鸡OC77基因克隆、表达及其Ser61位点对碳酸钙结晶.doc

鸡OC77基因克隆、 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达及其Ser61位点对碳酸钙结晶.doc 鸡OC77基因克隆、表达及其Ser61位点对碳酸钙结晶 第一章绪论 1.1蛋壳结构与形成 一般来说，禽类蛋壳由6层结构组成(Nys，Hinckeetal. 1999)。最内2层的内、外蛋壳膜是未妈化的。其次不规则乳头状突起层、栅栏层和垂直晶体层是妈化的。蛋壳表面是表皮层，是沉积在蛋壳外面的有机层。蛋壳生物矿化过程分为:碳酸韩开始堆积在乳突层核心，逐渐形成一个圆锥的形态，矿化沉积完成的蛋壳质量一般为蛋质量的10?11%。蛋壳基本成分为碳酸韩，在蛋壳中约占95?98%，其余为基质蛋白质。基质蛋白质主要包括二硫键交互的纤维蛋白、蛋壳膜中胶原蛋白与蛋壳钙化层中的蛋白多糖和糖基蛋白。当鸡成熟的卵泡排出卵黄后，经过十几分钟进入膨人部形成蛋白包卵黄。随后进入输卵管峡部分泌成内外蛋壳膜，有机物聚集在峡部尾端，随机形成沉淀在外蛋壳膜上的乳突层突起，此时方解石晶体发生不规则的多晶聚集。随后进入输卵管子宫部，在鸡排卵5小时后，方解石晶体在蛋壳膜上继续不断生长图1.1)。子宫液无细胞情况下存在过饱和的Ca2+和HC03-离子及可溶的蛋白质基质前体，这些成份的浓度在蛋壳形成过程当中不断转变。蛋壳矿化主要包括以下三个过程:排卵后5到10小时的起始阶段、排卵后10到20小时的快速沉积阶段和f丐化完成阶段图1.2)。在碳酸妈迅速沉积过程时，鸡蛋在子宫部不断旋转，构成蛋壳乳头层和栅栏层。在产蛋前1.5小时，停止生物矿化过程，开始形成表皮层。 .. 1.2蛋壳生物矿化 蛋壳首先在输卵管红峡部开始矿化，一些有机成分在外蛋壳膜沉积。当鸡蛋进入输卵管子宫部后，这些有机成分很快形成晶体，即未成型的乳头状突起。蛋壳矿化的本质是碳酸1?在各种有机基质蛋白的调控下起始于蛋壳膜上的有序沉积过程(Nys，Gautron et al. 2004)。进入输卵管子宫部的未矿化的鸡蛋沉浸在含有妈离子、碳酸跟离子、基质蛋白质前体的子宫液中，增进蛋壳晶体的生长(Nys, Zawadzki et al. 1991)，这些物质随不同的矿化阶段存在显著差异(Gautron，Hinckeetal. 1997)。蛋壳矿化阶段分为:1)排卵后5~10小时的初始阶段;2)排卵后10~20小时的快速沉积阶段;3)排卵后20- 24小时的矿化终止阶段(Gautron, Hincke et al. 1997，Nys，Hinckeetal. 1999)。在蛋壳矿化阶段，子宫液中的妈离子和碳酸跟离子均处于较高水平。在过饱和的子宫液中，碳酸妈在有机基质蛋由的促进下完成在蛋壳膜上的沉积过程。最终，蛋壳由内而外地形成了乳突层、栅栏层、晶体层以及未被矿化的覆盖在矿化完成的蛋壳表面的胶护膜。 .. 第二章利用转录组与全基因组测序 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 蛋壳强度变异 2.1前言 蛋壳破损给企业造成的经济损失以及对人体健康带来的危害不容小觑(Nys, Bain et al.2011)。一直以来，如何提高鸡蛋壳品质是国内外家禽育种工作者探讨的问题。引起蛋壳品质差异的因素主要包括遗传因素、疾病、营养和环境因素，其中母鸡体内蛋壳矿化机理的遗传变异可能是导致蛋壳品质变异的关键因素。因此，研究蛋壳品质的遗传机理，应用分子遗传育种技术改善蛋売品质是提高蛋壳质量的有效途径。鸡蛋在母鸡输卵管内经过24小时左右形成,其中蛋壳在母鸡体内矿化大约需要18个小时。整个矿化过程发生与母鸡输卵管的子宫部，主要包括矿化初始期、快速矿化期和矿化终止期。其中，快速矿化期是蛋壳形成的主要时期，一般认为该时期是蛋壳矿化过程中影响蛋壳强度的关键时期。因此，本研究采集母鸡排卵18小时后的输卵管子宫部组织样本和血液样本，通过转录组测序以及全基因组重测序技术，利用生物信息学分析数据，蹄选与蛋壳强度变异有关的差异表达基因以及基因遗传变异。 .. 2.2材料与方法 2.2.1试验动物 本试验选择49周龄洛岛白母鸡为试验群体，该试验群体经过闭锁选育20世代，蛋壳质量在该群体内发生了遗传分化。鸡只自由采食和饮水，饲养管理程序依照北京中农榜样蛋鸡育种有限责任公司 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 程序进行。连续收集试验群体1052只个体的每只母鸡所产的新鲜鸡蛋3枚。每枚鸡蛋24小时内测定蛋壳强度。统计每只母鸡3枚 鸡蛋蛋壳强度平均值作为每只母鸡鸡蛋蛋壳强度统计值。选取每枚鸡蛋的纯端、中端和尖端的蛋壳厚度的平均值为个体蛋壳厚度，统计每只母鸡3枚鸡蛋个体蛋壳厚度平均值作为每只母鸡鸡蛋蛋壳厚度统计值。釆集根据蛋壳强度测定结果，选择鸡蛋蛋壳强度有差异的母鸡为样本采集试验对象。使真空采血管于母鸡翅静脉采集新鲜梓檬酸钠抗凝血液，用于血液DNA提取供全基因组重测序。采集母鸡输卵管子宫部组织样本，将所取样本迅速放入己提前编号的2 ml离心管中，盖好后放入已倒有液氮的保温杯中。在操作时注意使用RNase Remover处理环境和工具，操作人员要注意戴好口罩头套手套，操作准确迅速。 第三章基质蛋白OC-77基因克隆、表达分析.........31 3.1前言........31 3.2材料与方法........31 3.3结果与讨论........37 3.3.1OC-17基因转录拼接........37 3.3.2OC-i7 cDNA 全长序列........38 3.3.3OC-17基因表达分析........39 第四章OC-17蛋白Ser61位点对碳酸钙结晶功能研究.........40 4.1前言........42 4.2材料与方法........42 4.2.1材料与方法........45 4.3结果........47 4.4讨论........49 第五章结论........52 第四章OC-17蛋白Ser6i位点对碳酸耗结晶功能研究 4.1前言 原核表达系统具有表达量高、操作简单等优点，但该系统表达的蛋白存在非糖基化形式和非天然状态折叠等缺陷，这使得表达的蛋白分子失去天然结构，因而对表达的重组蛋白的活性还存在争议。由于原核表达的重组蛋白缺乏适当折叠、二硫键形成、寡聚化、翻译后修饰等作用，而真核表达蛋白能克服以上的缺陷，对表达蛋白可以进行糖基化、折叠等修饰作用，表达的重组蛋白在结构和生物 学活性等方面更接近天然蛋白。因此，本试验用哺乳动物真核表达系统对OC-17重组蛋白进行表达。鉴于真核表达系统具有相同或相近于天然蛋白的特性，本研究利用哺乳动物293T细胞来表达0C-17重组蛋白，以期能够获得活性更接近于天然OC-17的基因工程蛋白，为其功能研究奠定基础。生物矿物是在不同层次的生物在进化过程中产生的，这些生物利用生物矿物来实现生命体的各种功能，如支撑结构。为了实现这些功能，矿物必须采用特殊的性状和结构。生物矿物的形成与有机大分子包括蛋白质和多糖密切相关。虽然这些大分子的含量非常低通常为1%)，但是这些大分子被认为在生物矿化过程中，不仅为生物矿物的形成提供一个结构框架，还起到调节包括矿物成核点的整个动态过程，包括晶体生长、组装和晶体取向(Lowenstam and Weiner1989，Mann 2001, Xu, Ma et al. 2007)。大多数认为这些大分子的潜在作用机制是有机-无机界面的静电相互作用、立体匹配的相关分子识别和几何互补(Addadi and Weiner 1985, Lowenstam andWeiner 1989, Mann 2001, Xu, Ma et al. 2007)。许多体外研究已经进行模仿来不同的生物矿化过程，其中已经尝试来各种有机分子，包括不溶性基质蛋白(Falini，Fermani et al. 1997)、朗格缪尔单层膜(Addadi and "Weiner 1985)、添加水溶性基质蛋白(Falini, Fermani et al. 1997)、高分子聚合物(C5lfen and Antonietti 1998)、多肽(DeOliveira and Laursen 1997)和其他一些小分子(Xu，Yu et al.2005)。碳酸釣作为自然界中广泛存在的结构和功能材料已被广泛研究。在自然界中，碳酸I丐有三种无水结晶阶段:方解石、文石和球文石。方解石是在热力学上最稳定的形式，而球文不f是最不稳定的。方解石和文石通常以精美的造型和有序的结构广泛存在与生物矿物中。此外，非晶碳酸妈(ACC)在一些生物中发现可以转化为结晶状态的碳酸弼。ACC和球文石是形成更稳定的方解石和文石的前体(Addadi，Raz et al. 2003)。由于碳酸辨结构的普遍性以及热力学不稳定的ACC和球文石的长期存在，许多研究人员一直在寻找一种先进复合材料的简便途径的潜在技术并在生物医学上得到应用。 结论 1.洛岛白母鸡试验群体中，导致蛋壳质量变异的差异表达基因主 要涉及興离子转运生物学过程和韩离子信号通路。差异表达基因中还包括OC-116、LTF和SPP1等一些重要的基质蛋白。C4CAM7基因突变rs312834462〉与蛋壳质量相关。 2.蛋壳特异基质蛋白OC77基因cDNA序列全长626bp，编码162个氣基酸。基因表达具有时空、组织特异性，并且与蛋壳质量负相关。 3.0C-17重组蛋白调节碳酸妈晶体生长速度和晶体形态，Ser6i位点影响方解石晶体<104>晶面形成。 ............