植物组织培养外植体褐变的研究进展3（可编辑）

植物组织培养外植体褐变的研究进展3（可编辑） 植物组织培养外植体褐变的研究进展3 第 21 卷 第 3 期 北 京 林 业 大 学 学 报 Vol. 21 , No. 3 1999年 5 月 JOURNAL OF BEIJ IN G FORESTR Y UN IV ERSIT Y May ,1999 3 植物组织培养外植体褐变的研究进展 姚洪军 罗晓芳 田砚亭 北京林业大学生物学院 ,100083 ,北京 ;第一作者男 ,24 岁 ,硕士 摘要 该文结合近几年来的新进展 ,从酶促褐变的底物和多酚氧化酶出发 ,论述了组织培养外植 体的影响因子 ,生产过程中克服褐变的方法 ,目前在组织培养外植体褐变方面的研究进展以及褐 变机理的假说.结果 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明 ,酚类物质的含量、 多酚氧化酶的类型和活性、 生物膜的透性以及外植体 的种类、 基因型都是决定材料是否发生褐变的重要因素. 关键词 组织培养 ,外植体 ,酚类物质 ,多酚氧化酶 ,褐变 中图分类号 Q945. 51 Development of Explant Browning Researches Yao Hongjun Luo Xiaofang Tian Yanting College of Plant Sciences , Beijing For. Univ. , 100083 ,P. R. China ABSTRACT Focused on the recent development of explant browning researches and based on Polyphenol Oxidases and Polyphenol , the influences of explant browning , the methods to over2 come browning in tissue culture , and the mechanism of explant browning are reviewed and ana2 lyzed. It shows that , the contents of Polyphenol , type and activities of Polyphenol Oxidase , per2 meability of bio2membrane , genotype of explant are all determination factors for the browning of material. KEY WORDS tissue culture , explant , polyphenol , polyphenol oxidase , browning 1 外植体褐变现象的研究现状 外植体一般是指用于发生、 培养无性系植物或进行组织培养时从植物体上 切取下来的组 织切段.当进行继代培养时 ,将培养的组织切段移入新的培养基时 ,这样一 种切段有时也可以 称为外植体.组织培养过程中外植体褐变是影响组培成功的重要因素 ,目前 已在许多植物的组 织培养过程中发现材料有褐变现象. 1. 1 PPO 多酚氧化酶 、 底物与褐变 [1~3 ] 褐变现象主要是由 PPO 作用于天然底物酚类物质而引起的.鞠志国 研究发现 ,果实 [4 ] 内总酚含量与其褐变密切相关. Maira 和 Halevy 进行组培时发现酚类物质的含量与其褐变 [5 ] 率成正相关 ,与成活率成负相关.中科院北京植物研究所 指出鸭梨的褐变是由于低温冷害所 1998204209 收稿 3 国家自然科学基金资助项目 39570580第 3 期 姚洪军等 :植物组织培养外植体褐变的研究进展 79 致 ,褐变的底物是以绿原酸为主的酚类物质 , PPO 是催化褐变反应的关键酶. Mayer 和 [4 ] Harel 注意到正常果实组织中虽然存在有酚类物质和 PPO ,却并不发生褐变 ,指出果实中酚 [3 ] 类物质和 PPO 在细胞中可能是区域化状态分布.鞠志国等 实验证明莱阳梨细胞中酚类物 [4 ] 质集中于液泡中 ,而 PPO 主要分布细胞质中. Mayer 和 Harel 详细综述了植物界的 PPO ,阐 [6~8 ] 述了 PPO 的性质、 类型、 结构、 作用.陈秀芳等 在果实成熟过程中某些酚含量和 PPO 活 性变化的研究 ,证明了褐变度与总酚含量以及 PPO 活性之间的关系因品种而异.有些品种与 PPO 的活性相关 ,有些则与总酚含量密切相关 ,也有人认为褐变度与二者均呈显著相关.而罗 [34 ] 晓芳等 的研究表明 ,多酚氧化酶的活性与组织培养材料的褐变不呈正相关 ,但酚类物质的 含量与褐变有一定的相关性 ,同时易褐变的材料的褐变指数随培养时间的延长不断增加. 1. 2 褐变与其他因素 [9 ] 丁双阳 研究了鸭梨果皮褐变过程中细胞膜伤害与超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的活性 关系 ,指出褐变程度与相对电导率、 超氧化物歧化酶、 过氧化氢酶活性均呈规律性变化.霍君生 [10~30 ] 等 对褐变过程中膜质过氧化及细胞内膜微粘度的变化进行了研究 ,他们认为保护酶活 性在褐变组织中呈明显下降的趋势 ,并积累较多的 MDA ;而未发生褐变的组织超氧化物歧化 酶 S OD 、 过氧化物酶 POD 呈上升趋势 , CA T 下降速率也较褐变组织低.由于保护酶在细 胞膜稳定性维护中的重要作用 ,褐变果实细胞内的膜系统经历了严重的氧化分解作用.同时 , 细胞内膜微粘度的显著提高 , 说明 关于失联党员情况说明岗位说明总经理岗位说明书会计岗位说明书行政主管岗位说明书 以液泡为主的内膜系统流动性不断下降 ,呈现出内膜相变的 特征.这两种作用 ,打破细胞中以液泡膜为界线的酚类物质和 PPO 的区域化分布 ,进而酚类 [10 ,14 ] 物质在 PPO 的作用下 ,转变聚合为植物黑色素 ,导致褐变的形成.林植芳 等人还研究了 有机自由基与褐变的关系 ,研究表明 ,一块小的组织离体后不能进行正常组织间的物质传递 , 其代谢平衡受到干扰 ,从而导致氧气更易于扩散和氧的单电子还原及更多半醌自由基的形成 , 而自由基的形成与褐变呈正相关. 2 外植体褐变的底物和多酚氧化酶 褐变作用按其发生的机制分为酶促褐变和非酶促褐变.从现有的研究来看 , 一般认为外植 体的褐变是酶促褐变.主要是由 PPO 和它的底物进行作用的. PPO 是植物体内普遍存在的一 类末端氧化酶 ,它催化酚类化合物形成醌和水 ,醌又再经非酶促聚合 ,形成深色物质 ,并对外植 [7 ] 体材料产生毒害作用 ,从而使之死亡2. 1 PPO [4 ,7 ] 2. 1. 1 PPO 的类型 PPO 大体上可分为两类 ,即漆酶 Laccase和儿茶酚氧化酶 Catechol oxidase .习惯上 ,常 把儿茶酚氧化酶称为酚氧化酶、 PPO、 酪氨酸酶、 儿茶酚酶或甲酚酶.它与漆酶有明显的区别 , 漆酶的催化底物范围很广 ,可以催化单酚、 三酚、 邻和对位二酚以及氨基酸. 2. 1. 1. 1 儿茶酚氧化酶 儿茶酚氧化酶是一种含铜酶 ,可以催化两种不同的反应. 1催化含有一个羟基的酚形成二醌 O 2 苯酚 邻苯醌 儿茶酚氧化酶甲酚酶 2 催化邻苯二酚形成二醌 1/ 2 O 2 邻苯二酚 邻苯醌 + H O 2 儿茶酚氧化酶 儿茶酚酶80 北 京 林 业 大 学 学 报 第 21 卷 儿茶酚氧化酶广泛分布于植物体各部位 ,在叶绿体、 线粒体、 过氧化物体 和微粒体中都有 发现 ,它很容易被检测到 ,是最早被研究的几个酶之一.植物体内的儿茶酚 酶随植物的生长而 不断变化 ,且受到生长条件的影响. 2. 1. 1. 2 漆酶 漆酶可以催化以下反应 : 对苯二酚 对苯醌 漆酶 或 或 1/ 2 O 2 苯酚 邻苯醌 此外 ,漆酶还可以催化其它多种基质的氧化 ,如抗坏血酸、 对 - 苯二胺 等. 2. 1. 2 PPO 的性质 [6 ] PPO 是一种含铜酶 ,它的活性与 p H 值有关 ,在不同的 p H 值点有不同的活力峰值[15 ,16 ] PPO 具有适宜的温度范围 ,谭兴杰等 在研究桃果实的 PPO 热稳定性时发现 ,温度 100 ?时热处理 80 s后 PPO 仍残存 0. 1 %的活力. 2. 2 酚类化合物 酚类物质是褐变过程中 PPO 的作用底物 ,也是植物界中种类最多 ,分布最广的次生代谢 物质之一.酚类物质的共同结构特点是都含有带羟基的苯环结构.其苯环可有 1 个到多个.苯 [2 ] 环上的羟基或其他修饰的数目和位置因种类而异[2 ] 2. 2. 1 酚类化合物的类型 目前鉴定出结构的酚类化合物已达数千种 ,按其骨架大致分为 3 类 见表 1 其中 ,苯丙烷衍生物与褐变关系最密切 ,是 PPO 的底物. 2. 2. 2 酚类物质的合成与分布 酚类物质的合成途径有两条. 其一是由苯丙氨酸脱氨基而形成 ,其二由莽草酸或与之一个的环己烷衍生物直接芳香化 [2 ] 而形成.其中 ,第一条途径是高等植物中最主要的途径.鞠志国 发现 PAC 苯丙氨酸氨裂解 酶 是催化该反应的关键酶.苯丙 表 1 酚类化合物的分类 氨酸脱氨基后转成肉桂酸 ,后者 TABL E 1 The classification of phenol compound 经羟化酶的催化转为香豆酸 ,香 基本骨架 类名 典型化合物 豆酸则由 PPO 催化加上两个羟 邻 - 羧基苯酚 ,儿茶酚 , 苯基羧酸 C 基转为咖啡酸. 没食子酸 ,莽草酸 [17~20] 2. 2. 3 酚类物质的毒害作用 绿原酸 ,肉桂酸 ,香豆酸 , 水溶性 从理论上讲 ,酚类物质属于 苯丙烷 C C C 咖啡酸 ,水溶性单宁 , 水 衍生物 一种有毒害的次生代谢产物. 酚 水不溶 不溶单宁 ,木质素 类物质可以在 3 个方面对细胞产 O 生毒害作用. 1 与蛋白质或酶发 黄烷衍生物 花青素 ,黄酮 ,芸香苷 生氢键缔合 ; 2与许多金属离子 2 + 2 + 2 + 如 Fe ,Mg ,Cu 等络合 ; 3 酚的氧化产物醌的化学性质更为 活泼 ,不但能在非酶促的条件下发生自我聚合 ,还极易与含有羟基、 氨基和巯基之类的化合物 发生反应.第 3 期 姚洪军等 :植物组织培养外植体褐变的研究进展 81 3 影响组织培养外植体褐变的因子 3. 1 外植体材料的生理状态 组织培养中 ,品系间褐变程度不同 ,其原因之一可能是酚类物质的含量及 PPO 活性上的 [21 ] 差异.陈正华 研究表明 ,外植体材料的基因型不同 ,褐变程度也不同.他们在橡胶的花药培 养中发现 ,只有海垦 2 号花药的褐变较少. 欧洲栗的培养幼年型材料褐变较轻 ,成年型材料褐 变严重.如 1 月 15 日~30 日欧洲栗芽培养醌类物质形成少 ,5~6 月份取芽培养则较多. [20 ] Dan2hua Yu 和 Carole P Meredith 在进行葡萄的组织培养时 ,发现腋生芽的褐变程度低于顶 芽 ,油棕用幼嫩外植体 如胚 培养时褐变较轻 ,而高度分化的叶片接种后褐变很严重.另外 ,外 [21 ] 植体的大小也影响组培褐变.陈正华 进行枇杷的微茎尖 1 mm以下培养时 ,因酚类物质氧 化褐变死亡 ;在进行较大的茎尖培养时褐化现象会消失. 3. 2 酶促因子对外植体褐变的影响 甘蔗胚性细胞在过强的光照 2 500 lx以上 下 ,细胞团表面容易褐变 ,弱光下出现绿色芽 [8 ] 点 .人为的切割和不良的环境条件都能引起膜系统正常结构的破坏 ,酚类物质外渗 ,酚与酶 [4 ] [22 ,23 ] 接触 ,褐变发生 .高 CO 会促进褐变 ,原因是环境中的 CO 向细胞内扩散 ,使细胞内积 2 2 累过多的碳酸根离子 ,碳酸根离子与细胞膜上的钙离子结合使有效的钙离子减少 ,导致内膜系 统紊乱和瓦解 ,使酚类物质与 PPO 相互接触 ,褐变发生. 3. 3 其他因子的影响 培养基的成分会影响外植体培养的褐变.过高的无机盐浓度会引起棕榈科植物外植体酚 的氧化.油棕用 MS无机盐培养外植体易褐变 ,用降低了无机盐的改良 MS可获得愈伤组织和 [12 ,13 ,21 ] 胚状体 .此外 ,激素也影响材料褐变.细胞分裂素 BA 或 KIN 能刺激 PPO 活性提高.陆 [24 ] 振鑫 在 MS培养基上加适量的 BA ,ZT ,NAA培养戴维逊棉取得再生植株 ,而在 MS + 2 ,4 - D ,ZT ,NAA上培养 14 d ,全部褐变死亡. 4 克服外植体褐变的措施 4. 1 外植体及培养条件 成功的经验表明 ,选择适当外植体并建立最佳培养条件是克服材料褐变的重要手段. Dan2 [20 ] hua Yu和 Carole P 研究了外植体起源与组织褐变的关系 ,他们认为生长在避荫处的外植体 比生长在全光下的外植体褐变率低 ,腋生枝上的顶芽比其他部位枝的顶芽褐变率低. 陈正 [21 ] 华 认为适宜的无机盐成分、 蔗糖浓度、 激素水平、 温度及在黑暗条件下培养可以显著减轻材 料的褐变. [8 ,11 ,17 ,23 ,25~31 ] 4. 2 抑制剂的作用 组织培养过程中外植体的酶促褐变 ,人们在培养基中加入抗氧化剂和其他抑制剂来抑制 , 现将培养基中所使用的抑制剂及其作用机理归纳于表 2. 4. 3 吸附剂对褐变的抑制 [19 ,24 ] 在培养基中加入吸附剂可以抑制褐变.宋平和沈丙辉 研究了活性炭 AC 抑制褐变 的作用. PVP 聚乙烯吡咯烷酮 是酚类物质的专一吸附剂.在生化分离制备中常用作酚类物质 和细胞器的保护剂 ,因此 PVP被许多学者用于防止褐变.然而 ,有些学者通过实验证明了 PVP 没有防止褐变的效果 ,原因是在植物体内存在着不同的酚类物质 ,而 PVP 也存在不同分子量 的类型.82 北 京 林 业 大 学 学 报 第 21 卷 表 2 抑制剂作用机理 TABL E 2 Working mechanism of restrain compound 抑制剂 作用机理 研究者 有机酸抑制 PPO 的活性 ;还原剂对 PPO 也有较强的抑 刘曼西和于秀芝 , Reynolds and 制作用 ;一定浓度的柠檬酸、 苹果酸、 均能增强还原剂的 Murashige ,Sondahl 等 ,Skirvin 等 , 有机酸 抑制作用 ;有机酸对纯化的酶制剂的抑制与促进均强于 Chaturvedi 等 ,王敬驹 未纯化的粗酶提取液 蛋白质、 蛋白质水解产 ?氨基酸能与邻醌发生各种不同反应 ; ?蛋白质、 肽、 2 Mason等 ,王敬驹 , Chaturvedi 等 2 + 物、 氨基酸 - 氨基酸可与 Cu 形成稳定的复合物 2 - 巯基苯并噻唑 巯基化合物与邻位醌形成无色物质 Varda kahn PPO 是含铜酶 ,硫脲是铜的螯合剂 ,对 PPO 起抑制作 硫脲、 二胺基二硫代甲 李明启和严君灵 , Krishnamurthi 用 ;二乙胺基二硫代甲酸钠是铜的沉淀剂 ,对各种含铜 酸钠 酶如酪氨酸酶、 漆酶和抗坏血酸氧化酶均起抑制作用 亚硫酸氢钠 抑制酚类物质的氧化 Marina Mcetat 氰化钾 Lchihashi 和 Karo 二硫苏糖醇 Marina Macetat 多胺 抑制过氧化酶 I Elhadrami [11 ,23 ] 4. 4 其他防止褐变的措施 对易于褐变的外植体材料进行连续转移和预处理可以减轻醌类物质对培养物的毒害作 用.天刺黑莓茎尖培养 ,接种后 1~2 d 转入新培养基 ,褐变现象基本不发生.山月桂树的茎尖 培养 ,接种后 12~24 h 转入液体培养基中 ,然后每天转移 1 次 ,连续 1 个星期 ,褐变得到完全 抑制.外植体经流水冲洗后 ,放置在 5 ?左右的冰箱内低温处理 12~24 h ,消毒后先接种在只 含蔗糖的琼脂培养基中培养 5~7 d ,使组织中的酚类物质先部分渗入培养基中 ,取出外植体用 011 %漂白粉溶液浸泡 10 min ,再接种到合适的培养基上 ,这样褐化现象完全被抑制了. 5 褐变的机理 外植体的褐变是一种酶促褐变 ,这已被大多数学者认可 ,但外植体褐变的发生机理没有人 进行研究.归纳现有的研究 ,可由以下两种假说来解释 : 5. 1 酚 - 酚酶假说 Onslow 发现 ,水果的损伤褐变是儿茶酚的酶促氧化造成的.这一结论引起了人们对 PPO 的兴趣 ,进而开展了对该酶的研究. 目前已知 PPO 是一类含铜蛋白质 ,分 子量为 128~133 KDa ,大多存在于细胞质中 ,但也存在于细胞膜或细胞壁上.该酶催化酚转变成醌的反应. Harel等的工作表明 ,苹果的组织褐变程度与其酚类物质含量密切相关. Kahn 等认为 ,在 鳄梨中 ,酚类物质含量高、 PPO 活性强的品种更容易发生组织褐变.上述事实表明 ,水果的组 织褐变是酚类物质氧化的直接结果.在有氧的条件下 ,酚类物质由 PPO 催化被氧化为醌 ,醌 通过聚合反应产生有色物质而导致组织的褐变.也就是说酶促褐变的发生必须具备 3 个条件 , 即酶、 底物和氧.发生酶促褐变的 3 个因素随时都存在 ,然而正常的组织是不发生褐变的 ,下面 的假说可以解释这一现象. 5. 2 酚、 酚酶的区域性分布与组织褐变 Mayer 和 Harel 认为 ,正常的组织不发生褐变可能与细胞内酚类物质和 PPO 的区域性有 关.他们并未给出令人信服的证据. Oba 等用酶法分离获得了原生质体和液泡 ,然后分别测定 其中的酚类物质含量 ,发现二者之间无显著差异 ,因而证实在白香草木樨叶肉细胞中酚类物质第 3 期 姚洪军等 :植物组织培养外植体褐变的研究进展 83 主要分布于液泡中.鞠志国等用类似的方法分别测定了莱阳茌梨原生质体和液泡中的酚类物 质含量及 PPO 活性 ,发现液泡是贮存酚类物质的场所且其中不含 PPO这为酚类物质和 PPO 的区域性分布提供了证据.由于这一区域性分布阻止了底物和酶的相互接触 ,因而避免 了正常组织中酶促褐变的产生. 酚类物质的酶促氧化是组织褐变的直接原因 ,酚类物质与 PPO 的区域性分布是防止褐 化的可能机制.细胞内物质的区域性分布是通过一系列膜系统实现的 ,不良的环境条件可引起 膜正常结构的破坏. Frenkel 和 Patterson曾发现高 CO 处理会导致线粒体、 质体和液泡膜等的 2 变化 ,而冷害会增加多种作物膜的透性.膜结构的破坏会产生两种结果 ,其一是细胞内物质区 域性分布的破坏和具有潜在毒性的酚类物质渗出 ;其二是游离态 PPO 活性增强.二者的结合 为酚类物质的酶促氧化创造了条件 ,从而引起组织褐变的发生. 6 结 语 到目前为止 ,组织培养过程中的褐变现象研究已进行了几十年 ,积累了大量的 资料 新概念英语资料下载李居明饿命改运学pdf成本会计期末资料社会工作导论资料工程结算所需资料清单 ,也提 出了各种假说.但我们还是不能确切的阐述组织培养褐变的详细过程.通过对褐变现象研究状 况的回顾和了解 ,我们可以得到以下共识 :组织培养褐变是酚类物质被氧化的结果 ,其中 PPO 能促进褐变的发生.引起褐变的因素是复杂的 ,就内因来讲 ,外植体材料的生理状态、 基因型、 同一基因型的不同栽培条件、 营养状况、 生长部位和大小都会影响褐变的发生.就外因而言 ,培 养基的成分、 外加激素的含量及比例、 培养条件 温度、 光照时间、 光照强度、 通气状况等 等也 会影响褐变的发生 ,褐变的发生往往是多种因素同时作用的结果.在导致褐变的诸多因素中 , 膜结构的破坏或细胞中物质区域化分布的破坏是酚类物质的酶促氧化和组织发生褐变的关 键.因此 ,深入了解有关机制对于从理论上认识组织褐变 ,找到影响褐变的主导因子和克服褐 变的有效方法 , 并从实践上防止褐变的发生 ,对解决组培生产过程中的褐变这一难 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 ,促进组 培技术的日臻完善 ,具有重要的理论和现实意义. 参 考 文 献 1 鞠志国 ,朱广廉 ,曹宗巽. 莱阳茌梨果实褐变与 PPO 及酚类物质区域化分布的关系.植物生理学报 ,1988 ,14 4 :256~ 261 2 鞠志国. 酚类物质与梨果实品质的研究进展. 莱阳农学院学报 ,1988 ,5 3 :59~65 3 鞠志国. PPO 及其底物对梨组织褐变的影响. 莱阳农学院学报 ,1987 ,4 2 :42~47 4 Mager A M , Harel. Polyphenol Oxidases in plants. Phytochemistry ,1979 ,18 :193~215 5 中国科学院北京植物研究所鸭梨黑心病研究小组. 鸭梨黑心病的研究 2 ? ? ?酚类物质的酶促褐变. 植物学报 , 1974 ,16 3 :235~241 6 陈秀芳 ,王坤范. 桃果实发育中褐变因子变化规律的研究. 园艺学报 ,1995 ,22 3 :230~234 7 董建华. 几种热带水果的褐变与 PPO热带作物研究 ,1990 2 : 92~99 8 Hu C Y ,Wang P JHandboook of plant cell culture. Macmillan , 1983 1 :177~227 9 丁双阳 ,胡小松. 马铃薯丝加工中的褐变因素及其控制. 辽宁农业科学 ,1992 6 :33~36 10 林植芳 ,林桂珠 ,孙谷畴. 人为调节荔枝果皮有机自由基及其与果皮褐变的可能关系试验生物学报 ,1994 ,27 4 :383 ~387 11 杨增海. 园艺植物组织培养. 北京 :农业出版社 ,1987. 67~203 12 崔澄 ,桂耀林. 经济植物的组织培养与快速繁殖. 北京 :农业出版 社 ,1985. 195~256 13 罗士伟 ,许智宏. 经济植物组织培养. 北京 :科学出版社 ,1988. 133~139 14 林植芳 ,李双顺 ,张东林. 采后荔枝果皮色素、 总酚及有关酶活性的变化. 植物学报 ,1988 ,30 1 :40~45 15 谭兴杰 ,李月标. 荔枝果皮 PPO 的部分纯化及性质. 植物生理学报 , 1984 ,10 4 :339~345