响应面分析法优化乳酸菌发酵鲢鱼下脚料水解液的研究

响应面分析法优化乳酸菌发酵鲢鱼下脚料水解液的研究 摘要 :采 用 乳 酸菌 (Lactobacillus)发 酵 鲢 鱼 (Hypophthaimichthys molitrix)下 脚 料 水 解液 ，通 过 响 应 面 分 析 (80,、乳酸菌接种量 法优化其最佳的工艺条件。 结果表明，优工艺条件为蔗糖添加量 1 1(97,、发酵温度 42(23 ?、发酵时间 43(04 h，水解液感观评价均值能达到 92(02 分，该水解液具有特殊乳酸发酵香味和风 味，酸度、甜度适中，口感良好。 关键词 :乳酸菌(Lactobacillus);发酵;鲢鱼(Hypophthaimichthys molitrix)下脚料;响应面分析法 中图分类号 :TQ921 ， (3 文献标识码 :A 文章编号 :0439,8114(2013)17,4175-04 Optimization of Lactobacillus Fermentation of the Hydrolysates of Silver Carp By-product by Response Surface Methodology JIANG Sheng,tao 1，2 ，LIN Biao,sheng 1 ，CHEN Li,min 1 ，LAI Xue,lian 1 (1(Longyan University，Longyan 364000，Fujian，China; 2(Ningde Normal University，Ningde 352100，Fujian，China) Abstract: The Lactobacillus fermentation of the hydrolysates of silver carp by -product was studied and the technological conditions were optimized by response surface methodology( The results indicated that the optimal technological conditions were as follows， sugar concentration 1(80, ， seeding amount of Lactobacillus 1(97, ， fermented for 43(04 h under 42(23 ? ， the mean value of sensory estimate was reached 92(02， the flavor of the fermentation liquid was best with peat,reek of lactic acid， and the liquid tasted sweet and sour， very delicate( Key words: Lactobacillus; fermentation; silver carp by-product; response surface methodology湖 北 农 业 科 学 2013 年 乳酸菌(Lactobacillus)是指能发酵糖类主要产 物为乳酸的一类无芽孢、 革兰氏阳性细菌的总称。 乳酸菌能分解食物中的糖类、蛋白质，合成维生素， 对脂肪类化合物也有微弱的分解能力，能提高脂肪 类食物的消化率，促进其消化吸收 ,1, 。 在鱼类加工过程中会产生大量的下脚料，包括 鱼头、鱼尾、鱼骨、鱼鳍等。 据报道，这些下脚料占鱼 总重的 40,,55, ,2, 。 大量的下脚料不仅造成环境的 污染，而且其营养价值也未得到充分利用，因此必 须加强对下脚料有效利用， 提高鱼的附加利用价 值。 下脚料用清水洗净后剪切成小片后用组织捣碎 机捣碎，制备成水解液，经过酸化处理后可以作为 肥料或者饲料添加剂。 水解液的制备可以采用硫酸 等无机酸，也可以采用乳酸等有机酸。 利用有机酸 降低酸度具有更大的优势， 使用时保藏时间较长、 无需中和处理，并且能被土壤利用，可提高饲料的 营养价值且不破坏土壤 ,3, 。 采用乳酸菌发酵鲢鱼 (Hypophthaimichthys molitrix) 下脚料水解液 ， 不仅 能够除去大部分的腥味，赋予水解液特殊的发酵香 味，而且还能增加水解液中的其他风味物质，使鲢 鱼下脚料水解液的整体风味得到了很大改善 ,4, 。 本 研究采用乳酸菌发酵鲢鱼下脚料水解液，通过响应 面分析法优化其发酵工艺条件，为提高鲢鱼等水产 品下脚料产品附加值的研究与开发利用提供参考。 1 材料与方法 1(1 材料 鲢鱼下脚料包括鲢鱼的鱼头、鱼尾、鱼骨、鱼鳍 及剩余的鱼肉等均取自龙岩学院校大门对面的某 酒店。 嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、保 加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)由中国普通 微生物菌种保藏管理中心提供。 嗜热链球菌 MRS 培养基:葡萄糖 5(0 g、牛肉膏 10(0 g、蛋白胨 10(0 g、酵母膏 5(0 g、乙酸钠 5(0 g、柠 檬酸氢二铵 2(0 g、 吐温,80 1(0 mL、 磷酸氢二钾 2(0 g、硫酸镁 0(05 g、硫酸锰 0(2 g、碳酸钙 20.0 g、蒸 馏水 1 000 mL、pH 6(8，固体培养基加 20.0 g 琼脂。 保加利亚乳杆菌培养基:葡萄糖 20(0 g、牛肉膏 (0 g、酵母膏 5(0 g、柠檬酸氢二铵 10(0 g、蛋白胨 10 2(0 g、磷酸氢二钾 2(0 g、吐温,80 1(0 mL、醋酸钠 5(0 g、硫酸镁 0(2 g、硫酸锰 0(2 g、蒸馏水 1 000 mL、pH 6(8，固体培养基加 20.0 g 琼脂。 1(2 方法 2(1 乳酸菌 1(种 的 活 化与 培 养 将保藏于实验室 的嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌，接种于三角瓶液 体培养基中，置于 37 ?培养 18,20 h，待用。 1(2(2 乳酸菌发酵 鲢鱼下脚 料 水 解液 的 工 艺 流 程 鲢鱼下脚料水解液?装入 250 mL 三角瓶中?100 ?水浴锅中杀菌 15 min?冷却至 40 ??加入蔗糖 调节?接种乳酸菌 (1?1 接种嗜热链球菌及保加利 亚乳杆菌)?恒温发酵?灭活?感观评价 程中 各 参 数的 单因素优 化 参照文 1(2(3 工艺流 献,5，6,，对乳酸菌发酵鲢鱼下脚料水解液的工艺 流程各参数进行单因素试验。 蔗糖添加量取 1,、 2,、3,、4,、5,， 乳酸菌接种量 1,、2,、3,、4,、 5,，发酵温度 35、37、39、42、44 ?，发酵时间 24、32、 40、48、56 h，以水解液感观评价为指标，确定较优的 各因素取值范围，用于响应面分析法优化的参数水 平。 感观评价 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 ,7, :总分 100 分，以 10 个学生打分 平均值为准。 色泽:色泽均匀一致;气味:有明显的 发酵乳香气;滋味:酸甜适中;组织状态:表面光滑， 细腻，凝块均匀。 1(2(4 响应面 分 析法优 化 乳 酸菌 发 酵 鲢 鱼 下 脚 料 水解液的工艺流程 在单因素试验的基础上，根据 Box,Benhnken 中心组合试验 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 原理，采用响应面 分析法， 以感官品质作为评价指标， 利用 Design, Expert 7.0 软件在 4 因素 3 水平上对乳酸菌发酵鲢 鱼下脚料水解液的工艺流程中的影响因素蔗糖添 加量、乳酸菌接种量、发酵温度、发酵时间进行优 化，确定最佳的工艺流程 ,8, 。 Box,Benhnken 设计的 因素与水平见表 1。 2 结果与分析 2(1 乳酸菌发酵鲢鱼下脚料水解液的工艺流程单 因素试验结果 2(1(1 蔗糖添 加量 对 水 解液 感 观 评价 的 影响 蔗 所示。 由 糖添加量对水解液感观评价的影响如图 1 图 1 可知，随着蔗糖添加量增大，水解液甜度太高， 综合评分均值降低。蔗糖添加量在 1,,3,时综合评 分均值较高，因此选定这 3 个数值作为响应面分析 法优化的因素水平。 2(1(2 乳 酸菌接 种 量 对 水 解液 感 观 评价 的 影响 乳酸菌接种量对水解液感观评价的影响如图 2 所 示。 由图 2 可知，随着乳酸菌接种量增大，水解液酸 度太高，综合评分均值降低。 乳酸菌接种量在 1,, 3,时综合评分均值较高，因此选定这 3 个数值作为 响应面分析法优化的因素水平。 2(1(3 发酵温 度对 水 解液 感 观 评价 的 影响 发酵 温度对水解液感观评价的影响如图 3 所示。 由图 3 可知，随着发酵温度升高，乳酸菌发酵速度加快，发 酵效果较好， 综合评分均值较高; 但当温度超过 42 ?以后，综合评分均值呈下降趋势，可能是发酵 温度过高，乳酸菌死亡较多。发酵温度在 39、42、44 ? 时综合评分均值较高，因此选定这 3 个数值为响应 面分析法优化的因素水平。 图 2 乳酸菌接种量对水解液感观评价的影响 表 1 Box-Benhnken 设计的因素与水平 水平 -1 0 1 因素 蔗糖添加量(A) % 1 2 3 发酵温度(C) ? 39 42 44 乳酸菌接种量(B) % 1 2 3 发酵时间(D) h 32 40 48 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 感 观 评 价 均 值 / 分 1 2 3 4 5 蔗糖添加量//% 图 1 蔗糖添加量对水解液感观评价的影响 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 感 观 评 价 均 值 / 分 1 2 3 4 5 乳酸菌接种量//% 4176第 17 期 2(1(4 发 酵 时 间 对 水 解液 感 观 评价 的 影响 发酵 时间对水解液感观评价的影响如图 4 所示。 由图 4 可知，随着发酵时间延长，乳酸菌发酵产酸，改善了 水解液风味，综合评分均值增加;但当乳酸菌发酵 时间过长，产酸过多，综合评分均值呈下降趋势。 发 酵时间在 32、40、48 h 时综合评分均值较高，因此选 定这 3 个数值作为响应面分析法优化的因素水平。 2(2 响应面优化试验结果 以综合感观评价为指标进行 Box,Benhnken 设 计结果见表 2 所示。 利用 Design,Expert 7(0 软件进 行回归分析，得到感观评价均值和各因素变量之间 的二元回归方程为:Y,,1 067(803 75，29(760 00×A, 11(052 00×B，38(148 29×C，15(737 04× D，0(720 00× A×B,0(503 00×A×C,0(034 687×A×D，0(615 00×B× C，0(116 56×B×D,0(120 87×C×D,2(352 42×A 2 , 5(377 42×B 2 ,0(393 79×C 2 ,0(125 49×D 2 。 对回归模型进行方程分析， 结果见表 3 所示。 该模型具有统计学意义(P,0(000 1)，失拟项不显著 (P,0(083 4,0(05)，表明回归方程拟合情况好 、误差 小， 能较好地描述各因素与响应值之间的真实关 系，可以利用该方程确定最优的工艺流程。 从各因 素方差分析结果看，对乳酸菌发酵鲢鱼下脚料水解 液的感观评价均值影响大小依次顺序为:发酵时间 (D),发酵温度(C),乳酸菌接种量(B),蔗糖添加量 (A)，其中发酵时间(D)和发酵温度(C)对响应值结 果影响显著，乳酸菌接种量(B)和蔗糖添加量(A)对 表 3 回归模型的方差分析结果 方差来源 模型 A B C D AB AC AD BC BD CD A 2 B 2 C 2 D 2 残差 失拟项 纯误差 总差 平方和 1 181.3 2.67 10.53 54.57 549.05 2.07 6.33 0.31 9.46 3.48 23.38 35.9 187.57 39.29 418.38 57.82 52.99 4.83 1 239.11 自由度 14 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 14 10 4 28 F 20.43 0.65 2.55 13.21 132.94 0.50 1.53 0.075 2.29 0.84 5.66 8.69 45.42 9.51 101.30 4.39 均方 84.38 2.67 10.53 54.57 549.05 2.07 6.33 0.31 9.46 3.48 23.38 35.90 187.57 39.29 418.38 4.13 5.3 1.21 P <0.000 1 0.434 8 0.132 7 0.002 7 <0.000 1 0.490 2 0.236 2 0.788 8 0.152 5 0.374 3 0.032 1 0.010 6 <0.000 1 0.008 1 <0.000 1 0.083 4 显著性 * * * * * * * * 不显著 注:“*”表示差异显著，P,0.05。 表 2 Box-Benhnken 试验设计与结果 试验号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 A 1 0 0 1 -1 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 -1 -1 0 -1 -1 0 0 1 0 0 0 0 -1 B 1 1 -1 0 -1 0 0 -1 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 -1 -1 1 1 0 0 综合评分 80.95 69.79 85.64 72.14 85.82 82.50 91.03 71.09 88.43 85.73 90.58 90.49 80.90 86.59 91.44 78.91 90.03 80.64 68.83 80.64 72.63 80.12 86.14 83.25 83.51 84.14 83.33 88.58 89.76 C 0 0 -1 0 0 -1 0 0 0 -1 0 0 0 1 0 1 0 0 -1 -1 0 -1 1 0 1 1 0 0 1 D 0 -1 0 -1 0 0 0 -1 1 1 0 0 1 0 0 -1 1 0 -1 0 -1 0 1 0 0 0 1 0 0 100 90 80 70 60 50 40 30 20 感 观 评 价 均 值 / 分 35 38 41 44 发酵温度//? 图 3 发酵温度对水解液感观评价的影响 图 4 发酵时间对水解液感观评价的影响 100 90 80 70 60 50 40 感 观 评 价 均 值 / 分 24 32 40 48 56 发酵时间//h 江胜滔等:响应面分析法优化乳酸菌发酵鲢鱼下脚料水解液的研究 4177湖 北 农 业 科 学 2013 年 (下转第 4217 页) 响应值结果影响不显著。 各因素响应面曲面分析结果如图 5 所示。 根据 所得的模型可预测得到最优的乳酸菌发酵鲢鱼下 脚料水解液的感观评价均值最高的工艺条件为:蔗 糖添加量 1(80,、 乳酸菌接种量 1(97,、 发酵温度 42(23 ?、发酵时间 43(04 h，在该条件下感观评价均 值能达到 92(08 分。 分别按上述的最优工艺条件进 行 3 次平行试验，所得的乳酸菌发酵鲢鱼下脚料水 解液的感观评价均值为 92(02 分， 与理论预测值 92(08 分接近，重复性较好，说明响应面优化所得的 工艺条件参数准确、可靠、可行。 3 结论 通过响应面分析法优化了乳酸菌发酵鲢鱼下 脚料水解液的最优工艺流程。 结果表明，在最优工 艺条件蔗糖添加量 1(80,、乳酸菌接种量 1(97,、发 酵温度 42(23 ?、发酵时间 43(04 h 下，水解液感观 评价均值能达到 92(02 分， 该水解液具有特殊乳酸 92 89 86 83 80 感 观 评 价 均 值 / 分 1.0 0.5 0.0 -0.5 -1.0 -1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0 B A (a) 92 89 86 83 80 感 观 评 价 均 值 / 分 1.0 0.5 0.0 -0.5 -1.0 -1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0 C A (b) 92 87 82 77 72 感 观 评 价 均 值 / 分 1.0 0.5 0 -0.5 -1.0 -1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0 D A (c) 92 86 80 74 68 感 观 评 价 均 值 / 分 1.0 0.5 0 -0.5 -1.0 -1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0 D B (e) 92.00 88.25 84.50 80.75 77.00 感 观 评 价 均 值 / 分 1.0 0.5 0.0 -0.5 -1.0 -1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0 C B (d) 92 86 80 74 68 感 观 评 价 均 值 / 分 1.0 0.5 0.0 -0.5 -1.0 -1.0 -0.5 0 0.5 1.0 D C (f) a(蔗糖添加量和乳酸菌接种量对水解液感观评价的影响 ;b(蔗糖添加量和发酵温度对水解 液感观评价的影响;c(蔗糖添加量和发酵时间对 水解液感观评价的影响;d(乳酸菌接种量和发酵温度对水解液感观评价的影响;e(乳酸菌 接种量和发酵时间对水解液感观评价的影响;f(发酵温 度和发酵时间对水解液感观评价的影响 图 5 各因素交互作用响应曲面图 4178第 17 期 发酵香味和风味，酸度、甜度适中，口感良好。 参考文献 : ,1, 朱学伸，甘 泉 ，肖华党 ，等(乳酸在生鲜牛肉加工中的应用 ,J,( 肉类工业，2012(6):38,40( ,2, 龚钢明 ， 顾 慧 ， 蔡宝国 ( 鱼类加工下脚料的资源化与利用途 径,J,( 中国资源综合利用，2003，7(7):23,24( ,3, 卢红梅(鳕鱼下脚料水解液的连续乳酸发酵 ,J,(无锡轻工大学学 报，2004，23(6):103,106( ,4, 杨秀坚 ，罗远洲(水产品乳酸液化试验研究 ,J,(水利渔业 ，2006， 26(3):82,83( ,5, 段旭昌，徐怀德，李志成，等(乳酸菌发酵法改良甲鱼蛋白酶解液 风味的研究,J,(中国食品学报，2004，4(4):39,42( ,6, 张晓敏( 带鱼下脚料水解蛋白的制备及其利用研究 ,D,(重庆 : 西南大学，2008( ,7, 裘迪红，周 涛，戴志远(水解鲐鱼蛋白制备浓肽口服液,J,(广州 食品工业科技，2001，17(1):72,73( ,8, 于晓丹 ，马 霞 ，王 可 ，等(利用响应面法优化 γ,聚谷氨酸发 酵培养基,J,(中国酿造，2010(11):132,135( (责任编辑 屠 晶) (上接第 4178 页) 叶和土壤中的消解符合一级动力学特征，在鲜茶叶 中的半衰期为 3(1 d，而在土壤中的半衰期为 5(5 d， 说明噻虫嗪在鲜茶叶中的消解快于在土壤中的消 解。 茶叶是一种较为特殊的植物，其商品部分仅是 新抽的嫩芽，新芽的生长对噻虫嗪具有明显的稀释 作用，这可能是鲜茶中噻虫嗪降解快于土壤的主要 原因。 此外，茶叶嫩芽生长于茶树的顶端，容易接受 太阳光照，也有利于噻虫嗪的光解 ,13, ，从而加快了 其在茶叶上的降解。 在同一环境中， 噻虫嗪在植 物 , 作物上的降解速度快于土壤， 这一降解趋势在 其他研究中已得到证实 ,7, 。 噻虫嗪在茶叶及土壤中的残留量与施药量、施 药次数相关，其中施药量对茶叶及土壤中噻虫嗪最 终残留的影响较大，在施药后相同时间点、施药次 数相同时，高剂量的残留量高于低剂量。 而施药量 相同时，施药次数对茶叶中噻虫嗪最终残留的影响 不大，1、2 和 3 次施药处理 7、14 d 后， 茶叶中噻虫 嗪最终残留无明显差异。 在施药量相同条件下，随 着施药次数的增加，噻虫嗪在土壤中的最终残留量 逐渐降低，其原因可能是多次施加噻虫嗪后，土壤 中的微生物对噻虫嗪产生了一定的抵抗力，并有可 能驯化出了某些降解菌，从而适当加快了噻虫嗪在 土壤中的降解速度 ,14，15, 。 依照在所建立的 C,C 0 e ,kt 方 程中，C 0 值为 0(272 9 mg,kg，小于日本“肯定列表制 度” 中规定噻虫嗪 15(0 mg,kg 的最大残留限量值。 因此，噻虫嗪在贵州茶区的茶叶上进行科学合理使 用，茶叶的产品质量是安全的。 参考文献 : 陈宗懋(茶叶农药残留标准又有新规定 ,J,( 中国茶叶，2009(7): ,1, 17,18( ,2, 徐尚成( 农药研究开发的进展与展望,J,(现代农药，2002(1):7, 13( ,3, PERTER M， MAX A， FRANZ B， et al( Chemistry and biolo- gy of thiamethoxam: A second generation neonicotinoid ,J,( Pest Management Science，2000，57(10):906,913( ,4, 高德霖(化学杀虫剂的新成就,噻虫嗪,J,( 精细化工化纤信息通 讯，2002(2):2,5( ,5, 王彦华，王鸣华( 害虫对噻虫嗪抗药性及其治理 ,J,( 世界农药， 2008，30(4):42,45( ,6, 李汉东 ， 魏钦荣 ， 李宏周 (25, 阿克泰防治茶小绿叶蝉试验研 究,J,(植物保护，2002(4):22,23( ,7, KARMAKAR R， KULSHRESTHA G( Persistence， metabolis- mand safety evaluation of thiamethoxam in tomato crop,J,( Pest Management Science，2009，65(8):931,937( ,8, 李明立 ， 宋姝娥 ， 嵇 俭 ， 等 ( 噻虫嗪在番茄上的残留消解动 态,J,(农药，2007，46(7):477,478( ,9, 刘 宾，郭栋梁，毛江胜，等(菠菜中噻虫嗪的残留检测与消解动 态,J,(农药，2009，48(9):666,668( ,10, 农业部农药检定所 ( 农药残留量实用检测方法手册 ( 第一 卷),M,(北京:中国农业科技出版社，1995(7,35( ,11, 樊德方(农药残留量分析与检测 ,M,(上海 :上海科技出版社 ， 1982(116,139( ,12, 华小梅 ， 单正军 ( 我国农药生产 、 使用状况及其影响因子分 析,J,(环境科学进展，1996，4(2):33,45( 郑立庆 ， 刘国光 ， 孙德智 ( 新型农药噻虫嗪的水解与光解研 ,13, 究,J,(哈尔滨工业大学学报，2006(6):59,60( ,14, WALKER A， WELCH S J， ROBERTS S J( Induction and transfer of enhanced biodegradation of the herbicide napropamide in soils,J,( Pesticide Science，1996，47(2):131,135( ,15, FANG H， YU Y L， WANG X， et al( Effects of repeated applications of chlorpyrifos on its persistence and soil micro- bial functional diversity and development of its degradation capability ,J ,( Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology，2008，81(4):397,400( (责任编辑 胡西洲) !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 吴小毛等:噻虫嗪在茶叶和土壤中的消解规律研究 4217