中量质粒提取试剂盒操作方法及步骤说明书

中量质粒提取试剂盒操作方法及步骤说明书 杭州昊鑫生物科技股份有限公司 htpp://www.hzhxbio.com Plasmid Midi Kit 中量质粒提取试剂盒 目录号:PL08 , 适用范围: 适用于中量高纯或者转染级质粒制备和BAC/PAC大型质粒制备 , 试剂盒组成、储存、稳定性: 20次40次试剂盒组成 保存 (PL0801) (PL0802) RNaseA-20? 0.75 ml 1.3 ml (10mg/ml) 溶液P1 4? 65 ml 130 ml 溶液P2 室温 50 ml 100 ml 溶液P? 室温 50 ml 110 ml 杂质清除剂A 室温 1.5 ml 3 ml 杂质清除剂B 室温 15 ml 30 ml 内毒素清除剂 -20? 5 ml 10 ml 本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。 储存事项: 1. 第一次使用时，将试剂盒所带全部的RNase A加入溶液P1后(终浓度100μg /ml) 置于4?保存。如果溶液P1中RNase A失活，提取的质粒可能会混杂有微量RNA 残留，在溶液P1中补加RNase A即可。 ?可保存一个月，如果要长期保存，建议保存在,20?! 2. 内毒素清除剂在4 3. 环境温度低时溶液P2中SDS可能会析出出现浑浊或者沉淀，可在37?水浴加热 几分钟，即可恢复澄清，不要剧烈摇晃，以免形成过量的泡沫。 4. 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时 盖紧盖子。 , 产品介绍: 本试剂盒用碱裂解法从培养菌中提取质粒DNA，采用独特的溶液配方和内毒素清 杭州昊鑫生物科技股份有限公司 htpp://www.hzhxbio.com 除试剂，只需要几次简单离心去除蛋白质、多糖、内毒素、RNA等杂质，获得高质量的质粒DNA。纯化DNA的OD260/280通常在1.8左右，得到的质粒可直接应用于细胞转染甚至动物体内实验等对DNA纯度要求很高的工作中。纯化后期过程均在1.5ml小离心管中操作，方法简单，不需特殊设备，无需过柱，不用酚氯仿抽提;基本可完全回收细菌裂解释放出的质粒，不必担心质粒DNA的丢失。本方法提取纯化质粒DNA，对质粒损伤小，即使是10kb甚至100kb以上的大型质粒或超大型BAC/PAC质粒，只要碱裂解法能够提取，就可以有效纯化。可选择任意小体积溶解质粒，浓度可高达5μg/μl。超螺旋比例可高达95%，无内毒素，转染效果好。 , 产品特点: 1. 不需要使用有毒的苯酚，氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀。快速、 方便、从50-70 ml大肠杆菌LB((Luria-Bertani)培养液中，可快速提取150μg -600μg纯净的高拷贝 质粒DNA，提取率达80-90 %。 2. 获得的质粒产量高，浓度高，超螺旋比例高，纯度好，可直接用于酶切、转化、 PCR、体外转录、测序等各种分子生物学实验。 3. 内毒素含量极低(< 0.1 EU/μg DNA)，可直接应用于细胞转染。 , 注意事项 1. 提取的质粒量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。如果所提质粒为低拷贝 质粒或大于10kb 的大质粒，应加大菌体使用量，同时按比例增加P1、P2、P? 的用量。 2. 提取大质粒时操作动作要轻柔，应该使用剪大了开口的吸头，防止机械剪切对 DNA的损坏。 3. DNA沉淀液沉淀离心后，可能看不到明显沉淀。如未见沉淀，担心DNA丢失， 可保留上清液，待完成全部操作后电泳鉴定，以确定是否获得终产物(数百微克 DNA离心沉淀在管的侧壁上，可能无法看到明显团块)。 4. 得到的质粒DNA可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。OD260 值为1相当于大约50μg/ml DNA。电泳可能为单一条带，也可能为2条或者多条 DNA条带，这主要是不同程度的超螺旋构象质粒泳动位置不一造成，与提取物培 养时间长短、提取时操作剧烈程度等有关。本公司产品正常操作情况下基本超螺 旋可以超过95%。 5. 质粒DNA确切分子大小， 必须酶切线性化后，对比DNA分子量Marker才可以 杭州昊鑫生物科技股份有限公司 htpp://www.hzhxbio.com 知道。处于环状或者超螺旋状态的质粒，泳动位置不确定，无法通过电泳知道确 切大小。 , 操作步骤:(实验前请先阅读注意事项) , 提示:将RNase A全部加入溶液P1中，混匀，使用后置于2-8?保存。 1. 取过夜培养菌40-60ml(最大不超过90 ml)菌液，装入50ml离心管中，4,500~6,000 x g于4?离心5 min沉淀菌体(也可12,000 x g离心2分钟)，完全弃除上清。 2. 加入2.5 ml 溶液P1，充分混悬震荡菌体沉淀，使其完全分散开，至无絮块存在。 室温放置3~5 min。 如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。 3. 加入2.5 ml 溶液P2，轻轻颠倒离心管6~8次，室温放置5 min，使细菌完全裂解， 溶液透明。 温和地混合，不要剧烈震荡，以免基因组DNA剪切断裂～所用时不应超过5分 钟～以免质粒受到破坏。此时菌液应变得清亮粘稠，如果菌体少，很快清亮粘稠 后就可以做下一步，不是一定要准确的5分钟。如果未变得清亮，可能由于菌体 过多，裂解不彻底，应减少菌体量。 4. 加2.5 ml溶液P?，立即颠倒离心管6~8次，充分混匀，至白色絮状物产生。上 述裂解液于4? 12,000~16,000 x g离心10~15 min，小心吸出上清，移入新的50 ml 离心管中。 加入溶液P?后应该立即混匀，以免产生SDS的局部沉淀。 注意: 使用异丙醇沉淀，蛋白杂质和盐离子共沉淀较少，可能看不到明显的较 大团块沉淀，但是质粒还是可以完全沉淀下来，不影响实际的质粒产量。如果你 习惯看见较大的沉淀团块操作，可以选择2倍体积的无水乙醇沉淀。 5. 加入5 ml 异丙醇，颠倒离心管，充分混匀。 6. 于4? 12,000~16,000 x g离心10 min，小心弃去上清，倒置于吸水纸上轻轻沥干 残余液体，加入3-5ml 70%乙醇漂洗一遍，最高速离心5分钟，弃上清，晾干沉 淀。 DNA沉淀如果干燥过头，DNA将无法完全溶解，但是如果乙醇没有晾干挥发干 净，残留太多，也会造成DNA无法完全溶解。 注意:异丙醇离心沉淀后，质粒纯度很高吸附在管底和侧壁可能看不见沉淀，但 杭州昊鑫生物科技股份有限公司 htpp://www.hzhxbio.com 是不影响产量，后续步骤仔细吹打管底和沉淀所在的侧壁涮洗溶解质粒。 7. 加入0.7 ml 溶液P1完全溶解沉淀团块，注意附着在管底和侧壁上的质粒沉淀虽 然可能看不见，也要吹打管底和沉淀所在的侧壁涮洗下来(大质粒可用宽口吸管 轻轻吹打辅助溶解)。然后将质粒溶液转入1个新的1.5 ml离心管中。 可选步骤(一般不需要):如果菌株RNA丰富有微量RNA残留，可在此步骤后 将质粒溶液 60?孵育15 min消化RNA。 8. 加入55μl杂质清除液A，颠倒充分混匀后加入约0.1体积(约80μl)冰预冷的内毒 素清除剂，颠倒旋转7-10次(30秒左右)充分混匀，冰浴或者冰上放置>=5分钟， 中间偶尔颠倒混匀几次。 内毒素清除剂加入上清后，上清会变得浑浊，但是冰浴后应恢复清亮。 注意:如果不需要去内毒素用于转染，可在此步骤只加入55μl杂质清除液A，充 分混匀后冰上放置5分钟，离心后小心取上清转入一个新管，直接接步骤11。 9. 42?水浴，溶液又会变为浑浊，颠倒混匀后42?温育5分钟。 10. 室温14,000 x g离心5 min分相(温度低时，内毒素清除剂无法分相，因此必须 ?以上)。上层水相含DNA，下至少20?以上室温离心或者保证冬季转头温度20 层蓝色油状相含内毒素和其它杂质。将含DNA的上层水相转移到新管(注意不 要吸到蓝色油状层，里面含内毒素等杂质)，弃油状层。 溶液必须分为上下两相，否则应重复步骤9-10。 11. 将上一步所得上层水相中加入等体积杂质清除液B(约750μl)，轻柔混匀，4? 14,000 x g离心10 min，弃上清(注意不要丢失DNA)，轻轻加入1 ml 70%乙醇 洗涤，离心弃上清，共两次，室温倒置晾干5~10 min使乙醇完全挥发。 12. 加适量TE或者纯水(50~100μl)溶解沉淀(可在37?水浴中振荡以辅助溶解)。 要注意很多质粒DNA可能附着在离心管侧壁上，即使看不见，也应该充分吹打 侧壁溶解回收质粒DNA。 最后沉淀可以根据需要选择任意小体积溶解，这样可以得到很高浓度的转染级质 粒DNA(高达5-10μg/μl)。如果有需要，客户也可以选择更大体积溶解。