新疆泥火山群土壤细菌群落的DGGE分析

新疆泥火山群土壤细菌群落的DGGE分析 新疆泥火山群土壤细菌群落的DGGE分析 第48卷第6期 2010年11月 吉林大学(理学版) JournalofJilinUniversity(ScienceEdition) Vo1.48No.6 Nov2010 新疆泥火山群土壤细菌群落的DGGE分析 张亚平 李建辉,路盼盼, (石河子大学生命科学学院,新疆石河子832003) 摘要:采用变性梯度凝胶电泳(DGGE)指纹图谱技术,对新疆乌苏泥火山区土壤细菌群落的 16SrDNAV3区进行电泳分离,并用Quantityone软件对图谱进行聚类分析,对主要条带进行 回收测序.DGGE图谱显示,各土样细菌的组成有显着差异.聚类分析表明,相同月份,不同 深度土样细菌组成相近.特异条带的回收测序结果表明,假单胞菌属是泥火山土壤优势菌 群.新疆泥火山区土壤细菌多态性明显,并容易受生态,气候等因素影响,但优势菌群受此 影响较小. 关键词:泥火山;16SrDNA;变性梯度凝胶电泳(DGGE);DNA指纹图谱技术 中图分类号:Q938.1文献标志码:A文章编号:1671-5489(2010)06.1070-05 AnalysisoftheBacterialCommunitiesinMudVolcanoSoils …' njiang'DGGEinxinjiangviaDGGE LIJian-hui,LUPan—pan,ZHANGYa—ping (CollegeofLifeScience,ShiheziUniversity,Shihezi832003,XinjiangUygurAutonomousRegion,China) Abstract:16SrDNAV3fragment— basewasseparatedbyDGGE(denaturinggradientgelelectrophoresis)and clonesequenceBLASTtechnologies,andquantityonesoftwarewasusedtomaptheclusteranalysis.The fingerprintshowsthatthecompositionsofbacteriainallthesoilsamplesareobvriouslydifferent.Thecluster analysisindicatesthatthestructuresofbacteriainthesamemonthofsoilsamplesindifferentdepthsare similartoeachother.SpecificbandsequencingresultsshowthatthePseudomonasspisthedominantmicroor- ganismsinmudvolcanicsoils.ThebacterialpolymorphisminmudvolcanosoilinXinjiangissignificant,and thisdiversityisvulnerabletoecological,climaticandotherfactors,however,thesefactorsaffectthedominant microorganismslittle. Keywords:mudvolcano;16SrDNA;denaturinggradientgelelectrophoresis(DGGE);DNAfingerprinting 泥火山,是指以喷发泥浆为主的火山,又称凉火山.其形成是地层内部圈闭气体由 于压力释放上 冲的结果….由于其为沉积物深处是否蕴藏油,气及其他潜在的能源提供了证据, 所以对泥火山的研 究已引起人们广泛关注_2].新疆泥火山多形成在油,气藏发育地区,泥火山喷出的 泥浆内常混有原油, 其伴生的天然气成分以CH为主,可以点燃J.新疆以乌苏泥火山群最具代表性,它 位于北纬 44.1O06",东经84.2320",海拔约为1275m的山坡上. DNA指纹图谱技术,如变性梯度凝胶电泳(DGGE),单链构象多态性(SSCP)等,能快 速有效地分 析某一特定环境的微生物群落结构,了解其种群动态,是研究土壤微生物群落的有效方法J.DGGE 收稿日期:2010-03—11. 作者简介:李建辉(1984,),男,汉族,硕士研究生,从事土壤生物与生物化学的研究,E—mail:lijianhuiljh@163.corn.通讯作者: 张亚平(1964一),女,汉族,硕士,教授,从事土壤微生物多样性的研究,E—mail:yingyu6286376@163.corn. 基金项目:国家自然科学基金(批准号:30860001). 第6期李建辉,等:新疆泥火山群土壤细菌群落的DCGE分析1071 由于Gc夹的特殊作用,使得双链DNA分子在含梯度变性剂的聚丙烯酰胺凝胶中发生部分变性,由于 不同序列变性程度不同而导致电泳迁移率不同,从而将相同长度不同碱基序列的DNA片段分离.本文 以新疆乌苏泥火山群为研究对象,利用DGGE技术分析泥火山土壤的细菌群落结构及演化规律. 1材料与方法 1.1土样采集 土壤样品取自新疆乌苏泥火山群,在固定位置采取5点取样法,每个样点取5个层次的土壤样品, 分别为:010,10,20,20—30,30—40,40,50em.采样时间分别为2009年4月,7月,1O月. 样品编号,采样位置,深度和采样时间列于表1. 表1土壤采集位置,地点和时间 Table1Positions,locationsanddateofsoftsamplings 1.2细菌总DNA的提取与纯化 采用SDS高盐提取改进法J,称取充分研磨的土样5g,加入l3.5mLDNA提取液(100mmol/L T打s,100mmol/LEDTA,100mmol/LNaPO,1.5mol/LNaC1,质量分数为1%的 CTAB,pH:8.0)和 20颗直径约为3mm的玻璃珠,震荡3rain;加500ILL溶菌酶(50mg/mL),震荡30S,37oC水浴 30rain;加入20L蛋白酶K(20mg/mL),震荡30S,37oC水浴30rain;加入1.5mL质量分数为10% 的SDS后,一20?放置1h,65oC水浴1h(期间每隔15min上下颠倒晃动几次),重复2次. 6000r/min离心10rain,取上清液,用等体积苯酚和氯仿与异戊醇的混合液((氯仿):(异戊醇)= 24)各抽提1次;12000r/rain离心15rain,取上清液,加入0.6倍体积的异丙醇,室温放置2h或过 夜;12000r/rain离心20rain,弃上清液,加预冷的体积分数为70%的乙醇5mL,12000r/rain离心 20rain,收集DNA沉淀,加适量TE溶解. 1.3基因组总DNA的纯化及16SrDNAV3区扩增 采用北京天根生化科技有限公司的凝胶回收试剂盒对提取所得的基因组DNA进行纯化,得到 23.5kh左右的DNA片段.以此DNA为 模板 个人简介word模板免费下载关于员工迟到处罚通告模板康奈尔office模板下载康奈尔 笔记本 模板 下载软件方案模板免费下载 ,采用嵌套式PCR,引物见表2.第一套PCR扩增:用细菌 的通用引物27F/1492R扩增,反应体系(20L):2L10xbuffer,1LMgCI2(25mrnol/L),0.5L dyrr'(1Omot/L),引物(10Ixmmol/L)各1IxL,0.5IxLTaq酶(83.35nkat/ixL),0.5LDNA模板, 13.5IxLddH20.反应程序:94oC5rain;94oC30s,55oC30s,72oC2rain,30个循环;72oC10min. 第二套PCR扩增:引物为F338GC/R518扩增,反应体系(2OIxL):2IxL10Xbuffer,1txLMgC1 (25mmol/L),0.5LdNTP(10mmol/L),弓l物(10~mmol/L)各1L,0.5LTaq酶 (83.35nkat/I~L),0.5IxL稀释10倍的一套扩增物,13.5ddH20.反应程序:94oC5rain; 1072吉林大学(理学版)第48卷 94?30s;52?30s;72oC2min;30个循环;72?10min. 表2用于16SrDNA扩增的引物 Table2Primersfor16SrDNAampfication }GC夹序列为CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG. 1.4DGGE分析 采用Bio—Rad电泳系统.在质量分数为8%的聚丙烯酰胺凝胶中加入适量变性剂,使得变性剂梯度 为40%-60%,PCR产物加样量30,在60?,1×TAE,130V条件下电泳5h,电泳胶片利用改进 的Bassam银染方法.进行染色.DGGE条带用QuantityOne软件分析. 2结果 2.1土壤总DNA的提取和16SrDNA的PCR扩增 以2009年4月份采集的土壤为例,将土样总DNA的PCR产物用质量分数为1%的琼脂糖凝胶进 行电泳纯化.以27F和1492R为引物的扩增产物大小约为1.5kh,如图1所示.以F338GC和R518为 引物的二次扩增产物大小约为200bp,如图2所示. 2kb一 1kb一 750bp一 500bp一 250bp一 100bp一 2kb———一 1kb一 750bp———一 500bp———一 250bp一 100bp— M:DL2000;0:阴性对照;1,5分别表不1,5号土样.M:DI2000;0:阴性对照;l一5分别表示1,5号土样. 图1一套PCR产物电泳图2二套PCR产物电泳 Fig.1ProfileofthefirstroundPCRproductsFig.2ProfileofthesecondroundPCRproducts 2.2泥火山土壤细菌的DGGE分析 将第2次PCR的扩增产物进行DGGE分离,分别得到不同土壤样品的细菌DGGE图谱,如图3所 示.由图3可见,不同样品细菌DGGE图谱的条带数,条带位置和亮度存在一定差异:样品5,10,15的 条带数明显少于同月份的其他样品,4月份各样品的条带数较其他月份丰富,且每个样品都含有自己 的独特条带.进一步利用QuantityOne软件(Bio—Rad)对DGGE图谱的条带数和亮度进行数字化处理, 并进行聚类分析,可得各土壤样品间微生物组成的聚类分析结果(图4)及相似性分析结果(表3). 由图4可见,聚类树可以按照不同月份分为3支:第一支包括1,6,2,4,3号土样,主要以4月份 土样为主,称其为"4月份";第二支包括5,11,15,13号土样,称其为"10月份";最后一支包括7,14, 8,9,12,10号土样,称其为"七月份".结合表3可见,不同深度,不同月份及同一深度,不同月份泥火 山土壤细菌的组成存在较大差异.如不同深度,不同月份样品的1泳道和7泳道,13泳道之间的相似 度分别为36.8%和34.5%;同一深度,不同月份的1泳道和6泳道,11泳道之间的相似度分别为 48.7%和32.5%.而同一月份,不同深度泥火山土壤细菌的组成差异较小,如同一月份,不同深度土 样的3泳道与4泳道之间相似度高达74.7%. DGGE图谱特征还表明,有些细菌条带如条带A,B,c,在15个样品中均有分布,对这3个条带 第6期李建辉,等:新疆泥火山群土壤细菌群落的DGGE分析1073 进行回收克隆测序及序列比对(表4).一般地,细菌16SrDNA同源性达到97%及以上时,可以将这些 菌划为一个种;同源性达到94%及以上时,可以将这些菌划为一个属.结果表明,假单胞菌属是泥 火th=k壤的优势菌群,在泥火th~壤中广泛分布,受深度与季节环境的影响较小. M:DI2000;1,l5分别表示1,l5号土样. 图3PCR产物的DGGE电泳图谱 Fig.3DGGEprofilesofthePCRproducts 图4DGGE图谱聚类分析 Fig.4DendrogramoftheDGGEbandingpatterns 表3DGGE图谱的相似性分析 Table3SimilarityanalysisofDGGEpatterns 3讨论 DGGE是一种快速,可靠的检测土壤微生物群落结构及动态变化的指纹图谱技术.本文利用该技 术对新疆乌苏泥火山不同深度和不同月份土壤细菌组成进行了研究,揭示了我国泥火山土壤细菌组成 的多态性.由于土壤中微生物分布的不均一性,本文选用取较大样量的方法,提取纯化了5g土壤中 的总DNA,更能代表泥火山土壤中微生物的实际分布情况,且结果稳定.'"].采用嵌套式PCR进行扩 增,提高了PCR检测的灵敏度,从而保证产物的特异性,有利于获得较清晰的DGGE图谱. 本文通过对泥火山土壤细菌组成的DGGE图谱的聚类分析,表明新疆泥火山不同深度与不同季节 62435?n7M89m 1074吉林大学(理学版)第48卷 土壤的细菌组成多态性明显.其中4月份各土样细菌的多样性最丰富,相同季节,不同深度的细菌组 成相似度较高,说明新疆泥火山土壤微生物分布可能更易受到生态,气候等因素的影响.特异条带的 回收测序结果表明:假单包菌属是泥火山土壤的优势菌群,在泥火山土壤中广泛分布,受深度及季节 环境的影响较小.假单胞菌属于化能有机营养,可严格好氧,利用呼吸代谢,广泛存在于高盐碱,低营 养的环境中,新疆地下天然气和石油矿藏丰富区域的泥火山区正属于高盐碱,寡营养的极端环境n引, 因此假单胞杆菌可能参与油藏生态系统中C,N和S代谢,这与大庆油田和大港油田的一个水驱油藏非 培养分析结果一致. [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] 参考文献 DAIChun-shan.ANewAdvanceofGasHydrateResearch[J].MarineGeologyLetters,2002 ,18(12):12-17. (戴春山.天然气水合物研究的新进展[J].海洋地质动态,2002,18(12):12—17.) FANWei—ping,ZHENGLei—qing,GONGJian— hua,eta1.FormingofMudVolcanoandRelationwithHydrocarbon[J]. TubaOil&Gas,2007,12(1):43_47.(范卫平,郑雷清,龚建华,等.泥火山的形成及 其与油气的关系[J]. 吐哈油气,2007,12(1):43-47.) L【ANGJie,GONGJian-ming,CHENJian— wen.MudVolcanoesandNaturalGasHydratIJI.MarGeoLett,2006,22 (12):20-23.(梁杰,龚建明,陈建文.泥火山与天然气水合物[J].海洋地质动 态,2006,22(12):20-23.) AlfreiderA,PetersS,TebbeCC,eta1.MicrobialCommunityDynamicsduringCompostingofOtx~icMatteras Determinedby16SRibosomalDNAAnalysisIJ】.CompostSciUtil,2002,10:303-312. ZhouJZ,MaryAB,JamesmT.DNARecoveryfromSoilsofDiverseComposition[J].ApplandEnvironment Microbiology,1996,62(2):316-322. 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