性。?反应时间:在两种细胞的混合细胞悬液中，第1min滴加4.5ml培养液;间隔2min滴加5ml培养液，尔后加培养液50ml。?培养液的成分:对融合细胞，良好的培养液尤其重要，其中的小牛血清、各种离子和营养成分均需严格配制。如融合效率降低，应随时核查培养基情况。 有限稀释法 筛选阳性株一般选用的骨髓瘤细胞为HAT敏感细胞株，所以只有融合的细胞才能待续存 活一周以上。融合细胞呈克隆生长，经有限稀释后(一般稀释至0.8个细胞/孔)，按Poisson法计算，应有36,的孔为1个细胞/孔。细胞培养至覆盖0,,20,孔底时，吸取培养上清用ELISA检测抗体含量。首先依抗体的分泌情况筛选出高抗体分泌孔，将孔中细胞再行克隆化，尔后进行抗原特异的ELISA测定，选高分泌特异性细胞株扩大培养或冻存。 单克隆抗体的制备和冻存 筛选出的阳性细胞株应及早进行抗体制备，因为融合细胞随培养时间延长，发生污染、染包体丢失和细胞死亡的机率增加。抗体制备有两种方法。一是增量培养法，即将杂交瘤细胞在体外培养，在培养液中分离单克隆抗体。该法需用特殊的仪器设备，一般应用无血清培养基，以利于单克隆抗体的浓缩和纯化。最普遍采用的是小鼠腹腔接种法。选用BALB/c小鼠或其亲代小鼠，先用降植烷或液体石蜡行小鼠腹腔注射，一周后将杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中去。通常在接种一周后即有明显的腹水产生，每只小鼠可收集5,10ml的腹水，有时甚至超过40ml。该法制备的腹水抗体含量高，每毫升可达数毫克甚至数十毫克水平。此外，腹水中的杂蛋白也较少，便于抗体的纯化。接种细胞的数量应适当，一般为5×105/鼠，可根据腹水生长情况适当增减。 选出的阳性细胞株应及早冻存。冻存的温度越低越好，冻存于液氮的细胞株活性仅有轻微的降低，而冻存在,70?冰箱则活性改变较快。细胞不同于菌种，冻存过程中需格外小心。二甲亚砜(DMSO)是普遍应用的冻存保护剂。冻存细胞复苏后的活性多在50,,95,之间。如果低于50,，则说明冻存复苏过程有问题。 单克隆抗体的纯化 单克隆抗体的纯化方法同多克隆抗体的纯化，腹水特异性抗体的浓度较抗血清中的多克隆抗体高，纯化效果好。按所要求的纯度不同采用相应的纯化方法。一般采用盐析、凝胶过滤和离子交换层析等步骤达到纯化目的，也有采用较简单的酸沉淀方法。目前最有效的单克隆抗体纯化方法为亲和纯化法，多用葡萄球菌A蛋白或抗小鼠球蛋白抗体与载体(最常用Sepharose)交联，制备亲和层析柱将抗体结合后洗脱，回收率可达90,以上。蛋白可与IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3结合，同时还结合少量的IgM。洗脱液中的抗体浓度可用紫外光吸收法粗测，小鼠IgG单克隆抗体溶液在A280nm时，1.44(吸光单位)相当于1mg/ml。经低pH洗脱后在收集管内预置中和液或速加中和液对保持纯化抗体的活性至关重要。 胶金抗体原料是关键，现在多用单抗，所以以后也想陆续发点觉得还可以的东西上来，大家都想扩大制造规模，上游就是关键。 关于胶金条结果分析 有很多战友和我谈到过这个问题，一般来说人眼判读是肯定有比较大的差异的，尤其是在CUT OFF附近。 我的解决办法有两种: 1.用机器。参考IVD杂志上的论文 Image analysis for rapid-flow diagnostics > (有给自己做广告的嫌疑，不过确实很好用，尤其是在出研究报告和成果分析的时候图问并茂，很有说服力) 2.用比色色卡。自制一个简易比色卡片(类似PH试纸东西)，我早期用过这个东西可以粗量校正，当然还是要靠人眼，但能更准确许多。 好久都没来了，现在好像人气不太旺啊～ 请教大家两个问题:你们做试条用的NC膜是进口的还是国产的啊,如果大规模生产把各个组件粘到PVC板条上是用的双面胶还是其他的胶啊, TomBacon 看到你传得东西很有用啊，支持一下～ mstang79: NC膜都的进口的。这个是除抗原抗体外占成本最高的部分。品牌主要有四个S&S,Millipore,Whatman,startoruis,另外还有一种印度膜(很差)建议不要用。whatman又有两种其中有种叫,,膜的价格便宜但质量差。S&S和whatman膜制造部分近期合并了，成了世界第一大膜制造公司。 ,,,板上是有涂胶的成品。 mz0306: 开学了啊，呵呵。还顺利吗, 你的待测抗原和,线溶液能够建立换算关系吗，这样可能可以加快你的研究。直接上相关浓度就好了。 请问，大家是如何将标记好的胶体金点到玻璃纤维膜上的呢，是用仪器还是用什么办法 谢谢这位老师!! 真是太有用了!!! 同时也感谢为我们提供这么好的平台服务 gywmail : 请问，大家是如何将标记好的胶体金点到玻璃纤维膜上的呢，是用仪器还是用什么办法 现在将胶体金处理到玻璃纤维上有两种办法， 1.喷金，用仪器BIODOT平台上的AIRJET喷头喷点，动力是气压。优点是可定量，喷点均匀，表现在释放时金呈均匀浪涌状一次冲过膜。缺点是需要单独购置喷头和配好气源。 2.浸泡，用金溶液浸泡玻璃纤维。优点是简单易行。缺点为:1) 不均匀 批内差大，例如:第一次浸泡时和最后一次浸泡时溶液浓度发生很大变化，结果造成前后处理时单位玻璃纤维上金浓度有差异。2)玻璃纤维上出现边缘效应。表象为四周边缘在干燥后出现色深沉积，跑板时有两次或多次金浪涌，影响灵敏度。 谢谢! 请问怎么才能烧出450nm的金胶溶液,急呀～ 450nm的金胶溶液应该不稳定吧??? 会沉积的，太大了 真是太好了～找了好久终于找到了，谢谢了 你在样品垫里加吐温就可以了 代理一家中外合资企业最近研发的NC膜，专用于生产诊断试剂，孔径在8μ、0.4μ ，完全可以适用于诊断试条的开发、生产，价格优惠，欢迎索取样品试用。有意者请留下联系电话或E-mail，或者直接与本人E-mail联系(zhenglh9@hotmail.com)，请一并留下联系人和公司名称。 难得啊～终于看到你丢了个垃圾上来了。 虽然写得很具体，但是这篇文章还真的没有什么用处的说 TomBacon wrote: 转，这个看了一下还可以的，发上来共享。 免疫胶体金技术(Immune colloidal gold technique) (一) 原理 免疫胶体金技术是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术。胶体金是由氯金酸(HAuCl4)在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，称为胶体金。胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。 胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其它生物大分子结合，如SPA、PHA、ConA等。根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。 (二) 胶体金的制备 根据不同的还原剂可以制备大小不同的胶体金颗粒。常用来制备胶体金颗粒的方法如下。 1(枸橼酸三钠还原法 (1)10nm胶体金粒的制备:取0.01,HAuCl4水溶液100ml，加入1,枸橼酸三钠水溶液3ml，加热煮沸30min，冷却至4?，溶液呈红色。 (2)15nm胶体金颗粒的制备:取0.01,HAuCl4水溶液100ml，加入1,枸橼酸三钠水溶液2ml，加热煮沸15min,30min，直至颜色变红。冷却后加入0.1Mol/L K2CO30.5ml，混匀即可。 (3)15nm、18nm,20nm、30nm或50nm胶体金颗粒的制备:取0.01,HAuCl4水溶液100ml，加热煮沸。根据需要迅速加入1,枸橼酸三钠水溶液4ml、2.5ml、1ml或0.75ml，继续煮沸约5min，出现橙红色。这样制成的胶体金颗粒则分别为15nm、18,20nm、30nm和50nm。 2(鞣酸-枸橼酸钠还原法 A液:1,HAuCl4水溶液1ml加入79ml双馏水中混匀。 B液:1,枸橼酸三钠4ml，1,鞣酸0.7ml，0.1Mol/L K2CO3液0.2ml，混合，加入双馏水至20ml。 将A液、B液分别加热至60?，在电磁搅拌下迅速将B液加入A液中，溶液变蓝，继续加热搅拌至溶液变成亮红色。此法制得的金颗粒的直径为5nm。如需要制备其它直径的金颗粒，则按表15-1所列的数字调整鞣酸及K2CO3的用量。 表15-1鞣酸-枸橼酸钠还原法试剂配制表 金粒直径(nm) A液 B液 1,HAuCl4 双馏水 1,枸橼酸三钠 0.1Mol/L K2CO3 1,鞣酸 双馏水 5 1 79 4 0.20 0.70 15.10 10 1 79 4 0.025 0.10 15.875 15 1 79 4 0.0025 0.01 15.9875 3(制备高质量胶体金的注意事项 (1)玻璃器皿必须彻底清洗，最好是经过硅化处理的玻璃器皿，或用第一次配制的胶体金稳定的玻璃器皿，再用双馏水冲洗后使用。否则影响生物大分子与金颗粒结合和活化后金颗粒的稳定性，不能获得预期大小的金颗粒。 (2)试剂配制必须保持严格的纯净，所有试剂都必须使用双馏水或三馏水并去离子后配制，或者在临用前将配好的试剂经超滤或微孔滤膜(0.45µm)过滤，以除去其中的聚合物和其它可能混入的杂质。 (3)配制胶体金溶液的pH以中性(pH7.2)较好。 (4)氯金酸的质量要求上乘，杂质少。最好是进口的。 (5)氯金酸配成1,水溶液在4?可保持数月稳定，由于氯金酸易潮解，因此在配制时，最好将整个小包装一次性溶解。 (三) 胶体金标记蛋白的制备 胶体金对蛋白的吸附主要取决于pH值，在接近蛋白质的等电点或偏碱的条件下，二者容易形成牢固的结合物。如果胶体金的pH值低于蛋白质的等电点时，则会聚集而失去结合能力。除此以外胶体金颗粒的大小、离子强度、蛋白质的分子量等都影响胶体金与蛋白质的结合。 1(待标记蛋白溶液的制备 将待标记蛋白预先对0.005Mol/L pH7.0 NaCl溶液中4?透析过夜，以除去多余的盐离子，然后100 000g4?离心1h，去除聚合物。 2(待标胶体金溶液的准备 以0.1Mol/L K2CO3或0.1Mol/L HCl调胶体金液的pH值。标记IgG时，调至9.0;标记McAb时,调至8.2;标记亲和层析抗体时，调至7.6;标记SPA时，调至5.9,6.2;标记ConA时，调至8.0;标记亲和素时，调至9,10。 由于胶体金溶液可能损坏pH计的电板，因此，在调节pH时，采用精密pH试纸测定为宜。 3(胶体金与标记蛋白用量之比的确定 (1)根据待标记蛋白的要求，将胶体金调好pH之后，分装10管，每管1ml。 (2)将标记蛋白(以IgG为例)以0.005Mol/L pH9.0硼酸盐缓冲液做系列稀释为5µg/ml,50µg/ml，分别取1ml，加入上列金胶溶液中，混匀。对照管只加1ml稀释液。 (3)5min后，在上述各管中加入0.1ml 10,NaCl溶液，混匀后静置2h，观察结果。 (4)结果观察，对照管(未加蛋白质)和加入蛋白质的量不足以稳定胶体金的各管，均呈现出由红变蓝的聚沉现象;而加入蛋白量达到或超过最低稳定量的各管仍保持红色不变。以稳定1ml胶体金溶液红色不变的最低蛋白质用量，即为该标记蛋白质的最低用量，在实际工作中，可适当增加10,,20,。 4(胶体金与蛋白质(IgG)的结合 将胶体金和IgG溶液分别以0.1Mol/L K2CO3调pH至9.0，电磁搅拌IgG溶液，加入胶体金溶液，继续搅拌10min，加入一定量的稳定剂以防止抗体蛋白与胶体金聚合发生沉淀。常用稳定剂是5,胎牛血清(BSA)和1,聚乙二醇(分子量20KD)。加入的量:5,BSA使溶液终浓度为1,;1,聚乙二醇加至总溶液的1,10。 5(胶体金标记蛋白的纯化 (1)超速离心法:根据胶体金颗粒的大小，标记蛋白的种类及稳定剂的不同选用不同的离心速度和离心时间。 用BSA做稳定剂的胶体金-羊抗兔IgG结合物可先低速离心(20nm金胶粒用1 200r/min，5nm金胶粒用1 800r/min)20min，弃去凝聚的沉淀。然后将5nm胶体金结合物用6 000g，4?离心1h;20nm,40nm胶体金结合物，14 000g，4?离心1h。仔细吸出上清，沉淀物用含1,BSA的PB液(含0.02,NaN3)，将沉淀重悬为原体积的1,10，4?保存。如在结合物内加50,甘油可贮存于-18?保存一年以上。 为了得到颗粒均一的免疫金试剂，可将上述初步纯化的结合物再进一步用10,,30,蔗糖或甘油进行密度梯度离心,分带收集不同梯度的胶体金与蛋白的结合物。 (2)凝胶过滤法:此法只适用于以BSA作稳定剂的胶体金蛋白结合物的纯化。将胶体金蛋白结合物装入透析袋，在硅胶中脱水浓缩至原体积的1,5,1,10。再经1 500r/min离心20min。取上清加至Sephacryl S-400(丙烯葡聚糖凝胶S-400)层析柱分别纯化。层析柱为0.8 cm×20cm，加样量为床体积的1,10，以0.02Mol/L PBS液洗脱(内含0.1,BSA，0.05,NaN3，pH8.2者用IgG标记物)，流速为8ml/h。按红色深浅分管收集洗脱液。一般先滤出的液体为微黄色，有时略混浊，内含大颗粒聚合物等杂质。继之为纯化的胶体金蛋白结合物，随浓度的增加而红色逐渐加深，清亮透明，最后洗脱出略带黄色的为标记的蛋白组分。将纯化的胶体金蛋白结合物过滤除菌、分装,4?保存。最终可得到70,,80,的产量。 6(胶体金蛋白结合物的质量鉴定 (1)胶体金颗粒平均直径的测量:用支持膜的镍网(铜网也可)蘸取金标蛋白试剂，自然干燥后直接在透射电镜下观察。或用醋酸铀复染后观察。计算100个金颗粒的平均直径。 (2)胶体金溶液的OD520nm值测定:胶体金颗粒在波长510nm,550nm之间出现最大吸收值峰。用0.02Mol/L pH8.2 PBS液(含1,BSA，0.02,NaN3)将胶体金蛋白试剂作1:20稀释，OD520,0.25左右。一般应用液的OD520应为0.2,0.4。 (3)金标记蛋白的特异性与敏感性测定:采用微孔滤膜免疫金银染色法(MF,IGSSA)。将可溶性抗原(或抗体)吸附于载体上(滤纸、硝酸纤维膜、微孔滤膜)，用胶体金标记的抗体(或抗原)以直接或间接染色法并经银显影来检测相应的抗原或抗体，对金标记蛋白的特异性和敏感性进行鉴定。 (四) 胶体金标记技术在免疫学中的应 用 胶体金标记技术由于标记物的制备简便，方法敏感、特异，不需要使用放射性同位素，或有潜在致癌物质的酶显色底物，也不要荧光显微镜，它的应用范围广，除应用于光镜或电镜的免疫组化法外，更广泛地应用于各种液相免疫测定和固相免疫分析以及流式细胞术等。 1(液相免疫测定:将胶体金与抗体结合，建立微量凝集试验检测相应的抗原，如间接血凝一样，用肉眼可直接观察到凝集颗粒。利用免疫学反应时金颗粒凝聚导致颜色减退的原理，建立均相溶胶颗粒免疫测定法(Sol particle immunoassay ,SPIA)已成功地应用于PCG的检测，直接应用分光光度计进行定量分析。 2(金标记流式细胞术:胶体金可以明显改变红色激光的散射角，利用胶体金标记的羊抗鼠Ig抗体应用于流式细胞术，分析不同类型细胞的表面抗原，结果胶体金标记的细胞在波长632nm时，90度散射角可放大10倍以上，同时不影响细胞活性。而且与荧光素共同标记，彼此互不干扰。 3(胶体金固相免疫测定法 (1)斑点免疫金银染色法(Dot,IGS,IGSS)是将斑点ELISA与免疫胶体金结合起来的一种方法。将蛋白质抗原直接点样在硝酸纤维膜上，与特异性抗体反应后，再滴加胶体金标记的第二抗体，结果在抗原抗体反应处发生金颗粒聚集，形成肉眼可见的红色斑点，此称为斑点免疫金染色法(Dot,IGS)。此反应可通过银显影液增强，即斑点金银染色法(Dot,IGS,IGSS)。 (2)斑点金免疫渗滤测定法(dot immuno,gold filtration assay,DIGFA)此法原理完全同斑点免疫金染色法，只是在硝酸纤维膜下垫有吸水性强的垫料，即为渗滤装置。在加抗原(抗体)后，迅速加抗体(抗原)，再加金标记第二抗体，由于有渗滤装置，反应很快，在数分钟内即可显出颜色反应。此方法已成功地应用于人的免疫缺陷病病毒(HIV)的检查和人血清中甲胎蛋白的检测。 xiexie 请问假阳性产生的原因和消除方法 谢谢 最近忙，好久没有来混混了 楼上最近在忙什么，还在贵阳吗, 很久没上来.最近遇到一些问题,NC膜太脆,上样前该如何处理为好?谢谢!还有用于层析的NC膜,要速度稍慢一些的,原先用Millipore的,可现在买不上,各位可有办法?先谢了! 胶体沉积的速度于直径的3次方成正比。 450nm太大了，450nm一般是乳胶。 免疫层析胶体金一般用20,60nm。 mz0306 wrote: 我最近遇到很头痛的问题，请大家帮着解答，我在标记后的作纯化时第一遍离心的沉淀还正常，第二遍离心就剩下小硬块啦，在TBS中不溶解，是什么问题啊。 我在标记的时候发现一加入抗体颜色就会变(有点稍微发紫)，怀疑是抗体的原因，但我在以前做的时候用同一抗体结果挺好(在膜上的反应也可以)，重新纯化腹水后问题还是这样，请各位高人帮忙分析一下～ DXY高手是满多的嘛。 也碰到过这样的情况，不知道各位高手还有什么看法, 十分感激TomBacon兄还记得小弟，我还在贵阳的一所学校里，前段时间学校搞什么教育部评估，拉我写材料去了。不过近来休息了一下，又重新做了些金标抗体，刚刚看见我SXJSWIFT说的东西，和我最开始做的时候遇见的问题相似 "在标记后的作纯化时第一遍离心的沉淀还正常，第二遍离心就剩下小硬块啦"，呵呵，这应该是胶体金的问题吧，不知道楼上在标记前对胶体金进行过质量检测没有。前两天我看了咱们这贴第一楼发的(好像啊)英文的胶体金标记的过程，有启发借鉴。不过又想说，这个缓冲液一定要用TRIS等等吗，我其实做的时候标记时用的缓冲液就是一般的PB液，因为我当时看了一篇印度阿三写的外文文章(文章我要找找，他的意见是要避免卤族阴离子在缓冲液中的出现，如果这样TRIS也不是很麻烦,,)反正后来我自己做的东西(金标抗体)在我稳定了胶体金质量之后感觉还行，只是对于膜的处理，我感觉我摸的不好，只是通过了很多弯路感觉在点样前，一定要在膜的活化上做一些处理(应该是要用表面活化剂吧)，但是这个配方就像我现在学做我们贵州的名菜酸汤鱼一样还在摸，我想这里面应该是有学问的吧， TomBacon兄,,, 附:小人我毕业于贵阳医学院免疫学，研究生期间做的是DIGFA(技术含量不高)，现在通过几年摸了条件后觉得这东西做下去非要自己有上游原料，所以打算一边敲层析的门一边做点单抗，不知大家觉得这样如何,, 唠叨了一堆，明天还要去监考，祝各位大侠晚安。 没想到TomBacon 对我问题 专门打电话指点，而且很有帮助，请版主加分 kmraptor, 不用客气,只要我懂的东西,我会尽力帮你的. phzmh61, 表面活性剂配方不容易摸索的.而且具体情况要具体分析.上游原料是决定的关键,但摸索上游要配备足够的技术人员,而且对 经验 班主任工作经验交流宣传工作经验交流材料优秀班主任经验交流小学课改经验典型材料房地产总经理管理经验 要求很高. TomBacon wrote: kmraptor, 不用客气,只要我懂的东西,我会尽力帮你的. phzmh61, 表面活性剂配方不容易摸索的.而且具体情况要具体分析.上游原料是决定的关键,但摸索上游要配备足够的技术人员,而且对经验要求很高. 那请问表面活性剂的配方有比较程式化的摸索路线吗,就像PCR那样先调Mg2+，再调K+这样的模式。