【2017年整理】SOD、POD、CAT、MDA和可溶性蛋白的测定

【2017年整理】SOD、POD、CAT、MDA和可溶性蛋白的测定 SOD、POD、MDA、可溶性蛋白、脯氨酸、电导率、可溶性糖的测定 一、磷酸缓冲液的配制: A液:0.2M的KHPO溶液 称取分析纯KHPO27.216克，用蒸馏水定容至1000毫升。 2424 B液:0.2M的KHPO溶液 称取分析纯KHPO•3HO45.644克，用蒸馏水定容至1000毫升。 24242 或 (A液:0.2M的NaHPO溶液 称取分析纯NaHPO•2HO 31.21克，用蒸馏水定容至100024242 HPO•12HO 71.64克，用蒸馏水定容至毫升。B液:0.2M的NaHPO溶液 称取分析纯Na24224 1000毫升。) 二、 酶液的制备:称取0.5g样品放入研钵中，加2毫升 0.05M PH=7.8的磷酸缓冲液及少 量石英砂，冰浴研磨，匀浆倒入10毫升离心管中，再加3毫升磷酸缓冲液冲洗研钵，4? 冷冻离心20分钟(若做可溶性蛋白，转速为4000转/分钟，若不做，则10000转/分钟)， 0上清液(酶液)倒入试管中，置于0~4C下保存待用。 三、 SOD的测定: 1.SOD反应液的配制: 母液的配制: (1)0. 05M 磷酸缓冲液(PH=7.8):A液21.25ml+B液228.25ml定容至1000ml; (2) 130mM Met(甲硫氨酸):取1.9399克Met 用磷酸缓冲液定容至100ml;棕色瓶避光 4?保存。 (3)750μM四氮唑蓝(NBT):取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml;棕色瓶 避光4?保存。 (4) 100μM EDTA-Na: 取0.0372g EDTA-Na用磷酸缓冲液定容至1000ml，棕色瓶避22 光保存; (5) 20μM FD (核黄素): 0.00753gFD用蒸馏水定容至1000ml。随用随配。棕色瓶避光 保存; SOD反应混液: 磷酸缓冲液:Met:NBT:EDTA-Na:HO的比例为15:3:3:3:2.5，按母液顺序22 配制，然后依次加入核黄素和酶液。 2.SOD的测定:取型号相同的试管，吸取20微升的酶液，加入3毫升，4000Lux照光30分 钟，同时取两支试管，一支做对照，一支做空白(对照、空白不加酶液，以缓冲液代替); 空白置暗处，对照(CK)与酶液同置于4000Lux条件下照光30分钟，反应后遮光保存， 以空白调零，560nm比色。每个试验重复三次(3试验+3空白+3对照) 3.结果计算 SOD总活性(吸光度/g?FW)=(A—A)×V,(W×0.5 ×Vt×A) CKECK 单位:NBT光还原50%为单位 SOD 比活性(酶单位/mg蛋白)= SOD总活性/蛋白质浓度 SOD总活性以鲜重酶单位每克表示(u/g FW);比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示;A为照光对照管的吸光度;A为样品管的吸光度;V为样品液总体积;Vt为测定时的酶液ckE 用量(ml，30ul);W为样品鲜重(g);蛋白质含量单位为mg/g。 注意:1.要10ml离心管，不要大试管，否则枪头够不着，不好吸; 2(提取液预冷; 3. 测的样品值要在最大管的一半左右才合适，否则要调整酶量 4.照光时间和强度严格控制，试管要透明，质地均一。 - 1 - 四、POD的测定: 1. 0.1M PH6.0磷酸缓冲液的配制:A液219.25+B液30.75，定容至1000毫升; 2. POD反应液的配制:0.1M PH 6.0的磷酸缓冲液50毫升于烧杯中，加入愈创木酚28微 升，磁力搅拌器加热搅拌使之完全溶解，冷却后加入30%HO19微升混合，保存于冰22 箱中。 3. POD的测定:20微升酶液+3毫升反应液于比色皿中，以PBS为对照调零，在470nm 下每隔1分钟读数一次，共读三次，以每分钟吸光度变化值(ΔA470/min?mg pr或Δ A470/ mgFW)表示酶活力的大小。 结果计算:POD活性POD=(ΔA470×Vt)/(W×Vs×0.01×t) (u/g min) ΔA470:为反应时间内吸光度的变化;W为样品鲜重(g);t为反应时间(min);Vt为提取酶液总体积(ml);Vs为测定时取用酶液体积(ml) 五、MDA的测定: 1.MDA反应液的配置:0.6克TBA(硫代巴比妥酸)，先用少量1MNaOH溶解，用10%TCA(三氯乙酸)定容至100毫升。 1. MDA的测定:1毫升酶液+2毫升0.6%的TBA，封口沸水浴15分钟，迅速冷却后1500 转10min离心，取上清液，在600、532、450nm 三个波长下比色。 2.结果计算:MDA浓度C (umol/L)=6.45(OD532-OD600)-0.56OD450 MDA含量(umol/g FW)=C×V/W V为提取液体积(ml)，W为样品鲜重(g) 六、可溶性蛋白的测定 反应液配制:0.1克G-250溶于50毫升90%乙醇中，加入100毫升85%磷酸，定容至1000毫升，在过夜后过滤并贮于棕色瓶中，常温下可在暗中保存一个月。 100μg/ml牛血清蛋白(BSA) 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 溶液: 10mg BSA,0.9,氯化钠溶解，定容至100ml 测定:20微升酶液+80μl，0.05M，pH7.8磷酸缓冲液+2.9毫升G-250放置2分钟，595纳米比色，同时做空白(100微升缓冲液+3毫升G-250为对照调零)。 结果计算:可溶性蛋白可溶性蛋白质含量(mg/g)=(C×VT)/(W×VS×1000) C为标准曲线查得的蛋白质含量(μg);VT为提取液总体积(稀释后的体积ml);VS为测定时所用提取液体积(ml，20μl);W为样品鲜重(g) 七、脯氨酸含量的测定 试剂配制: 0.3%磺基水杨酸:3克磺基水杨酸，定容至100毫升: 2.5%酸性茚三酮(现配):60 ml冰醋酸、16.4 ml磷酸加蒸馏水定容至100 ml，再加入2.5 g茚三酮，溶解后避光保存 标准脯氨酸液:25mg脯氨酸定容至100nl。 测定:0.3克叶片，加入5毫升磺基水杨酸研磨提取，倒入离心管，沸水浴10分钟，冷却3000转离心10min，吸取滤液2毫升(同时作空白，吸取2毫升蒸馏水)、2毫升冰醋酸和3毫升酸性茚三酮，沸水浴40分钟，冷却，加入5毫升甲苯，充分振荡，静止分层，取上层甲苯溶液于比色皿中，以甲苯为空白对照，520纳米下比色。 结果计算:脯氨酸含量(μg/g鲜重)=C×V/Va/W 八、植物细胞质膜透性的测定(电导仪法) (1)取新鲜叶片或根系(不能萎蔫)0.3g，用自来水冲洗表面污渍，再用去离子水冲洗几遍后用吸水纸吸干水分; - 2 - (2)样品剪碎(也可打孔取样)放入试管(或15ml大离心管)中，加10ml去离子水，在室温下放置3h，期间多次摇动，使叶片充分吸水后测定溶液电导率(R1); (3)再放入恒温水浴锅中在100?沸水浴中煮20min以杀死叶片组织，用冷水冷却到室温后测定溶液电导率(R2); (4)用公式计算质膜相对透性(用相对电导率表示): 相对电导率(%)=R1/R2×100% 还可以计算植株伤害程度: 伤害率=(处理电导率—对照电导率)/(煮沸电导率—对照电导率)×100% 九、可溶性糖 105?杀青30 min，85?烘干至恒重用于可溶性糖的测定 将处理后的叶片称取0.02 g于刻度试管中，加入5 mL蒸馏水，塑料薄膜封口，沸水中提取30 min(提取2次)，提取液过滤入25 mL容量瓶中，反复漂洗试管及残渣，定溶至刻度。然后吸取0.5 mL稀释液、1.5 mL蒸馏水、0.5 mL蒽酮-乙酸乙酯试以及5 mL浓硫酸，沸水浴1 min后冷却，于分光光度计上测定OD值(λ=620nm)。 - 3 - - 4 -