【doc】利用生防真菌孢子粉生产中的废米生产饲用β-葡聚糖酶和木聚糖酶的黑曲霉固相发酵条件优化

【doc】利用生防真菌孢子粉生产中的废米生产饲用β-葡聚糖酶和木聚糖酶的黑曲霉固相发酵条件优化 利用生防真菌孢子粉生产中的废米生产饲用β-葡聚糖酶和木聚糖酶的黑曲霉固相发 酵条件优化 浙江大学(农业与生命科学版)35(1):39,44,2009 JournalofZhejiangUniversity(Agric.&LifeSci.) 文章编号:1008,9209(2009)01—0039—06DOI:10.3785/j.issn.1008—9209.2009.01.005 利用生防真菌孢子粉生产中的废米生产饲用葡聚糖酶和 木聚糖酶的黑曲霉固相发酵条件优化 王晓晓,冯明光 (浙江大学生命科学学院微生物研究所,浙江杭州310058) 摘要:为资源化利用生防真菌高纯度孢子粉在生产过程中产生的大量废米,将废米粉按比例混入麦 麸作为基础物料,接种黑曲霉固相发酵生产饲用B一葡聚糖酶和木聚糖酶,得到麸米比7:3的最佳配料; 纯麦麸发酵3d后2种酶的产量为353.8,343.8U.g干曲.在对发酵时间,配料含水量,补充氮源,微 量元素,拌料水的表面活性剂浓度及pH值等单因素分别优化试验的基础上,选取对产酶影响较大的金 属离子类型,硫酸铵添加量,拌料水的吐温80浓度和pH进行4因素3水平9处理的正交试验,获得的 最优组合为麸米比7:3的配料中加入0.1KH2PO4和1(NH4)2SO4,拌料水为0.3吐温8O和 pH5.经3次重复试验验证,用最优组合配料接种后在25?下发酵54h,8一葡聚糖酶和木聚糖酶产量 (?SD)分别达到(716.1?9.2),(453.O?62.5)U.g-1干曲,远高于优化前相同麸米比 配料的酶产量. 这一结果为建立环境友好型真茵杀虫剂生产线提供了有用的配套技术,使饲用酶 制剂生产节约麦 麸3O. 关键词:黑曲霉;固相发酵;B一葡聚糖酶;木聚糖酶 中图分类号:Q939.99文献标识码:A WANGXiao—xiao.FENGMing— guang(InstituteofMicrobiology,CollegeofLifeSciences,Zhejiang University,Hangzhou310058,China) Optimizedsolid-statefermentationofAspergillusniger xylanaseusingriceresiduesfrommassproductionof University(Agric.&.LifeSci.),2009,35(1):39—44 forproductionoffeed-purposep-glucanaseand fungalbiocontrolagents.JournalofZhejiang Abstract:Riceresiduesfrommassproductionoffungalbiocontrolagentsagainstinsectpestswere exploredforuseintheproductionoffeed—purpose口一 glucanaseandxylanase,whichisusuallyachievedby solid— statefermentation(SSF)ofAspergillusnigerwithwheatbran.Amixtureof70wheatbranand 3O%milledricewasselectedasanacceptablesubstratejnthetrialsof10ratiosofthetWOcomponents andyielded353.8and343.8U.g— substratefort]-glucanaseandxylanaseafter3-daySSF,respectively. FactorsfoundtosignificantlyaffecttheenzymeyieldsinthemixtureduringSSFwerethetypeofmetal ionastracenutrition,thecontentof(NH4)2SO4assupplementarynitrogen,andtheconcentrationof Tween一 80andPHinthewaterusedtostirthemixtureforSSF.Combinationsoftheselectedfactors werefurtheroptimizedforenzymeproductionintriplefour, factor,three-levelorthogonalexperiments. Theoptimizedcombinationoftherice— branmixtureconsistedof0.1KH2PO4,1.0(NH4)2SO4and 收稿日期:2008一Ol一07 基金项目:国家科技部资助项目(2006AA10A212;2()(】7DFA3100);浙江省科技 计划 项目进度计划表范例计划下载计划下载计划下载课程教学计划下载 重点资助项目(2oo7c12035);国家科技支 撑计划资助项目(2006BAD08A02). 作者简介:王晓晓(1983一),女,山东潍坊人,硕士研究生,从事应用微生物研究.E— mail:wangxx024@yahoo.com.cn. 通讯作者:冯明光,男,教授,博士生导师,从事害虫微生物防治研究.E— mail:mgfeng@zju.edu.cn. 浙江大学(农业与生命科学版)第35卷 thewatercontaining0.3Tween一 80withpH5.Whenthisoptimizedmixturewasusedassubstratein threerepeatedtrialsof54一hSSFat25?forconfirmation,themean(?SD)yields0f8一 glucanaseand xylanasereached(7l6.1? 9.2)and(453.0_-Z-62.5)U.g_.,whichweregreatlyenhancedcomparedtO thosebeforeoptimization.Theresultshighlightanalternativeapproachtoutilizingthericeres iduesfor theenzymeproductionatthereducedcostof3OwheatbranandwouldfacilitatetOestablishari ce— based,environment一{riendlytechnologyforbulkproductionof{ungalbiocontrolagents. Keywords:Aspergillusniger;solid—statefermentation;i?-glueanase;xylanase 白僵菌,绿僵菌,拟青霉等害虫生防真菌已 在国内开发成为真菌杀虫剂,用于叶螨,叶蝉, 粉虱等重要害虫的防治口].作为生防真菌制 剂有效成分的高纯度孢子粉生产,经济有效的 办法是采用低值稻米进行固相产孢发酵,其突 出的优点是孢子粉(相当于原药)产量高,粉质 优,成本低,无杂菌污染,且生产周期可控].这 一 产孢发酵工艺不产生任何废气和废液,但发 酵物料在孢子粉经旋风收获后成为基本维持原 形的废米,其重量为原重的80左右,每年供 百余万亩次用菌的孢子粉生产线可产生700, 800吨废米].虽然这些废米的经济价值已充 分体现在所生产的孢子粉中,但能否有效利用 是建立环境友好型真菌杀虫剂生产线,进一步 降低成本必须考虑的重要因素.解决途径有二, 一 是将其磨成粉作为防治地下害虫的菌剂载体 利用,二是采用适当方法处理残米,作为原料生 产其他有用的产品. 国内目前饲用8一葡聚糖酶和木聚糖酶制剂 的生产一般采用麦麸为主要原料的固相发酵工 艺.为了建立上述真菌杀虫剂生产工艺的配 套技术,本研究尝试用麦麸与上述废米的适当 配方作为黑曲霉(Aspergillusniger)的固相发 酵基质,通过发酵条件优化,探索尽量利用废米 生产饲用j3一葡聚糖酶和木聚糖酶的可能性. 1 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 与方法 1.1菌种及接种体制备 将产[j一葡聚糖和木聚糖酶的黑曲霉 CGMCC0727菌株(中国微生物菌种保藏中心 提供)接种到马铃薯培养基PDA斜面上,25? 活化培养3d后,倒入适量含0.02吐温8O的 水,轻轻刮洗斜面上的孢子而制成悬液,再调整 悬液至含孢量为1×10mI,作为产酶固相 发酵接种液. 1.2固相产酶发酵 1.2.1麦麸与残米粉的配比试验将生防 真菌孢子粉收获后的废米机械破碎成粉,按 10的递增比例与麦麸混合,形成纯麦麸(对照) 至纯废米粉的】1种不同麸米比的混配物料作为 固相发酵产酶基质(处理),经干热灭菌处理后备 用.每种混配物料1Og(按干重计)与0.5mI孢 子悬液混匀接种,混合时按物料干重添加0.5 NHN()_{作为补充氮源,最后用无菌水(pH 6.83)调节含水量至51.2.将每份接种物料盛 人9cm培养皿中,置于25?光照培养箱(12I :12D)中静止培养72h后,测定发酵物料中 葡聚糖和木聚糖酶的酶活.每处理重复3次. 1.2.2产酶发酵时间优化选取产酶较好 的麸米比物料配方按1.2.1的方法接种,从培养 42h起每隔6h取样测定目标酶活,观察固相 发酵期间的产酶动态,确定最佳产酶时间.每样 品处理重复3次. 1.2.3产酶发酵条件优化在优选的物料 配方和发酵时间的基础上,对发酵物料中的含水 量,补充氮源,金属离子,拌料水表面活性剂含量 和pH值等可能影响产酶的因素分别进行单因 素优化.含水量处理分别为45.9Yo,48.7, 51.2,53.5,55.6,57.4,59.2,60.8, 并添加0.5NHN.在最适含水量(55.6) 的优化物料配方基础上进行以下优化试验.一是 按干料重0.5的添加量对NHNO.,NHCl, (NH4)2S,NaN()3,(NH4)6Mo7()24.4H2(), (NH)2()4,NCONH.,蛋白胨(peptone),酵母 粉(yeastextract)等9种氮源进行产酶对比试验, 从中选取促酶效果最佳的补充氮源,不添加补充 氮的处理作为对照.二是按干料重0.1的添加 第1期王晓晓,冯明光:利用生防真菌孢子粉生产中的废米生产饲用葡聚糖酶和木 聚糖酶的黑曲霉固相发酵条件优化4l 量对MnSO4.HzO,CuSO4.7H20,CaCl2, KH2PO4,ZnSO4.7H2O,MgSO4和FeSO4.7H2O 等7种盐(金属离子)进行产酶对比试验,从中选 取金属离子作为促酶添加剂,不加盐的处理作为 对照.三是用浓度为0.1,0.2,0.3,0.4 和0.5%的吐温8O液代替水拌人物料,比较表面 活性剂含量通过改变细胞膜通透性-8J而对产酶 的影响.四是用不同酸碱度(pH3,10)的水拌人 物料,优化发酵物料中的pH.各处理均重复3 次,发酵54h时取样测定目标酶活. 1.2.4正交试验及其验证在单因素优化 试验的基础上,选取对产酶影响较大的金属离 子类型(CuSO.7H2O,CaC12,KH2PO), (NH)SO添加量(0.59/6,19/6,1.5),拌料 水的吐温80浓度(0.1,0.2,0.3)和酸碱 度(pH4,5,6)进行4因素3水平9处理的L. (3)正交实验,重复3次.由此获得的产酶优化 组合处理再进行3次重复的验证试验. 1.3酶活测定 各试验处理发酵物料中葡聚糖酶和木聚 糖酶的酶活测定参照Miller的经典方法ll.称 取发酵物料1.0g于50mL蒸馏水中,25?振 荡(200r.min)浸提2h.吸取浸提液1mL于 1.5mL离心管中,10000r.min离心1min, 所得的上清液即为粗酶液.取250L0.513一 葡聚糖(或0.5木聚糖,美国Sigma公司产 品)液,55?预热5min,加入适当稀释的粗酶 液50肚L,继而在55?下反应10min后加入 250IDNS终止反应,沸水保温显色5min, 冷却后用紫外分光光度仪测定吸光值OD 每处理抽取3样品,均重复测定3次.在上述条 件下反应1min从8一葡聚糖(或木聚糖)产生1 /,tool葡萄糖(或木糖)所需的酶量定义为一个 酶活力单位/U.样品中的酶量/(U.g干曲) 按葡萄糖(或木糖)的 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 反应曲线计算.标准 曲线基于8I葡萄糖(或木糖)20,30,40,50,60, 70mmo1.L等6个浓度溶液(以双蒸水为对 照)的OD川吸光值而绘制.各处理酶活的测定 均重复3次,并取3份重1.0g的物料在8O? 下烘至恒重为干曲. 1.4数据处理 固相发酵单因子优化试验的酶活数据均按 因子进行方差分析.正交试验数据按 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 要求 进行分析,根据因素及水平的影响大小,针对2 种目标酶的产量选出优化组合.分析工具为 DPS软件[113. 2结果与分析 2.1不同麸米比对酶产量的影晌 麦麸与废米粉的不同配比显着影响发酵3 d的物料中8一葡聚糖酶(F.一25.4,P< 0.01)和木聚糖酶(Fl.2.一35.6,P<0.01)的 产量.2种酶的产量均以纯麦麸处理最高,产量 分别为353.8和343.8U.g干曲,而纯废米 粉处理几乎检测不到酶活.在混合物料中,麸米 比7:3的处理最佳,8一葡聚糖酶产量达317.5 U.g,,木聚糖酶产量达251.1U.g,与纯麦 麸处理相比均差异不显着(Tukey'SHSD,P >0.05)(图1).因此,这一麸米比是可接受的 产酶基础物料配比,能消化利用3O的废米, 需给予进一步优化. 图1麦麸与残米粉配比对发酵3d物料中葡聚 糖酶和木聚糖酶相对酶活的影响 Fig.1Effectofratioofwheatbranandresiduericeon relativeactivityof9-glucanaseandxylanasein3一 daycultures 2.2发酵时间对酶产量的影响 图2给出麸米比7:3物料随固相发酵时 间而变化的产酶动态.G一葡聚糖酶和木聚糖酶 均在发酵54h时产量最高,分别达408.3, 296.6U.g干曲.此后酶产量随发酵时间而 下降,尤以木聚糖酶下降幅度较大.因此,后续 优化试验均采用麸米比7:3的物料配比发酵 54h,作为2种目标酶产量的评价基准. 浙江大学(农业与生命科学版)第35卷 . bo 一 \ 嘟l 龌 图2麸米比7:3配比下25?固相发酵96h期间 p_葡聚糖酶和木聚糖酶的产量动态 Fig.2Productionof~-glucanaseandxylanaseinmixture ofwheatbranandresiduerice(7:3)during96一h solid—statefermentationat25? 2.3影响产酶的单因素分析 在固相发酵过程中影响产酶的单因素试验 结果见图3.在8个含水量处理中,53.5和 55.62个处理的产酶量显着高于过低或过 高的含水量处理(口一葡聚糖酶:F,一10.0,P d0.01;木聚糖酶:F7.一6.6,P<0.01).平 衡考虑目标酶的产量,以55.6含水量处理较 佳,2种酶的产量分别为267.7,203.3U.g 干曲(图3A). 在外加氮源处理(均添加0.5)中,硫酸 铵的酶促效果最佳,B一葡聚糖酶产量(306.7U. g)显着高于添加尿素,草酸铵及钼酸铵的处 理(F一5.8,PG0.01),但与其余处理差异 不显着;木聚糖酶产量(209.3U.g)也显着 高于仅添加尿素,草酸铵及钼酸铵的处理(F 一3.5,P一0.01).总体看,无机氮的促酶效果 优于有机氮,硫酸铵最佳,其次为硝酸铵和氯化 铵(图3B). 发酵物料中的金属盐(均添加0.1), CaC12,CuS0.7H0和KHP0都表现出显 着的促酶效果(p一葡聚糖酶:F.一6.7,P< 0.O1;木聚糖酶:F.1一22.8,PGO.01),其中 尤以KH.PO促B一葡聚糖酶的效果最佳,产量 达489.3U.g,而CaC1促木聚糖酶的效果 最佳,产量达225.1U.g(图3C).添加Mg抖 对酶活影响不大,但Mn抖,Zn抖和Fe则显着 抑制产酶. 拌入发酵物料的水中表面活性剂含量也显 着影响B一葡聚糖酶(F..一16.1,PG0.01)和 木聚糖酶(F,.一32.7,P<0.01)的产量(图 3D).吐温8O含量为0.29/6和0.32个处理 中,2种目标酶的产量均显着高于吐温8O含量 过高或过低的处理.显然,含上述吐温80的处 理有利于提高2种胞外酶向胞外渗透而起到促 进产酶的作用,符合相关报道[5.]. 拌料水的pH影响酶产量甚大(图3E).微 酸水有促进产酶的作用,如pH6的处理中G一 葡聚糖酶产量高达645.5U.g1.,显着高于除 pH5之外的其余处理(F..:28.6,P< 0.01);而木聚糖酶产量在pH4和pH5的处 理中分别为565.7和558.7U.g_.,也都显着 高于其余pH处理(F5,1.一12.6,PG0.01). 2.4影响产酶的多因素分析 在单因素产酶优化试验的基础上,选取对 酶产量影响较大的金属离子类型(因素A),硫 酸铵添加量(因素B),拌料水的吐温80含量 (因素C)和pH(因素D),进行4因素3水平9 处理的正交试验,考查2种酶的产量(表1). 分析表明,供试因素及其不同水平对酶产 量的影响极显着(I}葡聚糖酶:F.,.一27.6,P G0.01;木聚糖酶:F818—9.9,P<0.01).根 据各因素不同水平对产酶量的比较(Tukey's HSD,P<O.05),影响G一葡聚糖酶的各因素排 序为A>D>C>B,最佳组合为A.BC.D.,即 金属盐按干物料重添加0.1的磷酸二氢钾, 外加氮源为0.5%的硫酸铵,拌料水含0.3%吐 温8O,酸碱度应调至pH5;影响木聚糖酶的各 因素排序为C>D>B>A,最佳组合为 A.B.CD.,即物料中加入0.1%KHPO和 1oA硫酸铵,拌料水为0.30,4吐温80和pH5. 分别对上述2个优化组合处理进行3次重 复的验证试验,G一葡聚糖酶和木聚糖酶在 A.BC3D组合处理中的产量(?SD)分别为 (690.0?23.7)和(435.4?9.4)U.g_1干曲, 在ABC.D处理中分别为(716.1?9.2)和 (453.0?62.5)U.g干曲.结果表明,2种目 标酶在2个组合处理中的产量水平基本一致, 与优化前麸米比7:3相同处理的产量(图1) 相比均大幅提高. 第1期王晓晓,冯明光:利用生防真菌孢子粉生产中的废米生产饲用葡聚糖酶和木 聚糖酶的黑曲霉固相发酵条件优化43 300 250 200 15O 100 50 500 400 300 200 i00 O 700 600 500 蛹400 {L 罐300 200 45.9镐.75L253.555.657.459.260.8 含水率/% ABCDEFGH 盐类型 3456789i0 添力口水pH 350 290 230 I70 110 50 350 250 删 50 ABCDEFGHIJ 氮源 nOo.10.20.30.40.5 吐温80/% B:A—CK,B—NH4No3,C=NH4C1, D=(NH4)2So4,E—NaNo3,F一 (NH4)6MoT024.4HzO,G一(NH4)2Cz04, H—NCONHz.I—peptone.J=yeast extract. C:A=CK(nosalt),B=MnSO4. H2O,C—CuSO4.7H2O,D=CaCI2,E— KH2P04,F=ZnSO4-7H2O,G=MgSO4,H — FeS0a.7H2O. 图3固相发酵产葡聚糖酶和木聚糖酶的条件优化 Fig.3Optimizedconditionsforproductionof~-glucanaseandxylanase 表1在4因素(A,B,C和D)3水平9处理的正交试验中葡聚糖酶和木聚糖酶的产量 Table1Yieldsof13-glucanaseandxylanase(mean!-SD)fromninetreatmentsoforthogonale xperimentof fourfactors(A,B,CandD)andthreelevels 注:酶产量用平均值_4_SD表示.同列数据后的不同小写字母表示在P<O.05水平差异显着 一?.n一\嘲髓 一暑_n)\蛐避一8.fl一\哪龌 44浙江大学(农业与生命科学舨)第35卷 3结论 综上所述,基于目前饲用8一葡聚糖酶和木 聚糖酶的固相发酵工艺及常用的麦麸原料,在 发酵基质中掺人生防真菌孢子粉生产过程中产 生的废米粉3O,按照优化的条件进行固相发 酵54h,7-葡聚糖酶产量达690,716U.g干 曲,木聚糖酶产量达435,453U.g干曲,均 远高于优化前纯麦麸处理的2种酶产量353.8 和343.8U.g干曲(图1).麦麸作为饲用酶生 产主要原料的成本相对较高,用3O的废米粉 掺人麦麸生产饲用酶,不仅可直接降低酶制剂 的工业生产成本,还为生防真菌孢子粉生产过 程中产生的大量废米找到新的可利用途径. 对黑曲霉产酶条件的优化试验表明,利用 废米固相发酵生产饲用I3一葡聚糖酶和木聚糖酶 的麸米比配方为7:3,物料含水量为53.5, 55.6,拌料水含0.3吐温8O和pH4,6,并 按物料干重添加0.5,1.0的硫酸铵作为 补充氮源和0.1%的磷酸二氢钾作为微量元素 营养,在25?下发酵54h即可获得较为理想 的2种目标酶产量.这一研究结果为建立无"三 废"产生的环境友好型真菌杀虫剂生产线提供 了有益的启示和技术积累,有利于降低饲用酶 制剂的生产成本. References: [1]ShiWB,FengMG.Fieldefficacyofapplicationof Beauveriabassianaformulationandlowratepyridaben forsustainablecontrolofcitrusredmitePanonychus citri(Acari:Tetranychidae)inorchards[J]. BiologicalControl,2006,39:210-217. [2]PuXY,FengMG,ShicH.Impactofthree applicationmethodsonthefieldefficacyofaBeauveria bassiana—basedmycoinsecticideagainstthefalse-eye leafhopper,Empoascavitis(Homoptera:Cicadellidae) inteacanopyEJ].CropProtection,2005,24: 】67—175. [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] [1o] [11] FengMG,ChenB,YingSHTrialsofBeauveria bassiana,Paecilomycesfumosoroseusandimidacloprid formanagementofTrialeurodesvaporariorum (Homoptera:Aleyrodidae)ongreenhousegrown lettuce[J].BiocontrolScienceandTechnology,2004, 14:531—544 YeSD,YingSH,ChenC,etalNewsolid—state fermentationchamberfitsupbulkproductionofaerial conidiaoffungalbiocontrolagentsonriceIJ]. BiotechnologyLetters,2006,28:799—804. CHENChun,FENGMingguang(陈春,冯明光). Synchronousproductionofconidialpowderofseveral fungalbiocontrolagentsinanuprightmulti—tray conidiationchamber口].JournalofAgriculturalScience andTechnology(中国农业科技导报),2007,9(3): 108—111.(inChinese) ZENGYing,YANGMing(曾盈,杨明).Studieson mediumconditionsforfeedxylanaseproductionby brew'sgrainsfermentationandenzymepropertiesof xylanase_j]ChinaBrewing(中国酿造),2006,9(1): 12—15.(inChinese) IIXiu—ting,YANGShao—qing,JIANGZheng—qiang, etal(李秀婷,杨绍青,江正强,等)Solidstate fermentationforproducingthermostableendoxylanase byT.1anuginosususingagriculturalwastesEJ]. IndustrialMicrobiology(工业微生物),2004.34(4): 13—17.(inChinese) WUMin—ehen,WANGJin,YANGShuyan,ela1. (邬敏辰,王瑾,杨书艳,等).Optimizationofsolid— statefermentationmediumforxylanases[J].Journal ofNorthwestScienceandTechnologyUniversityof AgricultureandForestry(西北农林科技大学), 2006,34(11):11卜116(inChinese) WangY,AlexanderTW,McAllisterTA111vitro effectsofmonensinandTween80onruminal fermentationofbarleygrain:barleysilage-baseddiets forbeefcattle口].AnimalFeedScienceand Technology,2004,】16:197—209. MillerGIUseofdinitrosalicylicacidreagentfor determinationofreducingsugarD].Analytical Chemistry,1959,31(3):426—428. 唐启义,冯明光.DPS数据处理系统:实验设计,统计 分析及数据挖掘[M]北京:科学出版社,2007