用豆粕生产大豆活性肽的初步研究

用豆粕生产大豆活性肽的初步研究 淮北师范大学 2011 届学士学位论文 用豆粕生产大豆活性肽的初步研究 系 别: 生物系 专 业: 生物科学 学 号: 20071501047 姓 名: 牛星 指 导 教 师: 李峰 指导教师职称: 教授 2011年 5 月 9日 用豆粕生产大豆活性肽的初步研究 牛星 (淮北师范大学，生命科学学院) (指导教师:李峰) 摘要:大豆活性肽是大豆蛋白质经过水解、分离纯化得到的3-6个氨基酸组成的低分子量肽的混合物。大豆活性肽具有优良的加工性能，特殊的营养价值和生理活性。作为一种新型优质的大豆深加工产品，大豆活性肽在食品、发酵、医药、化妆品、日用化工等领域的应用日益广泛，前景诱人。对大豆活性肽的研究是近年来国内外的热点之一。但是，产品得率低、生产成本高是制约大豆活性肽市场发展的主要因素。本文以豆粕为原料，选用碱性蛋白酶,从酶解pH值、酶解温度、酶用量和底物质量分数因素研究其对单酶酶解大豆分离蛋白的影响。结果表明，其最佳酶解条件为酶解pH8.0、碱性蛋白酶用量为110mg/g底物、酶解温度55?、底物质量分数8%、酶解时间6h，所得的大豆活性肽的分子量主要集中在1000D以下。系统研究了原料预处理方式、酶解条件等各个环节对大豆肽得率以及品质的影响，以期解决大豆肽生产中存在的问题。 关键词:豆粕;大豆活性肽;碱性蛋白酶;水解度 The Preliminary Study on Active Peptides Produced by Soybean Meal Niu xing (College of Life Science, Huaibei Normal University) (Tutored by Li feng) soybean active protein,which is prepared from soy protein by Abstrct: hydrolysis and purification,is a mixture of small molecular peptides that is composed of 3 to 6 amino acids mainly. soybean active protein has excellent process performance,special nutrition and bioactivity.As a newly emerging and highquality soybean active protein product,soy peptides is geting widely application indifferent areas increasingly, Such as Food industry,fermentation,medicine ,cosmetic and household chemicals.Study on soybean active protein is becoming focus in home and abroad.But,low yield and high cost is the primary problem that limits soybean active protein market. In this paper, soybean meal as the raw material, selection of protease, from the hydrolysis pH, reaction temperature, enzyme amount and substrate concentration factors of its single enzyme hydrolysis of soy protein isolate. The results showed that the optimum conditions for enzymatic hydrolysis pH8.0, alkaline protease ?dosage 110mg / g substrate, reaction temperature 55 , 8% substrate concentration, reaction time 6h, peptides derived from soybean focused on the molecular weight of 1000D below. System of a raw material pretreatment, hydrolysis conditions and other aspects of soybean peptides yield and quality in order to solve the soybean peptides production problems. Key words:soybean active protein;soybean meal;alkaline enzyme; hydrolysis degree 目录 1.引言 ........................................................................................................................ I 1.1大豆肽概述 .................................................................................................. 1 1.2大豆肽的研究现状 ...................................................................................... 1 1.3研究豆粕在现实中的意义 ........................................................................... 2 2.实验材料和方法 .................................................................................................... 2 2.1 材料与试剂 ................................................................................................. 2 2.2 仪器与设备 ................................................................................................. 2 2.3 实验方法 ..................................................................................................... 3 2.3.1 水解度(DH) ....................................................................................... 3 2.3.2 大豆肽的生产工艺 ............................................................................ 3 2.3.3 豆粕的粉碎 ....................................................................................... 3 2.3.4 浸出 ................................................................................................... 3 2.3.5 热处理 ............................................................................................... 3 2.3.6 调PH和加酶 .................................................................................... 3 2.3.7 酶解和测量计算 ................................................................................ 4 2.4 碱性蛋白酶酶解大豆分离蛋白最佳条件的初步确定 ............................... 4 3.结果与分析............................................................................................................ 4 3.1单因素试验结果与分析............................................................................... 4 3.1.1 pH值对酶解反应的影响与分析 ....................................................... 4 3.1.2温度对酶解反应的影响与分析 ......................................................... 5 3.1.3酶用量对酶水解条件的影响与分析 .................................................. 5 3.1.4底物质量分数对酶解反应条件的影响与分析 .................................. 6 4.结束语 ................................................................................................................... 6参考文献 .................................................................................................................. 7 致谢 .......................................................................................................................... 9 1.引言 1.1大豆肽概述 大豆肽，即“肽基大豆蛋白水解物”的简称[1]，是以大豆蛋白为基本原料，经酶法水解、化学方法水解或微生物发酵，分离纯化得到的3-6个氨基酸组成的低分子量肽的混合物，平均分子量小于1000Da，主要分布在300Da-700Da之间，同时含有少量的游离氨基酸、糖类、水分和无机盐等成分[2]。 近年来研究发现，人类摄取蛋白质经消化酶作用后，吸收形式主要是肽而不是氨基酸。大豆活性肽与大豆分离蛋白相比，大豆肽具有独特理化性质、生理功能和生物活性，它的氨基酸含量与大豆分离蛋白基本相同，必需氨基酸含量丰富;理化特性和营养价值更是优于大豆分离蛋白。大豆活性肽没有大豆腥味，口感良好;它具有抗疲劳[1]、抗氧化辐射[2-5]、降血压血脂[6-8]、抗血栓、减肥以及调节免疫功能[9]、促进微生物的生长等作用;最近还发现大豆活性肽具有和钙有效结合的活性基团，可以形成有机钙多肽络合物，使溶解性、吸收率和输送速度都明显地提高，防止骨质疏松。随着科技的日新月异，大豆活性肽的其他生物功能也将被人们逐渐发现。大豆活性肽的优势使得它在普通食品、保健品、医药日化行业以及饲料行业[10-12]中有着广泛的应用。为充分利用我国的大豆资源并提高它的经济价值，对其进行深加工研究显得尤为重要。 1.2大豆肽的研究现状 1974年美国成立了由Jens Alder-Nissen领导的专门研究水解蛋白课题的机构，主要研究新型大豆深加工产品—大豆多肽。日本也于20世纪80年代开展了大豆肽的研究，并在产酶菌的选育，水解工艺、水解产物脱苦等方面都取得了技术上的突破。Per Munk Nielsend和McneilMarcel C等人做了Alcalase和Neutrase双酶分步水解制备大豆肽的研究。国外对大豆肽产业的开发亦居于先导。不二制油公司，雪印、森永等乳业公司已将多种大豆肽产品应用于食品工业。早在1989年，不二制油公司就已经生产出9个品种的系列大豆肽产品用于运动食品、饮料、保健食品、肠道营养剂以及化妆品。近年来又开发了大豆肽营养补剂[16]、运动强化饮料[17]、免疫调节活性肽[18]、抗癌肽[19]等新产品。2000年，日本批准大豆肽作为降低胆固醇的特定保健食品，美国Deltown Specialities公司建成了年产5000吨大豆肽的工厂。欧洲国家也在上世纪80年代对大豆肽进行了研究，并有产品推向市场。据估算，现在欧美日本有近100万病人和亚健康病人食用大豆多肽类保健品，销售额超过2亿美元，并有继续增长的趋势。20世纪80-90年代以来，国内多家高校及研究所进行了大豆多肽的研究，并在基础理论研究方面取得许多成果。国外对大豆肽的研究已经取得了很多成果，大豆肽产品已得到广泛的开发和应用。其中美国和日本无论是基础理论还是应用研究都处于世界领先地位。国明明[20]研究了Alcalse、Flavourzyme、ProteaseA、PeptidaseR、Papain、 Trypin六种酶对大豆蛋白的水解效果，结果表明Alcalse酶的水解效率最高。刘艳秋[5]建立了Protamex复合蛋白酶水解大豆分离蛋白的的数学模型，筛选出高产工艺综合 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 和最优化的生产条件。梁歧[21]研究了Alcalse/Flavourzyme复合酶水解大豆分离蛋白制备大豆寡肽的工艺条件，并对产品进行脱色脱盐等精制。余勃[22]利用Bacillussubtilis SHZ发酵豆粕制备大豆活性多肽，通过数理优化得到了合适的发酵工艺，开发出一种具有抗疲劳效果的大豆肽功能性饮料。陈山、杨晓泉[22]等利用超滤技术分离纯化大豆肽，得出最佳工艺参数。黄文凯[23]利用膜分离技术制备了一种具有免疫活性的大豆肽。目前国内对大豆多肽研究如火如荼，但产业化正处于起步阶段，发展相对滞后。 1.3研究豆粕在现实中的意义 我国是世界大豆的主产国之一，大豆资源丰富。豆粕是大豆榨油的副产品，蛋白含量在45.0%-55.0%之间，其中80.0%以上都是水溶性蛋白，由于未能精深加工利用，因此大豆产业的经济效益不显著。目前豆粕主要用于饲料，开发利用率不高，浪费严重。大豆分离蛋白，大豆浓缩蛋白、大豆组织蛋白是大豆粕加工利用的传统方式，但目前国内技术远不及国外，产品品种单一，功能性较差。进口的大豆蛋白多是由转基因大豆生产，而且价格高于国产同类产品的30%，但消费者依然喜欢用进口产品，国内产品不具有竞争力，利润空间狭小。目前市场上低变性脱脂豆粕的价格大约为4800元/吨，浓缩蛋白大致是9000元/吨，大豆分离蛋白约为18000元/吨，而大豆肽通常在200000元/吨以上。利用大豆粕加工制备大豆肽将获得较高的利润和附加值。酶法制备大豆肽条件温和，便于控制，但酶的价格昂贵是最大问题所在。如果能够从原料到产品的各个环节进行优化改进，减少酶的用量，提高产品得率，对于降低成本将有很重要的现实意义。目前报道通常采用大豆分离蛋白作为原料，成本很高，加之工艺条件的影响，肽损失严重，得率较低。因此本文从工艺条件的各个环节着手研究，旨在提高产品得率和品质，降低生产成本，为大豆肽酶法制备建立最佳工艺条件。 2.实验材料和方法 2.1 材料与试剂 豆粕 碱性蛋白酶 (酶活力为2×105U/g)。1mol NaOH、1molHCl 2.2 仪器与设备 PHS-3CT pH计上海康仪仪器有限公司;SYC-LB摇床上海联环生物工程设备有限公司;TGL-16A型离心机长沙平凡仪器仪表有限公司;RE-52A旋转蒸发仪上海亚荣生化仪;;料理机;电热恒温水浴锅;电子分析天平 2.3 实验方法 2.3.1 水解度(DH) 采用pH-Stat法 计算公式 六西格玛计算公式下载结构力学静力计算公式下载重复性计算公式下载六西格玛计算公式下载年假计算公式 如下: DH(%)=[V×C/(α×Mp×htot)]×100 其中V:消耗氢氧化钠溶液的体积; C:氢氧化钠的摩尔浓度; α:α-NH2的平均解离度; htot:蛋白质中总的可被水解的肽键数，对于大豆蛋白h=7.75。 2.3.2 大豆肽的生产工艺 原料?粉碎?浸出?热处理?调PH?加酶?酶解?测量?计算 2.3.3 豆粕的粉碎 取脱脂豆粕100g放入料理机中打碎1min，具体操作应按照料理机的使用手册。取出打碎的豆粕放在广口瓶中保存。增大表面积,以提高蛋白浸出率和酶解效果。 2.3.4 浸出 为了提高脱脂豆粕中的大豆蛋白溶出率,加水控制豆粕的蛋白含量为3.5%。温度高有利于蛋白的浸出,酶解蛋白肽得率高;但水浸温度若达到高温(比如80?),则蛋白变性而不能从豆粕中溶出,从而导致最终肽得率的下降。经实验确定在55?下浸30min,使大豆蛋白充分溶出。同时浸出液中还含有部分低聚糖。 2.3.5 热处理 经热处理可杀灭致病菌和腐败菌,破坏抗胰蛋白因子和大豆凝血因子,钝化脂肪氧化酶和脲酶等成分,达到彻底去除豆腥味。同时大豆蛋白经热变性后,空间结构发生改变,使蛋白水解酶的作用点大大增加,更利于下一步的蛋白酶水解。但不能加热过度,否则松散的多肽链又会由于S-S键和疏水键的再生而重新结合得更加紧密,这样反而阻碍了酶对蛋白的水解作用。实验表明,大豆蛋白经100?、20min的热处理后,能使大豆蛋白相对酶解率达到100%[6]。 2.3.6 调PH和加酶 用PH计把温度、酶用量和底物质量分数三个因素的PH梯度调为8.5，把PH因素的PH梯度6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，并加入一定量的酶。 2.3.7 酶解和测量计算 把溶解的脱脂豆粕放在摇床上酶解6小时，每小时测量PH值并加碱调到原PH值， 记录 混凝土 养护记录下载土方回填监理旁站记录免费下载集备记录下载集备记录下载集备记录下载 数据。采用pH-Stat法计算水解度。 2.4 碱性蛋白酶酶解大豆分离蛋白最佳条件的初步确定 pH值对酶水解条件的影响:以温度55?、底物质量分数8%、碱性蛋白酶用量110mg/g底物、反应时间6h的条件下，分别设定pH值为6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0六个值进行实验，测量其碱用量，计算水解度。 温度对酶解反应条件的影响:以pH8.5、底物质量分数8%、碱性蛋白酶用量110mg/g底物、风味蛋白酶用量110mg/g底物、反应时间6h，分别设定温度为40、45、50、55、60、65?六个进行实验，测量其碱用量，计算水解度。 ?、底物质量分数8%、pH8.5、水酶用量对酶水解条件的影响:以温度55 解6h，分别设定酶用量为30、50、70、90、110、130m g/g底物六个值进行实验，测量其碱用量，计算水解度。 底物质量分数对酶解反应条件的影响:以温度55?、碱性蛋白酶用量110mg/g底物、风味蛋白酶用量110mg/g底物、pH8.5、反应6h，分别设定底物质量分数为2%、4%、6%、8%、1 0%、12%六个值进行实验，测量其碱用量，计算水解度。 3.结果与分析 3.1单因素试验结果与分析 3.1.1 pH值对酶解反应的影响与分析 图1 pH值对酶解反应的影响 30 25 20 15 水解度/%10 5 0 6.577.588.59 PH 由图1可知，在温度55?、底物质量分数8%、碱性蛋白酶用量110mg/g底物反应时间6h的条件下，水解度在PH6.5到8.0之间呈递增趋势，PH8.0到9.0 之间为递减趋势，碱性蛋白酶为pH8.0，其水解度达到最大值。 3.1.2温度对酶解反应的影响与分析 图2温度对酶解反应的影响 30 25 20 15 水解度/%10 5 0 404550556065 温度/? 由图2可知，以pH8.0、底物质量分数8%、碱性蛋白酶用量110mg/g底物的条件下反应6h，水解度在温度40?到55?之间呈递增趋势，温度55?到65?之间为递减趋势可发现碱性蛋白酶在温度为55?的水解度达到最大值。 3.1.3酶用量对酶水解条件的影响与分析 图3酶用量对酶解反应的影响 30 25 20 15 水解度/%10 5 0 30507090110130 酶用量/(mg/g底物) 由图3可知，在温度55?、底物质量分数8%、p H 8.0、水解6 h的条件下，水解度在酶用量30到110 m g/g之间呈递增趋势，酶用量110到130 m g/g之间为递减趋势，碱性蛋白酶用量为110m g/g底物，其水解度达到最大值，并且从经济角度考虑为最好。 3.1.4底物质量分数对酶解反应条件的影响与分析 图4底物质量分数对酶解反应的影响 30 25 20 15 水解度/%10 5 0 24681012 底物质量分数/% 由图4可知，以温度55?、碱性蛋白酶用量110mg/g底物pH7.5的条件下反应6h，水解度在底物质量分数2%到8%之间呈递增趋势，底物质量分数8%到12%之间为递减趋势，底物质量分数为8%时其水解度达到最大值。在8%以上水解度变小的原因是由于大豆分离蛋白的黏度变大，酶与大豆分离蛋白的作用面积反而变小。 4.结束语 豆粕富含大豆蛋白,本工艺中先将豆粕粉碎,再进行浸提蛋白、直接酶解等操作,一方面可提高脱脂豆粕的利用率,另一方面可大大提高大豆肽的产率,降低大豆小肽蛋白的成本。本实验采用常用的碱性蛋白酶进行酶解以及采用单因素结合响应曲线进行试验，得到最佳工艺条件粗略为pH8.0、温度55?、碱性蛋白酶用量110mg/g底物，底物质量分数8%、反应时间6h，此条件下，水解度达到37.3 7%。目前国内对大豆多肽研究如火如荼，但产业化正处于起步阶段，发展相对滞后。从豆粕中生产大豆活性肽可以节省很多资源，避免浪费。我希望对豆粕的研究不要停止，是豆粕领域迅速产业化。 参考文献 [1]崔洪斌.大豆生物活性物质的开发与应用[M].北京:中国轻工业出版社， 2001.241 [2]姜曼，宋俊梅.大豆肽营养功能及脱苦方法研究进展[J].粮食与油脂，2009(4): 42-44 [3]孙群，阚健全，赵国华等.大豆肽特性及其在食品工业中应用[J].粮食与油 ,2003,12: 11-13 脂 [4]刘艳秋.大豆多肽生产工艺的优化及其生物活性研究[D].吉林农业大学，2004 [5]陈湘宁，张艳艳，范俊峰等.大豆多肽的凝胶性及抗氧化性研究[J].食品科学， 2005， 26(5):71-75 [6]陈海敏，华欲飞.大豆蛋白产品的功能及在化妆品中的应用[J].日用化学工 .2006,12(6):62-64 业 [7]范喜宽，庄磊，赵一敏等.大豆蛋白活性肽的研究现状及应用前景[J].综述与述 评.2009,12(5):1-4 [8]段玉兰.小肽的吸收及其应用前景[J].饲料博览.2002,3:43-45 [9]王岗，卢德勋.肽的吸收与利用[J].饲料广角.2002,8:17-19 [10]Niiho-Y,Yamazaki-T,Hosono-T,Nakajima,Ishazaki-M.Kurashige-T.PhamacologicalStudies on Small Peptide Fraction Derived From Soybean.The Effects of Small PeptideFraction Derived from Soybean on Fatigue,Obesity and Glycemia in Mice.Journal of thePharmaceutical Socity of Japan.1993,113(4):334-342 [11]Komatsu-T，Komatsu-K，Matsuo-M，Nagata-M，Yamagishi-M.Effects of NitrogenSupplement Using Soybean Peptide on Diet Therapy with Energy Restriction to obese Children.Nutritional Science of Soy Protein.Japan.1989,10(1):84-88 [12]范远景,姬莹莹,张焱.大豆蛋白酶解肽的分子量分布及抑制ACE活性关系研 究[J].食品科学,2007,28(10):57-61 [13]张莉莉,严群芳,王恬.大豆生物活性肽的分离及其抗氧化活性研究[J].食品科 学,2007,28(5):208-211. [14]ZAEIK S,RINA Y,SOO A P,et al.His-His-Leu,an angiotensin Iconverting enzyme inhibitory peptide derived from Korean soybean paste exerts antihypertensive activity in vivo[J].Agric Food Chem, 2001,49:3004-3009. [15]陈小莺,张日俊.大豆生物活性肽对蛋鸡生产性能和蛋白质代谢的影响及调控 机理业[J].饲料工业,2005,26(23):33-36. [16]彭志英,唐传核.功能性食品基料蛋白质及多肽类开发现状[J].粮食与油 脂.2001(1):39-41 [17]龚树立,文剑,吴逸民,杨玉铮.大豆多肽运动饮料的研制[J].食品与发酵工 业.2003(4):86-87 [18]M.Yoshikawa,M.Takahashu.Immunomodulating peptide derived from soybean proteinannsls[M].New York:Acad.Of Sci.,1993.375-376. [19]Song E Kim,Hyuck Hwa Kim.Anticancer activity of hydrophobic peptides from soyproteins[J].Biofactors,2000(10):151-155. [20]国明明.大豆多肽的制备及免疫调节作用的研究[D].江南大学，2007 [21]梁岐.大豆寡肽的制备研究[D].中国人民解放据军需大学，2001(11):831 [34] 余勃.枯草芽孢杆菌发酵豆粕生产大豆活性多肽的研究[D].南京农业大 学.2006 [22]陈山，杨晓泉，郭祀远等.大豆肽超滤分离纯化过程的研究[J].食品与发酵工 业.29(1):49-51 [23]黄文凯.膜分离方法制备免疫活性大豆肽的研究[D].江南大学食品学院，2007 [24]刘立超，黄洪林，赖正权，廖慧君(苯酚硫酸法测定栀子水溶性多糖含量[J](安 徽医药，2005，9(11):831-832 致谢 时光荏苒，岁月如梭。转眼间，我已在相山脚下的淮北师范大学度过了四个年头。四年，一段不短的时间，四年的光阴让我成长，让我从青涩走向成熟。毕业在即，心生诸多感触。 首先我要感谢李峰老师，李老师性格谦和，兴趣广博。毕业论文的每一个过程都凝结着李老师的心血，从选题到答辩的每一步，都离不开李老师悉心的指导。 感谢和我一起生活四年的室友，是你们让我们的寝室充满快乐与温馨，是你们和我共同维系着彼此之间姐妹般的感情，维系着寝室那份家的融洽。四年了，仿佛就在昨天。“君子和而不同”，我们正是如此～愿我们以后的人生都可以充实、健康与快乐～ 感谢我亲爱的朋友们。感谢你们在我失意时给我鼓励;在失落时给我支持。感谢你们和我一路走来，让我在此过程中倍感温暖～ 我还要特别感谢生我养我的父母双亲，在我18岁之后，依然给予我足够的物质支持，让我顺利地完成大学4年的学业。虽然自己尽力的减轻着家里的负担，可是我知道，你们活得要远比我辛苦，发自内心的说声我爱你们，我会用我的未来向你们承诺一个好的生活，请你们等待～ 一个人的成长绝不是一件孤立的事，没有别人的支持和帮助绝不可能办到。我感谢可以有这样一个空间，让我对所有给予我关心、帮助的人说声“谢谢”～今后，我会继续努力，好好工作～好好学习～好好生活～ 最后，值此毕业之际，向母校表达我深深的谢意，愿母校明天更美好～ 牛星 2011年5月21日