反相高效液相层析技术用于人类γ—珠蛋白多态性研究

反相高效液相层析技术用于人类γ—珠蛋白多态性研究 反相高效液相层析技术用于人类γ—珠蛋白 多态性研究 一 第l4卷第1期赣南医学院学报 弛7 14?0.1 反相高效液相层析技术用于人类一珠蛋甘多态性研究 易志堑陈松森)席国华粱植权 r—一—————1/ (生化教研童.中国医科院基因 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 研究室江西医学院生化教研室) 摘要以国产乙腈为主要分析试剂,LargeporeVydacc4柱,建立了反相高教藏相层析 (RHPLC)技术,用于新生儿HbF中一珠蛋白多杏性的研究.其分离效果良好,且l具快速 微量,准确和重现性好的特点,与国外方法相比能节约大量时间和试剂.大大简化分析过程, 为HbF的研究提供新的有效途径 Heterogeneity)研究,对于多基因调节机 制的研究及地中海贫血的基因治疗具有重要 价值,越来越被国内外学者所关注,它也是 近年来分子遗传学颇受重视的内容之 一 “ .HbF中各成份的分离是发现珠蛋 白新基因型的关键,其研究方法有:等电聚 焦电泳法,RCB-3肤法,Immobiline法, 含TritonX-100的酸性尿素聚丙烯酰胺凝 胶电泳法及HPLC法等.HPLC法 具有快速,灵敏,准确,微量和重现性好等 优,能分离出上述其它方法无法分离的 链和AyT变异体.但由于分析试剂昂贵 (主要试剂需进口),技术难度高等原因难以 使该法得到广泛应用.本文Huisman的 HPLC法的洗脱系统进行调整,改变洗脱 条件,用国产试剂建立了反相HPLC法, 使HbF中各成份及变异体能得到良好的分 离,数据准确,重视性好. 报告 软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载 如下. 1 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 与方法 』.』仪嚣BeckmanModal334HPLC分 , 雅编栩,中r1?叫, 析仪(美国Beckman公司产品),421Con- troller,165VariableDetector;分析柱: LargePoreVydaeC4柱(美国2l4TP54): 真空抽气泵:TGL一16B高速台式离心机. f_2主要试剂三氟醋酸(TFA):色谴 纯,J.T.Baker化学公司,L0T406l18;乙 腈:色诺纯,中国科学院上海脑研究所;甲 醇:色谱纯,中国科学院上海脑研究所. J.3试剂配制, J.王J10%溶血液样本制备’于医院产 科,用干燥于肖毒容器采集新鲜脐带血,用 EDTA抗凝,按文献(91制备l0%溶血 液. J.j.2洗脱液,制备 ?洗脱液母液: 0.1%TFA水溶液600ml………(I) 0.1%TFA乙腑液40Oral-..……?(11) A液:取(I)200ml加人(11) 300ml混合. B液:取(I)400ml加人(11) lOOml混合. A液,B液配制所用水为超纯水,试剂 配完后用真空抽气泵抽气10rain,用锡纸封 . 一 5一 赣南医学院学报1994正 口备用.’ 1.4实验方法 1.4.,样本处理取10%溶血液30.td于 0.5mlEppendorf管中,加超纯水200pl, 混匀,离心10min(14000转/分). ,.4.2样品的RliPLC分离 ,.4.2.』准备阶段HPLC仪予热30min 后?用超纯水冲洗分析柱(速度lml/ 分)?2h后换70%甲醇冲洗(速度为1ml/ 分)?取已配制好的甲苯:二甲苯为1:l的 混合液ll注人加样孔, 记录 混凝土 养护记录下载土方回填监理旁站记录免费下载集备记录下载集备记录下载集备记录下载 仪上出现2 条吸收峰,说明仪器.分析柱性能优良. 1.4.2.2样本的分析 ?作光路自检通过后,输入各数据: =220nm,灵敏度=0.06,Attend:4, MINAR:50000?Slop:200,Wjdth: 5. @样本的分离条件:按流动相流速为 lml/分,A液在60min内由56.5%降到 43.5%的条件设计主程序. 2结果 以三氟醋酸和乙腈水溶液为流动相, LargePoreVydacC4为分析柱的RHPLC 法能将正常新生儿HbF分为,G’._ 41和等链(图1);将A7T变异体基因 携带新生儿的HbF分为,卢,AyT,Gy, A7I和等链(图2J.图3为作者在贵州 省调查一珠蛋白多态性时发现的一例.一 地中海贫血纯合子(苗族.8十月女孩)的 HPLC圈,患者缺乏链.图4为正常成 人血红蛋白(HbA)的HPLC图. —— 6—— 妣丹 圈2攮A变异体的新生儿laFHPI.C? 田_3卢.-士电中海贫血纯台子的HPLC圈 田4正常成人HbA的HPLC圈 分 分 巨0_,目召0?-_,基0., 3讨论 采用本文的方法-结果清晰-各肽链分 离效果良好,能使其它方法无法分离的成分 得到分离.较Huisman的方法在时间上每 分析一个样本缩短30rain,提高了分离效 率,大大节约了时间和分析试剂”. 分析HbF时所用的固定相是非极性的 吸咐剂C,流动相是极性的三氟醋酸乙腈 水溶液,因此这是一种反相HPLC 法”.其中的三氟醋酸可提供洗脱系统的 pH值:乙腈的作用是虢脱.样本通过进样 孔注人层析柱后,样品中的各组份与流动相 和固定相之间产生疏水效应?氢键形成及溶 质分子中带电荷的支链与C的作用等,其 中以疏水作用为主.组成各链的氨基酸各有 不同的侧链,因此其疏水作用也各不相 同,产生相互作用大小有差异而引起各组份 迁移速度不同-使各链得到分离,分离后的 物质通过紫外检测器检测后可反映到记录仪 记下各组份的峰形,据保留时间进行各链自 动鉴别,以峰面积进行自动扫描定量.救本 法具有程序化,自动化.能同时进行分离和 定量,样本无需特殊处理的优点,故分离的 成份纯净?可用于一缎结构分析. HPLC技术是近年来发展起来的精密 分析技术一其仪器,分析条件.技术操作等 方面有较高要求,分析中掌握有关影响因素 是技术的关键.以下就有关影响因素有如下 体会: (1)分析柱的使用:要选择好适当型号 的分析柱,其原因是分析柱孔径的大小直接 影响分析效果:试剂.样品的准备也要严 格 (2)洗脱系统的流动相: l流动相中溶剂的化学组成和物理性质 【如吸光性)是影响分离效果和结果分析的 重要因素.本文采用的流动相中0.1%三氟 醋酸是强酸-可提供洗脱液的酸性环境,影 响蛋白质的电离而本身紫外吸收小一使结果 误差小;乙腈为色谱纯试剂具分离能力 强,洗脱强度高,粘滞度低等优点;所用的 水为超纯水,其吸光度小且利于柱子的保 护.一 誊流动相适当的洗脱梯度可使分析柱的 稳定性更好,且能更有效地使各肽链得到分 离.本文采用A液在60min内由44%上升 高56%,B液在60rain内由56.5%降到 44%的梯度,能使HbF中ATT等其它一般 方法无法分离的成份,得到良好分离. ?流动相的流速应适当.过快.过慢影 响各因素的相互作用,影响样晶的分辨率, 本法所用的流速为lml/分,较为适宜. (3)试剂配制与样品处理.每次使用的 试剂最好新配制-使用前应负压或氮气除 气,以免气体阻塞分析柱,影响分离效果. (4)其它实验条件的控制.HPLC分 析时室温应控制在24?左右,温差太大影 响样品与分离试剂,分析拄间的相互作用, 从而影响分离效果;掌握进样技巧样本分 离后应注意冲洗分析柱;开机,关机应严格 按操作 规程 煤矿测量规程下载煤矿测量规程下载配电网检修规程下载地籍调查规程pdf稳定性研究规程下载 进行. 值得指出的是,HPLC法豫用于r珠 蛋白多态性研究外,在其它医学研究中 =殳物质的分离,鉴定,制备上也将越来 越显示出其重大作用. 参考文献 1ScbroedWA.etalProcAcadSc1USA. 1968,60:537 2HuismanTHJ,cta1.HemoglobinI988,I2 (5&6:6q9 3LiangCC”,etaI.Hemoglobin.I988.I2 (5&6):7I7 ——,—— 赣南医学院学报 4易志勤,等.遗传,1993,15f3):1 5RighettiPG,eta1.JBiochemBiophys,1979. 1:47 6MantaM,eta1.AmJHematol,1986,22: 285 7敢朝晖,等.生物化学杂志,1989,5(5):436 8HuismanTHJ,eta1. NewYork;ALan 1994隹 R.Liss,1987:23,28 9南国华,等生物化学与生物理学进展.1984, (1):66 10奥?米克斯主编.色谱及有关方法的实验室手 册.扬文澜等译.机械工业出版杜,1986. 11易志勤.赣南医学院学报,1990,10(2):124 12张松,等.分析化学,1988,16(2):122 (收祷日期:1993—10一l9) RasePhaseHPLCtechniqueUsedin’ Human——globinHeterogeneityResearch YiZhiqin,etal (DepartmentofBiochemistry,GannanMedicalCoflege) Therasephasehighperformanceliquidchromatography(RHPLC)withlargepore vadacC4columntodetecty-globinchaiminHbinnewbo1”11babieshasbeenbuilt.Thismeth. odhasmanyadvantages;onlyneedingslightsamples,quickandaccurateingettingresults andexcellentinreappearancecomparedwiththemethodusedjnforeigncount~es,ThisCan savebothmuchtimeandalotofreagents.Itcansimplifytheprocessofffnaisandprovidea moreeffectivewayt0studyHbF. Keywords:y-globinheterogeneity;cordblood;RHPLC;infant,newborn