用丝状噬菌体主要外壳蛋白展示外源多肽的研究

用丝状噬菌体主要外壳蛋白展示外源多肽的研究 用丝状噬菌体主要外壳蛋白 展示外源多肽的研究 王 丽 ( )东北师范大学遗传与细胞研究所 ,长春 130024 摘要 丝状噬菌体的基因组经过 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 化的修饰 ,可以允许外源氨基酸序列在该病毒颗粒的主要外壳蛋白 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 面上展示. 这一展示系统提供了一个研究蛋白质免疫识别的有效途径. 许多研究结果已表明 ,这一系统具有 ) ) ) ) 以下几个特点 :1免疫反应具有较强的特异性 ;2能够有效地征集辅助 T 细胞 ;3不需要额外添加佐剂 ;4具 有模拟抗原决定簇表位结构的能力. 这些优点表明这一技术将有希望发展成为一个既经济又简便的生产新 型诊断试剂和生物疫苗的有效途径. 介绍了这一技术的发展简史和有关 f d 噬菌体的特性. 同时 ,还讨论了近 年来在利用丝状噬菌体主要外壳蛋白展示外源多肽方面的一些研究结果. 关键词 丝状噬菌体 主要外壳蛋白 抗原决定簇 外源多肽 近些年来 ,有许多新的生物技术纷纷面世 ,其中最令人兴奋的成果之一便是噬菌体展示技术的建立. 这是一种利用丝状噬菌体外壳蛋白来展示外源多肽的新型生物技术. 尽管这 方面的研究还处于初级阶段 ,但它已在生物技术研究的不同领域得到了应用 ,特别是在抗体工 程 ,随机表位文库和利用生物技术开发新药方面. ( 1985 年 Smit h 首先在 Science 上报道了将外源多肽掺入到丝状噬菌体 Fi l a m en t ous bacte2 ( ) ) riop hage , f d的次要外壳蛋白之一基因 3 蛋白 g ?p 的工作. 从此 ,这一研究领域便得到迅 1 ,3 速的发展. 这项技术的主要内容是将蛋白质或多肽的 DNA 序列插入到病毒颗粒外壳蛋 白的一个结构基因的适当位置上. 外源基因将随着外壳蛋白基因的表达而表达. 由于这个修饰了的外壳蛋白保持了与病毒颗粒的兼容性 ,外源基因的产物便随着病毒颗粒的重新组装而 展示到病毒外壳蛋白的表面. 在那里 ,它们可以像一个配体或效应子一样在许多重要的生物 4 系统中发挥作用. 丝状噬菌体展示技术主要与 2 种外壳蛋白有关. 一种由基因 3 编码 ,蛋白的亚单位仅有 () 几个 不超过 5 个. 另一种由基因 8 编码 ,有大约 2 700 个亚单位 ,被称为主要外壳蛋白. 基 因 3 蛋白则被称为次要外壳蛋白. 这 2 种蛋白质均可作为载体来展示外源多肽或蛋白质 ,但 是各有优缺点. 基因 3 蛋白展示系统的最突出特点是对外源多肽或蛋白质的大小无严格限制 ,较长的多 5 , 6 肽甚至整个蛋白质都可整合到基因 3 外壳蛋白中. 所以 ,在构建抗原决定簇文库时 ,常常 使用基因 3 蛋白为载体. 这一系统的缺点是由于外壳蛋白亚单位数太少 ,使它在免疫学和生 物疫苗研究中的应用受到限制. 在基因 8 外壳蛋白上展示的多肽 ,能够在没有任何佐剂的情况下刺激生物体产生较强的 免疫学反应. 这种反应具有高的特异性. 这是由于病毒基因 8 蛋白可以为外源多肽提供突出 4 的 ,多重的展示结果. 如果展示的多肽是一个已知的连续表位 , 那么 ,以一种高度有效的方式来模拟这个蛋白的免疫学特性是完全可能的. 基因 8 系统存在的问题是对外源多肽长度的 () 限制 详见下述. () 本文将重点讨论利用丝状噬菌体 f d基因 8 外壳蛋白展示外源多肽的一些研究进展.1 f d 噬菌体的主要特性 f d 噬菌体是与 M13 和 f 1 非常 μ相近的病毒. 它是一个长度约 1m , 直径为 6 nm 的可变棒状体. 主要组 成是一个由 2 700 个主要外壳蛋白 亚单位形成的封闭管鞘和一个单链 (() ) 环状的 DNA 核心 图 1 a. 主要外 壳蛋白含有 50 个氨基酸残基 , 很大 7 α程度上是呈2螺旋. 它有一个富 含酸性和亲水残基的 N 末端 ; 一个 由 19 个残基组成的非极性和疏水的 序列和一个富含碱性残基的 C 末端. 这些蛋白质亚单位是以瓦片状螺旋 图 1 野生型和工程化的丝状噬菌体模式图 排列 , 并与长轴形成一个小角度. 蛋() ( ) ( ) a野生型丝状噬菌体 ; b重组型丝状噬菌体 ; c杂合型丝状噬菌 白质亚单位的 N 端位于颗粒的外 体. 重组型噬菌体的所有 2 700 个主要蛋白亚单位都展示插入的多肽 ,而 杂合型噬菌体只有部分的蛋白亚单位可展示插入的多肽 侧. 这一结构对于展示外源多肽具 有特殊的意义. 因为外源多肽通常 被整合到基因 8 蛋白的 N 端附近. 这样可以确保多肽在病毒颗粒表面充分地展示. 这一点在 有效地刺激生物体产生抗体方面尤为重要. f d 噬菌体一般只能感染含 F 因子的大肠杆菌. 但是没有 F 因子的菌株通过转染引入噬菌 8 体基因组也能产生有感染能力的噬菌体颗粒. 噬菌体的感染并不杀死宿主细胞 , 它们能继 续进行细胞分裂 , 并释放出噬菌体 , 只是生长速度大大降低. 野生型 f d 噬菌体基因组为 6 408 个碱基对. 作为一种载体 , 它的长度可以随着插入的 DNA 片段大小而发生变化. 正是由于这个特点 , 才使这类噬菌体早已成为进行 DNA 测序和 寡核苷酸直接诱变的载体. 噬菌体基因组的复制型是双链 DNA , 所以将外源片段克隆进入载 体的操作比较容易. 这类噬菌体还具有一个非常重要的特点 , 即具有很好的免疫原性. 有实 4 验表明 ,产生抗 f d 的抗体不需要任何佐剂. 这一特征在进行生物疫苗的开发上具有重要的 价值. 2 f d 基因 8 蛋白展示系统 外源多肽展示系统的表达载体主要有 2 种类型. 一种为噬菌体载体. 利用这种载体形成 (( ) ) 的重组病毒的所有 2 700 个主要外壳蛋白的亚单位均可展示外源多肽 图 1 b. 使用这种载 体的问题是 , 外源多肽的长度不能超过 6 个氨基酸. 另一种载体为噬菌粒. 这种质粒包含有 丝状噬菌体基因间区 , 这一区域是基因表达和噬菌体颗粒包装所必需的. 还包括至少一种外 壳蛋白的编码序列. 使用噬菌粒形成的是杂合噬菌体 , 一部分外壳蛋白亚单位是野生型的 , (( ) ) 一部分亚单位整合有外源多肽 图 1 c. 杂合噬菌体展示多肽的频率要小于重组噬菌体的 百分之百展示频率. 一般 30 %,40 %的主要外壳蛋白亚单位可以展示 12 个或 12 个以上的氨 9 基酸残基. 为什么杂合噬菌体的展示频率会下降 , 至今还不清楚. 但是 , X 射线衍射研究表明 , 并 不是由于外壳蛋白 N 端的空间不够造成的. 推测可能是由于病毒组装的缺陷所至. 这种限制 10 是发生在加工过程还是发生在包装过程中还有待于研究. 3 展示多肽的免疫学性质 小的合成多肽通常不是好的抗原. 若要有效地激起免疫学反应 , 往往需要与一个大的载 体结合或者使用佐剂. 在基因 8 外壳蛋白的 N 末端展示的多肽 , 可以在无佐剂的情况下产生 9 , 11 12 较强的免疫学反应. 免疫反应的强度比基因 3 蛋白上的外源多肽所产生的要高得多. 在免疫印迹实验中 , 用在兔子中产生的抗体去抵抗各种杂合噬菌体颗粒. 结果表明 , 抗血清 可以直接抗野生型外壳蛋白和杂合外壳蛋白. 而抗野生型外壳蛋白的抗体可以通过层析柱法 9 被去除. 剩余的抗体制备物可以直接地单独抗外源多肽. 这是一种制备抗多肽抗体的新方 4 法. 它与传统的载体蛋白化学偶联法相比 , 要简单和便宜得多. 更令人感兴趣的是 , 抗外源多肽的抗体具有强的特异性. 例如 , 用 3 种蛋白免疫小鼠. () ) ( 这 3 种蛋白是 : 野生型噬菌体 f d、杂合噬菌体 f d / f dMAL 1 插有 NAN PNAN PNAN P 多肽 () 和杂合噬菌体 f d/ f dMAL 2 插有 NDDS YIPSA E KI的主要外壳蛋白. 另外 , 用化学 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 合成 ( ) 与插入多肽相同的序列 , 并将其与匙孔 血蓝蛋白 Keyhole limpet haemocyanin偶联. 一系 ( ) 列的酶联免疫吸附 EL ISA实验表明 , 抗野生型噬菌体的抗体不与合成多肽起反应. 而抗杂 13 合噬菌体的抗体也只抵抗序列相同的合成多肽 , 不与另一种合成多肽起反应. 这个实验清 楚地表明 , 杂合噬菌体产生的免疫反应具有高的特异性. 抵抗杂合噬菌体表位的免疫学反应是 T 细胞依赖型的 , 因为在 BALB/ C 裸鼠中 , 产生抗 ( ) 体的滴度很低. 另外 , 在杂合型鼠 nu/ + 中可观察到从免疫球蛋白 M 向 G 的转变 , 而在纯 13 ( ) 合型裸鼠 nu/ nu中未观察到. 在没有佐剂的情况下产生强的免疫学反应表明 , 辅助 T4 细胞的活动是被直接刺激产生的. 4 天然多肽表位结构的模拟 如果在丝状噬菌体外壳蛋白上展示的合成多肽与某一天然蛋白质的表位相同 , 那么它便 14 可以刺激生物体产生抗这种天然蛋白表位的抗体. 所以 , 噬菌体展示系统可以用来模拟天 然蛋白质的某些功能. 人类免疫缺陷病毒 H IV 的主要中和决定区是一个链内二硫桥环 , 被定 15 , 16 义为 V3 , 位于糖蛋白 gp 120 可变表面的第三高变异区内. 当模拟 V3 环序列的多肽与 适当的载体偶联后 , 显示了刺激中和 H IV 抗体形成的能力 , 并且可作为细胞毒的 T 淋巴细 17 ,19 胞及抗体依赖 T 细胞中介免疫性的靶子. ( ) 有实验证明 , 一个展示 12 个多肽残基序列 IH I GP GRA F YT T的杂合噬菌体是一个具 有显著效果的自然表位的结构模拟. 它能够在鼠中诱导抵抗亲本菌株 H IV21的中和抗体形 MN 4 20 . EL ISA 实验表明 , 这种结构模拟比传统的化学方法至少灵敏 1,2 个数量级.成 总之 , 在一个适当的环境中 , 丝状噬菌体所展示的多肽可以作为一种高效地模拟天然蛋 白质连续表位的方法. 当然 , 这方面的研究还有相当多的工作要做. 有必要对展示多肽的结 构与天然表位结构进行比较 , 去探索一种更完善的方法. 5 噬菌体展示技术的应用 虽然噬菌体展示技术发展的时间并不长 , 许多基本理论问题还有待于解决 , 但它在生物 科学研究和应用中的前景已充分地显示出来. 在医学疾病的诊断方面 , 工程化噬菌体已显示出了一些突出的优点. 载有特定多肽序列 ) 的噬菌体可作为一种有价值的抗原进行疾病的诊断. 这种噬菌体抗原的优点是 : 1生产成本 低廉. 由于这种病毒颗粒的基因产物无需裂解宿主细胞便可分泌到培养液中 , 免去了复杂费 ) 时的后期纯化过程 , 使成本大大降低 ; 2有可能利用一种噬菌体展示两种蛋白的抗原决定 ) 簇 , 这样便可开发出能同时诊断一种以上疾病的诊断抗原 ; 3噬菌体颗粒可在相当长的时间 内保持稳定 , 这一点对研究和应用非常适用. 以上这些优点使这项技术更加引人注目. 目前 , 已有实验室将重组噬菌体用于血清鉴定的分类工作中. 展示某种特异性血清抗原决定簇的重 21 组噬菌体有希望被发展成为一种诊断试剂. 最令人感兴趣的应用是新型疫苗的开发工作. 目前已构建成了 10 的 12 次方的抗体表达 21 噬菌体库. 有理由相信将来可以从这种多肽库中直接钓取不同的抗体. 噬菌体展示技术在 ) ) 生物疫苗开发上应用的优点可以总结为以下几个方面 : 1免疫反应具有特异性 ; 2具有征 ) ) 集辅助 T 细胞的能力 ; 3免疫学反应的产生不需要使用额外的佐剂 ; 4可以模拟天然的抗 原表位的结构. 以上这些特点表明 , 这项技术有可能发展成为一种既经济又简单的生产生物 疫苗的途径. () 致谢 本工作为吉林省科委应用基础基金 批准号 : 970556- 1资助项目. 参 考 文 献 1 Smit h G P. Filamento us f usio n p hage : novel exp ressio n vecto rs t hat display clo ned antigens o n t he virio n surface . Science , 1985 , 228 : 1 315 Scot t J K. Discovering peptide ligands using epitope libraries. Trends Biochem Sci , 1992 , 17 : 241 2 Smit h G P. Surface display and peptide libraries. Gene , 1993 , 128 : 1 3 Per ham R N , Terry T D , Willis A E , et al . Engineering a peptide epitope display system o n filamento us bacteriop hage . 4 F EMS Micro biol Rev , 1995 , 17 : 25 Clackso n T , Wells J . I n v i t ro selectio n f ro m p rotein and peptide libraries. Trends Biotechnol , 1994 , 12 : 173 5 So umillio n P , J espers L , Bo uchet M , et al . Phage display of enzymes and i n v i t ro selectio n fo r catalytic activit y. Appl 6 Biochem Biotechnol , 1994 , 47 : 175 Marvin D A , Hale R D , Nave C , et al . Molecular mo dels and st ruct ural co mpariso ns of native and mutant class I filamento us 7 bacteriop hage . J Mol Biol , 1994 , 235 : 260 Rasched I , Obrer E. Ff colip hage : st ruct ural and f unctio nal relatio nship s. Micro biol Rev , 1986 , 50 : 401 8 Greenwoo d J , Willis A , Per ham R N , et al . Multiple display of fo reign peptides o n a filamento us bacteriop hage . Peptides f ro m 9 Pl as m odi u m f alci pa r u m spo rozoite p rotein as antigens. J Mol Biol , 1991 , 220 : 821 10 Malis P , Terry T D , Gowda L R , et al . Role of cap sid st ruct ure and membrane p rotein p rocessing in deter mining t he size and cop y number of peptides displayed o n t he majo r coat p rotein of filamento us bacteriop hage . J Mol Biol , 1996 , 260 : 9 11 Minenkova O , Ilyichev A , Kishchenko G , et al . Design of specific immunogens using filamento us p hage as t he carrier . Gene , 1993 ,128 : 85 De la Cruz V , L al A , McCutchan T. Immunologenicit y and epitope mapping of fo reign sequences via genetically engineered fil2 12 amento us p hage . J Biol Chem , 1988 , 263 : 4 318 13 Willis A E , Per ham R N , Wrait h D. Immunological p roperties of fo reign peptides in multiple display o n a filamento us bacterio2 p hage . Gene , 1993 , 128 : 79 Arno n R. Synt hetic peptides as t he basis fo r vaccine design . Mol Immunol , 1986 , 28 : 209 14 Go udsmit J , Debo uck C , Meloen R , et al . Human immuno deficiency virus t ype 1 neut ralizatio n epitope wit h co nserved archi2 15 tect ure elicit s early t ypespecific antibo dies in experimentally infected chimpanzees. Proc Natl Acad Sci U SA , 1988 , 85 : 4 478 16 J avaherian K , L anglois A , McDanal C , et al . Principal neut ralizing do main of t he human immuno deficiency virus t ype 1 enve2 lope p rotein . Proc Natl Acad Sci U SA , 1989 , 86 : 6 768 Bolognesi D P. Inmmuno biology of t he human immuno deficiency virus envelope and it s relatio nship to vaccine st rategies. Mol 17 Biol Med , 1990 , 7 : 1 J avaherian K , L anglois A , L aRo sa G , et al . Broadly neut ralizing antibo dies elicited by t he hypervariable neut ralizing deter mi2 18 nant of HIV- 1 . Science , 1990 , 250 : 1 590 Defoo rt J P , Nardelli B , Huang W , et al . Macro molecular assemblage in t he design of a synt hetic A IDS vaccine . Proc Natl A2 19 cad Sci U SA , 1992 , 89 : 3 879 Di Marzo Vero nese F , Willis A E , Boyer- Tho mp so n C. St ruct ure mimicry and enhanced immunogenicit y of peptide eiptopes 20 displayed o n filamento us bacteriop hage , The V3 loop of HIV- 1 gp120 . J Mol Biol , 1994 , 243 : 167 ( ) 21 王 林 , 郁 萌. 利用丝状噬菌体展示技术进行抗原决定族图谱及其基因工程的研究. 生物工程学报 , 1996 , 12 3: 235 ( )1997209230 收稿 ,1997212230 收修改稿 大陆地壳磁性结构研究及其意义 ??? 高刘庆生 郑建平 山 ( ) ?中国地质大学应用地球物理系 ,武汉 430074 ; ?中国地质大学地球科学学院 ,武汉 430074摘要 评述了大陆地壳磁性结构与地壳构造 、变质相 、物质组成 、下地壳与壳2幔交换等相互关系的研究进展. 应用岩石磁学与矿物磁学的基本理论 ,提出了进一步研究的建议. 强调建立创新的地质思维 ,加强重 、磁 、电 、 震与深部地质过程相互关系的综合研究. 将大陆地壳的磁性结构与密度结构 、电性结构 、速度结构 、热结构及深部地球动力学过程的相互关系作为一个深部地质系统进行研究. 关键词 大陆地壳 磁性结构 变质相 壳2幔交换 深部构造 70 年代以来 ,随着科学技术的迅猛发展 ,人们可以利用磁卫星对全球地磁场进行全面 、系统地观测 ,并与近地表空间范围内的高精度航磁测量及现代 数学 数学高考答题卡模板高考数学答题卡模板三年级数学混合运算测试卷数学作业设计案例新人教版八年级上数学教学计划 物理方法与计算技术相结合 () ( 反演解释磁异常. 其结果一方面利用全球区域磁异常 不同波长与科学创新的地质思维 或 ) 地质概念 、地质模型等相结合对区域构造直接进行地质解释 ;另一方面运用合理的数学2物理 模型 ,反演出区域不同尺度地壳的磁性分布 ,然后依据磁性与岩石 、矿物 、地球化学组分的相互 关系 ,推测大陆地壳的结构. 然而 ,磁卫星与航磁异常的解释结果通常只能得到地壳深部大尺度地质构造的分布特征 ,如磁卫星长波长磁异常主要反映大陆下地壳的结构特征 , 而航磁异 常则主要反映局部地质结构 ,如中 、上地壳范围内断裂构造 、基底及岩浆岩分布等 , 它们均无 法给出大陆地壳内部的细结构. 随着世界范围内多个出露高级地体和麻粒岩包体的岩石学 、 地球化学研究的深入 ,人们普遍认为 ,这些出露的高级地体和麻粒岩包体可以作为窥探地壳深 1 ,2 部结构及地球动力学过程的窗口, 它们为大陆地壳磁性结构研究提供了一条重要途