噬菌蛭弧菌分子生物学特性的研

噬菌蛭弧菌分子生物学特性的研 噬菌蛭弧菌分子生物学特性的研究 中国医学细菌中心弧菌噬菌体研究室 秦生巨 一、前言 噬菌蛭弧菌(Bdellovibrio bacteriovorus,以下简称蛭弧菌)是60 [1]年代中期Stolp 等发现的一类细菌寄生菌。它比通常的细菌要小，有似细菌病毒(噬菌体)的作用，但不是病毒，具有细菌的特性。“寄生”和“裂解(溶菌)”宿主细菌是蛭弧菌独特的生物学特性。这一生物学特性引起了人们极大的兴趣和关注。20多年来，美国、苏联、日本、法国、以色列、印度等30多个国家和地区的许多实验室对这类菌进行了研究。1982年，秦生巨等在我国首次发现并及时报道了对蛭弧菌的研究。自从蛭弧菌发现以来，国内外许多研究人员对蛭弧菌的生物学、生态学、生理学、分类学、生物化学、分子生物学及其与生物间的拮抗作用进行了研究。特别是70年代后期，对蛭弧菌分子生物学方面的研究更为广泛和细致，发现蛭弧菌在分子生物学方面亦具有许多独特的特性:蛭弧菌不能利用碳水化合物，但分解蛋白质的能力极强，它是利用多肽及氨基酸作为能源和碳源的;蛭弧菌生长代谢过程中乙醛酸循环不明显，以不完全的三羧酸循环为主要代谢途径;蛭弧菌蛋白质含量极为丰富，可达干重的60%~65%，DNA含量为5%，含有典型的嘌呤和嘧啶;蛭弧菌DNA合成的前体物质，全部来自宿主菌细胞，大约70%来源于宿主DNA，30%来源于RNA;蛭弧菌可直接利用单核苷酸作前体物质，合成其核酸;蛭弧菌γATP(每消耗1g ATP所得细胞千重)值高达20%~30%;蛭弧菌在吸附、侵染、穿入等的整个生命周期中，需要多种酶类的参加;蛭弧 菌的鞭毛，粗且带鞘，早期有人认为，鞭毛鞘是由细胞壁外膜组成，对尿素十分敏感。近年来，许多实验室对蛭弧菌的噬菌特性以及利用蛭弧菌清除自然环境河水中的某些肠道致病菌方面，做了许多卓有成效的探索工作。目前已证实，蛭弧菌对沙门菌属、志贺菌属、埃希菌属、假单胞菌属、欧文菌属、变形杆菌属、弧菌属等均有很高的裂解活性，特别是对沙门菌属和志贺菌属。进一步研究发现，蛭弧菌对自然河水中的E 霍乱弧菌、不凝集弧菌、伤寒沙门菌、大肠杆菌、细菌总数、浮游lTor 球衣菌、大肠菌群等均有显著的净化作用。本文就蛭弧菌的形态结构、化学组分、能量代谢、生命周期以及蛭弧菌生物拮抗作用等方面的研究阐述如下。 二、 蛭弧菌的形态 (一)一般形态 蛭弧菌革兰染色，于普通光学显微镜下呈阴性弧、杆菌。相差显微镜下，可见到蛭弧菌积极追捕宿主呈跳跃式的运动。电子显微镜观察、蛭弧菌以弧、杆状为主(图1)。其菌体长约为0.8~1.2μm,宽约为0.25~0.40μm。菌体一端附着一根端生鞭毛，极少数有2~3根。蛭弧菌的鞭毛比其它细菌鞭毛为粗，直径约为21~28nm，长一般为菌体的10~40倍，通常呈波状。靠近菌体的最初3个“波段”的“波长”递减，远端“波段”的“波长”相当稳定。这种结构与其侵袭功能直接相关，并被认为是蛭弧菌的又一特征。Shilo等发现，与蛭弧菌鞭毛相对的菌体另一端(头部)有钉状的纤毛结构存在，通常2~3根，最多可有6根，纤毛直径为4.5~10nm，长为0.8~1.5μm，呈直线形或三角弯曲状。 图(1)蛭弧菌Bd39电镜照片 蛭弧菌的形状结构，不同菌株各有差异。而且培养基的选择及培养条件许多因素均可影响蛭弧菌形态特征的发育。 (二)超微结构 蛭弧菌细胞壁通常有内外两层组成，内层覆于细胞膜，其上有数个分散的颗粒，直径约为6~10 nm。蛭弧菌胞浆中常可观察到致密小体，长约150~300nm，宽约70~120nm，呈片状结构，据推测这可能是细胞膜内陷而形成的。核区非常明显，周围包绕着数个核糖体颗粒。在蛭弧菌的菌体中还可见到间体及其他许多内含物，有人认为间体的存在与蛭弧菌附着宿主有关。 当蛭弧菌在深红红螺菌中生长发育时，常见形成异形结构的“孢囊体”，长约为1.2µm，宽约为0.6µm，孢囊体外壁和内膜都很厚，外壁可厚达30~40nm。 蛭弧菌的鞭毛结构是独特的，它由鞭毛鞘和轴心组成，鞘壁厚约 [3]7.5nm，轴心直径约13nm。Abram等早期认为，蛭弧菌的鞭毛鞘是由细胞壁外膜延伸而组成的，但是当6 mol/L尿素存在时，鞭毛鞘极易被溶 解破坏，而细胞壁不受影响。推测组成鞭毛鞘的物质可能对尿素比较敏感，使鞭毛鞘肿胀，直至破裂。有人认为，蛭弧菌鞭毛的结构与其他革兰阴性细菌的鞭毛结构基本相似，但至今尚未发现蛭弧菌鞭毛基部有类似于其他革兰阴性菌鞭毛基部所具有的L环结构(图3)。 图3 蛭弧菌鞭毛基部L环结构模式 蛭弧菌的纤毛基部起源于细胞膜，有6~12个环状结构，有的分散，有的成簇集结在一起。有人称这一结构为“感染锥子”或“吸附器(固着器)”。这一结构的存在，与蛭弧菌的寄生特性有关，对蛭弧菌进入宿主细胞时机械性钻孔也有积极作用。 三、蛭弧菌的化学组成 蛭弧菌具有典形的革兰阴性细胞的化学组分。在这之前，曾有人误认为蛭弧菌细胞中不存在肽聚糖。Tinelli等研究报道，蛭弧菌和其他革兰阴性细胞一样，含有典型的肽聚糖成分，并测得蛭弧菌的肽聚糖成分由胞壁酸、葡萄糖胺及其他13种氨基酸组成，同其他原核细胞壁肽 聚糖组分和结构类似，其甘氨酸:谷氨酸二异丙基氟磷酸:胞壁酸:谷氨酰肽比例为2:1:1:1:1。在腐生的蛭弧菌中分离到核糖及rRNA，Bd6-5-S在蛀螺菌中繁殖，则可产生含有氨基糖和可溶性胞壁酸的亚微粒子。Murray报到，锌离子对蛭弧菌细胞壁及细胞膜结构的稳定性很重要，在缺乏锌离子的情况下，细胞壁将会变得十分疏松。蛭弧菌细胞膜的研究发现，其甘油磷脂成分主要是由磷脂酸乙醇胺和磷脂酰甘油组成，他们中主要成分为15碳支链脂肪酸。外膜中的类脂A是利用宿主细胞的类脂A，并经过一定的修饰，插入自身细胞的脂多糖结构而形成。脂多糖主要是由葡萄糖、宕藻聚糖、十九烷酸组成。此外，还含有一些其他脂肪酸、戊糖、酮脱氧锌酸及磷脂。在蛭弧菌外膜中存在类OmpF蛋白。 蛭弧菌的蛋白质含量丰富，可达细胞干重的60%~65%，DNA的含量为5%，含有典型的嘌呤和嘧啶，DNA的G+C比例，大多数菌株为50.2?0.8%~50.8?0.9%，兼性寄生蛭弧菌DNA的G+C比例较低，为42.7?1.0%~42.8?0.9%。以蛭弧菌Bd109为例，蛭弧菌中主要大分子物质的比例见 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 1。在蛭弧菌BdA3.12和Bd109中，发现脱氧胞苷酸、尿苷酸、核糖、腺膘呤和鸟嘌呤。到目前为止，除了蛭弧菌DNA的基因位置和装配结构尚不清楚外，还尚未发现蛭弧菌DNA结构成分的特殊性。 表1 蛭弧菌109和大肠杆菌ML35大分子及含量 成分 蛭弧菌 大肠杆菌 1010µg/10细胞 千重,%, µg/10细胞 千重,%, 蛋白质 320 54 2200 54 RNA 100 17 830 21 DNA 65 11 110 2.8 脂类 880 14 320 8 多糖 20 3.4 240 6 肽葡聚糖 5 0.8 40 1 干重 590 4000 [2] Thomashow报道,蛭弧菌鞭毛主要是由蛋白质、磷脂和脂多糖组成,其鞭毛轴心由多肽组成。鞭毛鞘易溶于Triton X-100。蛭弧菌鞭毛鞘不同于细胞外膜，具有特殊的生化性质，有鞭毛磷脂高达54%~58%，蛋白质的含量仅为23%~28%。与典型的细胞外膜的磷脂、蛋白质的含量有明显差异。这种高磷脂/蛋白质的比率揭示鞭毛鞘中具有磷脂双层结构。同时，与细胞膜的磷脂双层结构相比，具有较大的“流动”性，这可能为鞭毛的运动功能提供了物质结构基础。组成鞭毛轴心的多肽主要由分子量为28kDa和29.5kDa的亚基组成，28kDa亚基位于菌体近端，29.5 kDa亚基位于菌体远端。 蛭弧菌Bd.bdukiz的研究中，发现含有磷脂，其脂质中有的鞘脂类是其它细菌研究中极为罕见的。 四、蛭弧菌的菌能量代谢 蛭弧菌严格耗氧，在宿主细胞中生长，所需氧压在533Pa以下，其 -12呼吸率为20×10m1O/细胞(35?，1h)。当蛭弧菌裂解菌体时，呼吸2 相应的增高。精氧酸、谷氧酸等氨基酸对呼吸有明显的促进作用。蛭弧菌在综合培养基上能产生细胞色素a(吸收峰605nm)、b(吸收峰559、528、426nm)、c(吸收峰522、524nm)。BdA3.12细胞色素c的索瑞带的 吸收峰在607nm,其余在421~423之间。蛭弧菌Bd6-5-S含有烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)、烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸(DNAPH)细胞色素氧22化酶，DADH氧化酶的氧化率为DNDPH氧化酶的2倍。NADH氧化酶活性222受氰化钾和叠氮钠所抑制，但不能被鱼藤酮及4:1一氧化碳和氧气混合物所抑制。NADH氧化酶不受上述任何抑制剂的抑制。在蛭弧菌Bd6-2 -5-S抽提物中，谷氨酸、α酮戊二酸、琥珀酸、延胡索酸、苹果酸、丙 -酮酸、乙酸、α磷酸甘油、烟酰胺腺呤核苷酸及烟酰胺腺嘌呤核苷磷酸不改变耗氧量，但NADH及NADPH与耗氧量有关。 22 有人报道，在细胞抽屉提物的微粒中存在三磷酸腺苷酶(ATP酶)， 32同时还存在催化ATP与P相互转换的酶类物质。由于砷化物、叠氮化合物和2，4-二硝基苯酚对这种转换无抑制作用，因此，这种转换途径 2可能受氨基酸氧化所催化。氧化NADPH可能有两种途径:?由黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)或黄素单核苷酸(FMN)所刺激，产生过氧化氢，对氰化钾不敏感;?通过细胞色素产生过氧化氢，对氰化钾敏感。研究中发现，有些蛭弧菌含有丰富的触酶，但不是所有蛭弧菌都含有触酶。 - 蛭弧菌Bd6-5-S中含有三羧酸循环所需的异柠檬脱氢酶，α酮戊二酸脱氢酶、延胡索酸水解酶、苹果酸脱氢酶及琥珀酸脱氢酶等。但未发现其糖酵解途径，不能利用碳水化合物及乙醇。蛋白质、多肽、氨基酸及核酸是主要的碳源和能量来源。Mitchel发现，一株海洋蛭弧菌可 [5]利用宿主——大肠杆菌细胞壁为唯一的碳源。Seidler等检查了7株蛭弧菌，结果发现这些菌株都含有丙氨酸、谷氨酸、苹果酸，异柠檬酸脱氢酶、延胡索酸水解酶、腺苷酸激酶、醌还原酶以及四唑氧化酶。但 不同的菌株所含的酶类具有不同的理化性质，这一结果用于蛭弧菌分类是实际指导意义的。 [10]14 Rittenberg等通过U-C标记宿主细胞，测得蛭弧菌在细胞内生长时rATP值为18.5~25.9。一般细菌rATP值为10。达到这样高效果的部分原因，是因为蛭弧菌具有直接从宿主细胞吸收核苷酸的能力。因而贮存了高能磷酸键。在电子转运系统中，每对电子转运产生了3分子ATP(P/O值为3)，底物磷酸化作用几乎可以忽略，主要是三羧酸循环及电子转运系统中产能。但其中还是含有低水平的糖酵解酶。在蛭弧菌能量代谢过程中，ATP酶是起主要作用的，约60%~80%存在于可溶成分中，对二环已基碳二亚胺(DCCI)敏感，能被其抑制，细胞膜上的ATP酶对DCCI具有抗性，参与蛭弧菌氨基酸及磷酸的转运，对DCCI的抗性主要是由于ATP酶与膜连接后产生的。 [6] Hespll等对蛭弧菌三羧酸循环及糖酵解途径中各种酶活性进行了 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 (表2)。最初糖酵酶活性与大肠杆菌及蛭弧菌Bd109中的三羧酸循环中的酶活性相关。当蛭弧菌进入宿主细胞90min时，三羧酸循环中的酶活性增加约10%，而糖酵解酶活性下降25%~60%;110~180min时，三羧酸循环酶的活性增加50%~60%，而糖酵解酶下降到接近0。而磷酸葡萄糖异构酶及甘油醛磷酸脱氢酶的活性较高。由于蛭弧菌严重耗氧，因此这二种酶可能与蛭弧菌生物合成有关，而并非是用于能量代谢。 表2 蛭弧菌Bd109和大肠杆菌ML35细胞提取液中酶的活性 大肠杆菌 蛭弧菌 酶的种类 需氧 厌氧 需氧 葡糖激酶 48 50 2.4 磷酸葡糖异构酶 42 204 109 磷酸果糖激酶 77 212 13 果糖磷酸醛缩酶 142 198 9.5 磷酸丙糖异构酶 141 177 33 甘油醛磷酸脱氢酶 944 1193 690 丙酮酸激酶 345 190 7.5 柠檬酸合酶 1467 86 3360 异柠檬酸脱氢酶 305 25 893 延胡索酸酶 158 - - 苹果酸脱氢酶 5597 52 2200 ß-半乳糖苷酶 3100 2810 - 五、蛭弧菌的生命周期 蛭弧菌为细胞内寄生菌，整个生活周期可分为:识别、侵染、吸附(攻击);穿入宿主细胞、生长发育、裂解宿主、释放子代蛭弧菌(图4)。 图4 蛭弧菌生活周期模式,本图引自:Philp H,1980,.J Theor Biol, a:蛭弧菌侵染宿主细胞,b:穿入宿主细胞壁,c:进入宿主细胞质～鞭毛脱落, d:蛭弧菌在此摄取营养～经过1到数小时生长～蛭弧菌小体延长,e-f:蛭弧菌生长分化～鞭毛形成,g:宿主细胞裂解～子代蛭弧菌释放,α-ε:蛭弧菌腐生生活周期 (一) 识别宿主 蛭弧菌的化学趋避运动是识别宿主菌细胞的重要方式，当蛭弧菌从宿主细胞内释放之后，处于极度的饥饿状态，约50%在10 h内失活，但当有能源及碳源存在时，其存活略有提高。如培养液中宿主细胞含量在 51.5×10个/ml时，蛭弧菌50%以上通过自由碰撞吸附于宿主细胞上。进一步研究发现，蛭弧菌并非是运用化学趋避性直接感染宿主的，而是蛭弧菌在含有L-天氡氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酸、L-组氨酸、L-赖氨酸及L-苏氨酸等氨基酸及化合物的环境中，通过化学趋向运动，寻找碳源和能源，缓和“饥饿”状态，这样蛭弧菌在其宿主菌所需的营养物质周围集聚，而宿主菌也向其营养物质接近，局部环境中的宿主菌浓度升高，因此，蛭弧菌增加了对宿主侵染和吸附的机会。 (二) 吸附 一般来说，开始时蛭弧菌与宿主细胞激烈碰撞，以没有鞭毛的一端(头部)直接吸附到宿主细胞上，头部与宿主通过一系列的反应，菌体也高速转动，速率100r/s以上，在此之后，蛭弧菌通过宿主细胞的细孔(附着位点)进到细胞壁和细胞膜之间，或直接进入细胞质中。侵入过程非常快，几秒种内即可完成。有时可有很多个蛭弧菌同时吸附于同一宿主，有人发现，蛭弧菌吸附宿主是可逆的。蛭弧菌与宿主菌的比例在1:10~100时，蛭弧菌吸附率最高。早期研究认为，蛭弧菌仅仅对生活的革兰阴性宿主细胞有吸附能力，进一步研究发现，蛭弧菌对死的宿主菌和革兰阳性菌同样有吸附作用，但吸附率较低。秦生巨等近来研究发现，蛭弧菌对热死(100?、80?、15min)或三氯甲烷处理致死的宿主细胞吸附略著高于对活菌的吸附率，前者是后者的35-265倍。原因 尚不完全清楚，有待进一步研究。但Murray报道，去掉宿主细胞壁外层结构，有利于蛭弧菌的吸附。因此推断，其外层结构中具有防御蛭弧菌侵入的物质，加热或三氯甲烷处理宿主可能使这些天然屏障被破坏。目前已知蛭弧菌的吸附作用受pH值、O压、温度等许多环境条件的影2 响。有人推测蛭弧菌吸附于宿主菌时，它们之间存在一个“连接键”， ,,,由特定的“吸附器(固着器)”所介导。Varon等报道，蛭弧菌Bd109、BdGB对大肠杆菌和鼠伤寒沙门菌突变株(含有核心抗原，缺乏O抗原侧链)的吸附比对它们的野生株更容易。但抗原缺乏过多，其吸附能力却减弱。他们认为在宿主菌中存在吸附“受体”，位于R抗原中。但H ,8,uang重复了这项研究，并未能得到类似结果。Schelling等进一步的研究发现，蛭弧菌对宿主的吸附性确实存在受体，他认为“受体”存在于宿主细胞壁脂多糖中的核心多糖上，与O侧链无关，但Bd.bukiz的吸附识别反应不需要宿主脂多糖参与。 (三)穿入 蛭弧菌吸附宿主细胞之后，几分钟内就可破坏细胞壁，穿入宿主细胞，此时鞭毛消失，整个过程最长为60min，穿入方式:?有人认为，由于蛭弧菌高速运转，使得蛭弧菌在宿主细胞壁上机械打孔穿入细胞 [9]壁。其动力主要来源于特殊的鞭毛结构。Burnhgm报道，蛭弧菌在穿入前，宿主细胞的吸附附着位点在细胞内压力作用下使局部凸起，蛭弧菌在自身动力的驱使下，首先进入凸出部分，破坏细胞壁，进入宿主细胞。亦有人认为，蛭弧菌吸附宿主细胞后，在细胞壁上钻孔，头部与宿主原生物质体连接在一起，宿主细胞壁结构遭到破坏，导致内外渗透压 的平衡失调，从而引起宿主壁及原生质体的膨胀，最后导致蛭弧菌在吸附位点细胞壁与原生质体紧密结合，这时，整个蛭弧菌菌体被动地进入膨胀的细胞壁与原生质之间(周质)。完成穿入过程。?有人发现，用蛋白质合成抑制剂，如链霉素、嘌呤素及氯霉素等，可抑制蛭弧菌的穿入。据此认为，蛭弧菌穿入时宿主细胞壁破坏还有诱导酶的产生，诱导物存在于宿主细胞内。当蛭弧菌吸附于宿主细胞壁。Fackeell等报到，蛭弧菌穿入宿主细胞时，至少有溶菌酶、胞壁酸酶及酯酶等，Bd6-5-S还可释放两种多肽酶，分子分量为40kDa及100kDa。Michael等研究证明，当蛭弧菌穿入宿主时，聚糖酶及多肽酶的活性很高，短时间内溶解宿主菌10%~15%的肽聚糖。聚糖酶溶解肽聚糖中的氨基糖，多肽酶水解肽聚糖中的二氨基庚二酸、大约30%二氨基庚二酸残基被水解。穿入过程结束时，这两种酶的活性明显降低或消失。与此同时在脂多糖中25%的葡萄糖胺被一种分子量小于2kDa的酶水解，该酶在穿入结束时，也不起任何作用。为此，许多人认为，酶是蛭弧菌穿入宿主细胞壁的主要因子。 作者认为，蛭弧菌穿入宿主的机制是极为复杂的，可能是多种因素联合作用的结果。 (四)蛭弧菌的生长发育 1、蛭弧菌小体的形成及其特性 蛭弧菌穿入过程完成之后，对宿主细胞的结构进行一系列的修饰和改造，形成一个适合蛭弧菌生长的环境——蛭弧菌小体。当蛭弧菌进入宿主周质间后，宿主细胞肽聚糖的60%~70%的葡萄糖胺及胞壁酸发生去乙酰化作用。从而由对溶菌酶敏感转成不 敏感，保护菌体肽聚糖不被穿入时释放的酶继续破坏。除此之外，宿主菌细胞壁的修饰过程中，还有非蛋白质大分子与肽聚糖共价连接，同时肽聚糖中的Braun脂蛋白大量丢失。蛭弧菌进入周质间，长链脂肪酸(60%棕榈酸、20%油酸)通过羧酯键等联接于宿主肽聚糖上，由于酰化作用的反应，蛭弧菌小体外膜具有更强的抗渗透压的能力，从而起到稳定蛭弧菌小体的作用。另有报到，蛭弧菌进入周质间，除了对宿主肽糖的修饰以外，二氨基庚二酸还可与宿主肽聚糖结合，而赖氨酸、鸟氨酸、胍氨酸和2，4-二氨丁酸则不能发生类似反应。蛭弧菌在大肠杆菌、恶臭假单胞菌、蔓延螺菌中生长时，均发生上述反应。该反应在热死的宿主细胞上仍然能发生，且不受能量产生系统抑剂，蛋白和RNA合成抑制剂及细胞壁合成抑制剂的影响，并且大约1/3的二乙丙基纤维素可与宿主细胞外二乙丙基纤维素交换。推测二乙丙基纤维素的修饰作用是完全由蛭弧菌自身的胞外酶催化的酶促反应来完成的。蛭弧菌还通过自身合成系统对宿主细胞肽聚糖进行修饰、改造，使其更适合自身生长的需要。 蛭弧菌小体有4层特征性的结构:蛭弧菌小体壁;由宿主细胞组成的膜状结构;蛭弧菌细胞壁及细胞膜。这些结构的通透性可调节其内外物交换，与蛭弧菌生长直接相关。 Cover等[22、23]报到，蛭弧菌进入宿主菌60min时，蛭弧菌小体的体积增长到最大，超过底物细胞菌体。这时，蔗糖可任意通过底物细胞，但对寡聚糖有效通过无改变。在蛭弧菌小体细胞中，对亲水分子通透性也无改变。宿主细胞疏水性增高。疏水性的增加受到氯霉素的抑制，这与蛭弧菌合成相应的蛋白有关。 在蛭弧菌小体形成初期，外膜蛋白对通透性具有重要的调节作用，Braun，脂蛋白丢失，随后宿主细胞OmpA蛋白也逐步消失，但OmpF蛋白却存在。这些变化，对蛭弧菌代谢过程中物质转换提供了有利的条件。 2、核酸代谢 蛭弧菌在宿主细胞中生长时，可直接利用单体前体物质合成生物大分子，从而大大提高了其生物合成的速度。其核酸的合成，是直接利用单核苷酸作前体物质开始合成的途径。Pritchard报到，蛭弧菌Bd109在大肠杆菌周质间生长时，对氨甲喋呤无明显反应，而蛭弧菌Bd109突变株生长在酵母浸膏浸出物，及蛋白胨培养基上的生长率及细胞得量受到氨甲喋呤的强烈抑制;但若培养基中加入胸腺嘧啶，或胸腺嘧啶核苷，或5’-P-胸苷时，其抑制作用消失。大肠杆菌在缺乏四氢叶酸时，受氨甲喋呤的影响，产生异常高的蛋白/DNA比率。蛭弧菌在此宿主上生长细胞得量显著减少，但总的DNA量高于大肠杆菌中DNA的量。5’-P-胸苷可以除去上述抑制作用;同时，蛭弧菌也存在着胸腺嘧啶脱氧核苷酸合成酶、胸腺嘧啶核苷磷酸及胸腺嘧啶激酶，具有从头合成DNA的潜在能力。Rittenberg研究发现，在宿主细胞周质中生长的蛭弧菌，首先利用宿主内源性磷，尽管外源性磷也进入周质。这一选择性同样适合于脂磷及核酸磷，内源性5’-P-胸苷有效地被蛭弧菌用作DNA合成前体，而外源性的胸腺嘧啶利用率极低，对外源性的胸腺嘧啶及尿嘧啶核苷几乎是不利用。而对外源性的5-磷酸单核苷酸可直接用于蛭弧菌核酸的生物合成，宿主细胞核酸中的高能磷酸键的能量保存于蛭弧菌中，供其生长代谢需要。 14 通过[2-C]标记尿嘧啶检查，发现50%标记物掺入蛭弧菌核酸，剩 下的部分以核酸碱基形式释放，宿主大肠杆菌50S及30S的核糖体及23S和16S的核糖体核酸在90min内几乎全部降解，90min后蛭弧菌RNA开始合成，其活性及标记物在碱基中的比例与宿主菌核酸相似。蛭弧菌DNA中的放射性标记量高于大肠杆菌，而且它们的胞嘧啶与胸腺嘧啶比例不变。当加入外源性的单磷酸核苷酸后，放射性掺入蛭弧菌量明显降低。加入核苷酸及碱基不影响蛭弧菌中放射性掺入量。从而说明，蛭弧菌RNA的合成，主要是通过降解宿主细胞RNA成单核苷酸后而以其作为前体物质开始的，并且宿主的RNA降解物可作为蛭弧菌DNA合成的前体物质。 [18、19]14Rosson等报道，蛭弧菌生长于[2-C]标记DNA的大肠杆菌周质中，约30%的放射性以单磷酸核苷及碱基形式释放到培养基中，其余掺入蛭弧菌，在60min时，仅10%的大肠杆菌DNA被溶解，其余DNA被降解成0.5Mda的片断并入蛭弧菌小体中,先形成单链,然后形成双链DNA片断。蛭弧菌DNA的合成前体物质，大约70%来源于宿主菌的DNA，30%来源于宿主菌的RNA。进一步研究证明，宿主菌DNA的降解及溶解主要是由蛭弧菌合成的DNA酶所致。 [11、12、17]Hespell等对RNA的代谢过程进行了深入的研究，认为蛭弧菌在周质中生长时，利用宿主菌的RNA合成自身的RNA及DNA，同时约20%~40%的RNA降解成碱基及核糖-1-磷酸残基。核糖-1-磷酸进一步为蛭弧菌所代谢，作为能量的来源，及非核酸性细胞成分的生物合成的底物。在必要时，核糖也可用于其单磷枝核苷的合成。 由于蛭弧菌在缺乏四氢叶酸的大肠杆菌中生长时，蛭弧菌子代细胞 DNA的总量高于宿主大肠杆菌DNA的总量;蛭弧菌突变株在酵母浸出物及蛋白胨培养基上生长时，受到氨甲喋呤的强烈抑制。因此认为，在蛭弧菌中可能存在从小分子合成单体前体物质，然后再合成DNA的途径，甚至存在全新的合成脱氧胸腺嘧啶核苷酸的途径。Rosson在研究中发现，蛭弧菌能够使嘧啶相互转化，并且合成5’-三磷酸嘧啶核苷酸，其途径与肠道菌相似，蛭弧菌在宿主细胞周质中生长与其突变株在培养基上生长时，这一途径略有差异。现已查明，由5’-单核苷酸形成三磷酸核苷酸的酶浓度很高。并且，所有催化胸腺嘧啶补救途径的酶(除胸腺嘧啶激酶之外)均在野生菌株中存在。通过代谢抑制的实验观察，确立了蛭弧菌嘧啶代谢的途径(图6)，并发现几乎蛭弧菌所有的非来源于底物细胞的DNA均来源于底物细胞的RNA。但没有发现从氨基酸直接开始合成嘧啶的途径。然而到目前为止，尚没有足够的证据否定这种途径的存在。 图6 蛭弧菌的嘧啶代谢途径 此图为大肠杆菌、沙门菌的嘧啶代谢全过程。图中附有数字箭头表示蛭弧菌嘧啶代谢过程中已证实同样存在此途径～相同的数字表示酶相同,空箭头表示蛭弧菌嘧啶过程中可能存在的途径～但未被证实。酶:1、胸苷合成酶,2、胸苷磷酸化酶,3、胸苷激酶,4、脱氧胸苷酸激酶,5、二磷酸核苷激酶,6、胞苷脱氧酶,7、尿苷磷酸化酶,8、尿苷激酶,9、尿苷一磷酸焦磷酸化酶,10、核苷二磷酸还原酶。dR-1-P脱氧核糖1-磷酸, T胸腺嘧啶,TdR脱氧胸苷,U:尿苷,UdR脱氧尿苷,UR尿嘧啶,CR胞苷,CdR脱氧胞苷 [24，38，41]Rudy对单核苷酸的转运作了专门的研究，结果证明，蛭弧菌在侵入宿主细胞前后，均能有效地转运单核苷酸，转运机制相同。耗能主动转运单核苷酸是蛭弧菌固有的途径，并非进入周质后而形成的。 3、其它大分子的合成 蛭弧菌在周质中生长，其核酸蛋白质、脂类等均 [1是主要从底物细胞同类大分子的降解单体开始合成的。Rittenberg等0]认为，底物细胞的肽聚糖不能用于合成蛭弧菌的肽聚糖，而是用于维持蛭弧菌小体的稳定，蛭弧菌肽聚糖的合成是由小分子开始的。此外，蛭弧菌的其它一些部分合成如下。 (1)脂多糖的合成:在非周质中生长的蛭弧菌的脂多糖，是由葡萄糖、中性糖、岩藻糖胺、氨基糖、十九烷酸及其它脂肪酸、戊糖、酮脱氧辛酸、磷酸等组成。在周质中生长的蛭弧菌，其脂多糖的组成兼有非周质中生长的蛭弧菌脂多糖及宿主大肠杆菌脂多糖的特性。由宿主细胞脂多糖来源的各种脂肪酸占蛭弧菌脂多糖脂肪酸的大部分，并且两者脂多糖中的脂肪酸比例相等。蛭弧菌从宿主细胞脂多糖中获得的葡萄胺占其脂多糖总已糖胺残基的1/3，然而大肠杆菌脂多糖中的核心抗原及O抗原在蛭弧菌中未检出。因此有人提出，蛭弧菌脂多糖中的类脂A直接来源于宿主细胞。当蛭弧菌依次在两个不同的宿主细胞中生长时，这两个宿主细胞脂多糖中的类脂A的主要成分。有人重复了上述实验，也证明了上述的观点，宿主来源于类脂A完全可以掺入蛭弧菌的脂多糖结构。从于大肠杆菌周质中生长的蛭弧菌脂多糖中分离到的类脂A具有两种Rf值，一种与大肠杆菌脂多糖中的类脂A相同(Rf1);另一种与在非周质间生长的蛭弧菌类脂A Rf值相同(Rf2)。说明在周质中生长的 蛭弧菌的类脂A 部分由宿主菌来源，且结构没有发生明显改变。但两种Rf值的类脂A均含有来源于宿主细胞的葡萄糖胺。Rf1的类脂A中的脂肪酸约65%来源于宿主菌的类脂A;Rf2的类脂A中的脂肪酸60%是蛭弧菌自身合成。来源于宿主细胞的脂肪酸N-酰基及O-酰基键分布与其类脂A中该键的分布相同。据此可知，在周质中生长的蛭弧菌的类脂A，一部分是自身合成;一部分是由宿主菌细胞直接提供。在掺入蛭弧菌的过程中，二糖单位及N-、O-、酰基键不发生改变。这为进一步详细阐明蛭弧菌脂多糖的合成提供了实验依据。 (2)外膜蛋白OmpF的合成:蛭弧菌是否能合成OmpF，长期以来一直是个有争议的问题。Fairbands等认为，蛭弧菌在周期中生长时，直接利用宿主菌中的外膜蛋白“蛋白I”或“矩阵蛋白”掺入蛭弧菌外膜。Diredrich等认为，掺入的是宿主菌细胞的OmpF蛋白或OmpC蛋白(缺乏OmpF时)。Bachmann等实验发现，“蛋白I”或所谓“矩阵蛋白”由OmpF及OmpC组成。Guerrini等用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验分析了蛭弧菌中的外膜蛋白情况。结果为:当宿主细胞中含有OmpF时，其周质中生长的蛭弧菌也具有OmpF电泳谱，当宿主中不含有OmpF谱带。因此，他们推断蛭弧菌的外膜蛋白直接存在于宿主细胞。Guerrini等认为，蛭弧菌缺乏编码膜蛋白(MP)的基因。Diredrich等发现，蛭弧菌可生长于缺乏OmpF的宿主细胞。从而认为，OmpF对蛭弧菌的生活周期并不重要。 [25]Rayner等通过详细的实验研究发现，用三硝基甲苯X-100(Triton X-100)处理生长于含有OmpF的大肠杆菌周质的蛭弧菌外膜，在蛭 弧菌中含有一迁移率(SDS-丙烯胺梯度凝胶电泳)几乎与大肠杆菌OmpF相同的OmpF蛋白。当凝胶中加入尿素后，两者迁移率同。但他们同时在缺乏OmpF的宿主细胞中生长的蛭弧菌及非周质中生长的蛭弧菌的外膜中发现了蛋白，而且多肽谱与大肠杆菌的OmpF的多肽谱无同源性。因此，他们认为蛭弧菌自身可以合成OmpF蛋白。具体合成步骤至今尚不清楚有待于进一步探讨。 [15，16，26](3)关于蛭弧菌大分子的生物合成:Thomaschow等指出，生活于周质间的蛭弧菌多聚体的合成，主要是通过降解宿主细胞相应的大分子成为单体，然后直接不变地或改变很少地掺入蛭弧菌，用于其生物大分子的合成。这样，大大节省了合成所需的能量，为蛭弧菌高效生长提供了物质基础。 (4)蛭弧菌的成熟与分裂:当蛭弧菌进入宿主细胞之后，进行了一系列的生理形态变化:鞭毛消失;菌体延长。当蛭弧菌在宿主中生长后期，菌体成熟，鞭毛重新形成，多个子代蛭弧菌形成。 Ruby等到、将蛭弧菌小体用EDTA(乙二胺四乙酸)及菌体裂解酶处理，使蛭弧菌释放。当蛭弧菌释放时，所有的DNA合成停止，分化成具有侵染力的子代蛭弧菌。蛭弧菌在侵入宿主后约60min，由起动信号开始其DNA合成，在每个DNA合成周期结束后，由宿主菌的另一信号启动第二轮DNA合成。子代蛭弧菌DNA合成后，随着其它大分子的合成，装配分化成多个子代蛭弧菌细胞。研究中发现，生长期的蛭弧菌具有很强的适应性，在任何时候都可以分化，不需要外源性的碳源和能源，完全是依赖蛭弧菌自身。蛭弧菌正常的周质生长期是在其“调节”物质耗 尽时开始的。 (五)宿主细胞的裂解 蛭弧菌对宿主细胞的裂解特性，长时间以来，一直被人们关注。对 [15，1蛭弧菌的裂解机制也进行了大量的研究工作。1978年Thomashow等6]提出的“蛭弧菌穿入、稳定、裂解”模型较有代表性。参与这一过程的主要酶包括:聚糖酶，蛋白酶，N-脱酰基酶、酰基转移酶，Braun去脂蛋白酶(可能是蛋白酶)，裂解经修饰的肽糖酶，脂酶，溶菌酶等。 聚糖酶及脂蛋白酶只是在蛭弧菌“穿入”时有活性，而蛋白酶在蛭弧菌的大部分生活期间有活性，但活力不断下降。这三种酶在蛭弧菌“钻孔”中起了作用。N-脱酰基酶、酰基转移酶的作用是维持蛭弧菌小体的稳定，能使之抗渗透压，不被破坏。去Braun脂蛋白酶主要是通过修饰底物细胞壁，使聚糖酶作用消失，而完成这一功能。当蛭弧菌在周质中生长时成熟后，蛭弧菌合成一种新的酶，其功能是完全裂解修饰的肽聚糖，其作用位点于肽聚糖中不可缺少的氨基糖连接键。从而释放子代蛭弧菌。 六、蛭弧菌突变菌株的研究 早期研究认为，蛭弧菌是胞内寄生物。1975年Starr指出，蛭弧菌与宿主细胞不仅仅是寄生的关系，而且还存在共同生的关系。并且发现蛭弧菌存在依赖于宿主菌生长和非依赖宿主菌生长的两种菌株。因此，蛭弧菌可被认为有“依赖共生(S-D)”及“非依赖共生(S-C)”或“非 d+依赖共生条件突变株(S-comp)”两种。非依赖共生条件突变株最早于1963年分离得到，称为“非依赖宿主”菌。然而，这些命名均不能准确 描述蛭弧菌突变株的性质。因为一株“非依赖宿主菌”蛭弧菌可以在无宿主菌细胞的培养基中生长，并不意味着它本身不具备在宿主细胞中生 in长的能力。Varon蛭弧菌突变株新命名方式，把它们分为:?S comp+， ind具有兼性生长特性突变株;?S comp-，非共生性突变株;?S comp-，条件性突变株，在合适的温度环境中，可以不依赖于宿主生长，但在限制温度的环境中，只能在宿主菌细胞内生长。蛭弧菌突变株Bd109J研 dinin究表明，从S comp+中分离出的S突变株大多数为comp+，从S comp inin-中分离到comp-。S comp+在有机培养基中对S comp+的选择不利， d在含有大肠杆菌的缓冲液中对S comp-的选择不利。 Junn等对温度敏感的蛭弧菌Bd109D突变株进行了研究，这些突变 –6-9株通过乙基甲烷磺酸诱变剂处理而获得，回复突变率为10~10。通过电境、温度漂移、一步生长试验、吸附动力及大分子通透性等研究，发现其生活周质中的许多途径被中断。如蛭弧菌Bd109D153推动吸附能力，Bd109D3和Bd109D48不能穿入宿主细胞，Bd109D4和Bd109D152推动在细胞内生长的能力。在限制温度下，Bd109D153尽管仍然高速运转，但对宿主细胞的吸附受到抑制。在38.5?时,蛭弧菌Bd109D153吸附于大肠杆菌宿主细胞壁,同其野生菌株吸附在枯草杆菌(革兰阳性菌,非特异性宿主细胞)上一样,随后不穿入细胞,从其吸附的细胞上脱落.揭示蛭弧菌有早期阶段,存在“两期吸附”的现象。 目前所知，野生菌株几乎都在宿主细胞内生存的。但对其衍生菌株(兼性及不依赖于宿主细胞)的研究，特别是对其突变株的研究用于描述蛭弧菌代谢机制是具有重要的意义和指导实践价值的。 七、蛭弧菌生物拮抗作用的研究 (一) 蛭弧菌的噬菌特性 蛭弧菌在含在特定宿主的双层琼脂平板上，可裂解宿主，形成类似噬菌体的噬斑，现已研究证明，蛭弧菌是一类专门的以捕食细菌为生的寄生物。它可以同时裂解不同科属的革兰阴性细菌的大部分，一些菌株还可以裂解革兰阳性菌。蛭弧菌对沙门菌属等裂解活性很强，司穉东等研究报道，蛭弧菌对沙门菌属、志贺菌属、弧菌属、埃希菌属、假单胞菌属中的24株不同科属细菌的裂解率为75%~99.6%，有部分阳性菌株也可被蛭弧菌裂解，但枯草杆菌不能被蛭弧菌裂解。秦生巨检查了蛭弧菌Bd81、Bd98对69株弧菌(其中包括霍乱弧菌古典型2株;霍乱弧菌E1 Tor生物型57株;不凝集弧菌10株)的裂解作用，结果证明，蛭弧菌Bd81，Bd98对蛭弧菌裂解率分别为81.2%和78.3%。而且还发现，蛭弧菌Bd81、Bd98对57株E1 Tor霍乱弧菌的裂解作用，没有噬菌体型及血清型的选择。秦生巨和解桂如进一步检查了蛭弧菌Bd81、Bd98对206株(其中 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 菌株5株;地方菌株201株)伤寒沙门的裂解效果发现弧菌Bd81、Bd98对206株伤寒沙门菌裂解高达96.6%和99.02%，且对噬菌体型及不同的耐药菌株亦无特殊性的选择。 蛭弧菌不仅对细菌有强力的裂解作用，而且对某些病毒亦有良好的破坏力，对肠道病毒有着很高的裂解活性。有人认为，蛭弧菌不仅与RNA病毒，而且与DNA病毒相互作用后，可导致病毒明显的失活，这一现象很有实践意义。另外，蛭弧菌对植物病原菌同样有着很强的侵染力，如大豆疫假单细胞菌、水稻白叶枯病黄单细胞菌、白菜软腐病菌等有较 强的裂解作用。另据报道，蛭弧菌对鸡白痢病菌感染亦很明显，目前有人试图利用蛭弧菌预防鸡白痢病。秦生巨还报道，蛭弧菌对水生物致病菌也有裂解效果，如蛭弧菌对生产珍珠的河蚌致病菌(嗜水气单细胞菌)裂解率可高达90%以上。为此人们认为，蛭弧菌有可能被用来防治人类、动、植物病菌所带来的危害。 (二) 蛭弧菌对河水中细菌的净化作用 据报到，同时加入沙门菌、志贺菌的河水中，蛭弧菌可显著的影响沙门菌和志贺菌的生存时间。经蛭弧菌作用后，在河水20?和40?时，沙门菌的生存时间为25~37d;志贺菌为19~29d。Lepin等也发现，蛭弧菌对污水中的沙门菌属有重要的消除作用。Venosa报到，蛭弧菌还能清除污水中的浮游球衣菌。秦生巨等在灭菌湖水，模拟自然条件的河水以及自然环境河水中，观察了蛭弧菌对霍乱弧菌、不凝集弧菌、伤寒沙门菌、大肠杆菌、志贺菌等的净化作用。结果证明，蛭弧菌Bd81，Bd98在灭菌湖水中，7d时，可清除湖水中的92.8%~97.4%福氏志贺菌，对照组仅减少20%。在模似自然条件河水中，9d时，蛭弧菌B81可使霍乱弧 7菌由2.5×10/ml减少到363个/ml，而未加蛭弧菌对照组中的霍乱弧菌 74仅由1.7×10个/ml减少到2.0×10个/ml。自然环境河水中，蛭弧菌可使自然河水中的不凝集弧菌与对照组相比较，提前18d消失;实验2 61d时，自然河水中的不凝集弧菌由6.8×10个/ml减少到27个/ml，相 6同时间内，对照组河水中不凝集弧菌仅由4.46×10个/ml相应减少到1. 388×10个/ml。Lambna等报到，苏联普希诺污水处理厂，对蛭弧菌在污水自净过程中的参与作用进行了研究。结果证明，由于蛭弧菌裂解作用， 可降低污水中异养性革兰阴性杆菌及大肠杆菌的数量。但他认为，这种作用受温度的影响，水温在26?时净化效果最佳，目前，已普遍认为，有可能利用蛭弧菌控制或减少致病菌对环境水源的污染，预防一些常见疾病的发生，尤其是肠道传染病的发生和流行，保护人体健康。 (三)蛭弧菌的预防作用 9实验证明，蛭弧菌对动物是不致病的，有人以10个蛭弧菌的剂量对小鼠，豚鼠和家兔等动物无毒性作用;就是用于猴肾、HeLa细胞组织培养亦不引起任何细胞病变。秦生巨等指出，蛭弧菌菌剂外用有预防某些外伤感染及动物角、结膜炎的效果。近来，呼兰、刘秉阳实验证实，蛭弧菌对小鼠角、结膜有保护作用。 八、结束语 蛭弧菌的发现至今已28年了，发表文章500余篇，研究者对它的生物学、生理学、生态学、生物化学、分类学以及蛭弧菌净化环境水源方面进行了大量的研究工作。在分子生物学方面，也进行了许多有成效的研究，并发表论60余篇。近年来，分子生物学特性的研究进展很快，但作者认为，以下两方面问题必须深入研究。一方面，“蛭弧菌-蛭弧菌噬菌体-宿主菌”这一独特的“三位一体”的寄生体系，应引起人们的注意。蛭弧菌噬菌体可以侵染蛭弧菌，并在蛭弧菌体内复制子代;蛭弧菌又可以侵染宿主细胞，同样是在宿主细胞内复制子代。而且已知蛭弧菌DNA的合成80%来自宿主，蛭弧菌噬菌体DNA的合成则全部来自蛭弧菌。这一过程显然是需要分子生物学技术——基因重组。若能利用这一现象，对工业生产及生物制剂的研究可能是有积极意义的，应引起研究 者的重视。另一方面，现已证实，蛭弧菌是自然水体生物净化的极为重 要的生物因子之一。国内外许多实验结果表明，蛭弧菌在实验条件、模 似自然条件和自然环境河水中对许多致病菌有显著清除作用，但是，如 何将蛭弧菌净化水体中致病菌加以推广应用到预防肠道病等实际工作 去，还需进一步探索。目前，国内外已有实验室正在致力于这项研究。 蛭弧菌对致病微生物的作用，不仅局限于人类，对环境水源中的致病微 生物等同样有显著的净化效果。为此，如扩大蛭弧菌的研究范围，尤其 是蛭弧菌在环境保护中的应用，应引起有关部门的重视。 参考文献 [ 1] Stolp H,et al. 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