苹果中多酚氧化酶特性的测定不完全2
有关于苹果中多酚氧化酶的实验
原理:多酚氧化酶是引起果蔬酶促褐变的主要酶类。在苹果中，酶促褐变主要是因多酚氧化酶氧化内源的酚类物质生成邻醌，邻醌再相互聚合或邻醌与蛋白质，氨基酸等作用生成高分子络合物而导致褐色素的生成，色素分子量愈高，颜色愈暗，严重影响制品的营养、风味及外观品质。PPO的来源不同，它们的理化性质也存在较大的差异，因而对同一物理或化学处理的敏感性不同。在生产实践中，根据原料的不同种类，来源和加工特点，合理选择PPO活性的抑制方法，对提高产品质量有重要作用。
材料:无伤痕，无病害，品质良好的成熟苹果，品种为酸王，于4?贮藏备用。
试剂:丙酮，磷酸盐缓冲溶液，邻苯二酚溶液，PVPP，Triton-100.
Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚) 免疫细胞化学中，
Triton X-100常用浓度为1%和0.3%，但通常是先配制成30%
的Triton X-100储备液，临用时稀释至所需浓度。
30% Triton X-100的配制: 试剂:Triton X-100 :28.2ml,
0.05mol/L PBS(pH6.8) 72.8ml
配制方法:取Triton X-100及PBS混合，置37?,40?水浴中2,3h，使其充分溶解混匀。用前取该储备液稀释至所需浓度。
所需实验测出的数据及相关内容:ph对PPO的影响及其稳
定性，最适反应温度及其它的热稳定性，对底物专一性的高低，不
同抑制剂对反应的抑制程度，PPO的酶促动力学参数。
实验步骤设计:
(1) 苹果洗净后在4?保温，再去皮后取果肉200g，立即加入冷
冻丙酮500ml,用高速组织捣碎机匀浆2min;用布氏漏斗抽
滤，滤饼用200ml冷冻丙酮再次提取抽滤，白色粉末在蒸发
皿中，在室温下干燥，即得PPO丙酮粉。
(2) 称取丙酮粉0.5g,溶于250ml 0.05mol/L.ph6.8的预冷磷酸
盐缓冲液溶液，用磁力搅拌器搅拌20min,5000r/min离心
10min,上清液过滤，即得苹果PPO粗酶液。
选取方法:称取100g苹果果肉加入含1%PVP的
0.2mol/L，pH6.8磷酸盐缓冲液(一5C，250ml)，然后
用匀浆机打碎，再l0000r/min转速下捣碎3min，将
糊状的苹果混合物用FL一20型冷冻离心机，在0C，
60000r/min条件下离心15min，将清液和沉淀分离，
沉淀中再加入含1%PVP的0.2mol/L，pH7.0磷酸盐
缓冲液(一5C，250ml)，然后再与第一次捣碎相同的
条件下捣碎3min，再冷冻离心(条件同第一次);所得的
沉淀排除，而所得的清液与第一次得到的清液混合(约
为500ml)。即粗酶液。
在混合清液中加入已在一18C下冷却的丙酮(一15C，1000ml);丙酮要慢慢地加入，一边加入，一边慢慢地搅拌，加入完毕保持15min，然后冷冻离心(条件同上);所得的清液进行丙酮回收，而所得的沉淀1000ml，一5C的含1%TWEEN80的0.2mol/L，pH7.0磷酸盐缓冲液，捣碎5，然后用磁力搅拌机3C下搅拌lh，最后进行冷冻离心(条件同上)，所得的沉淀排除，而所得的清液即为多酚氧化酶液，称PPO，其量约为1000ml.(成功提取)
1， PPO活性的测定 取0.05mol磷酸盐缓冲溶液1cm比色
皿中，加入0.1M邻苯二酚溶液1ml,PPO粗酶液0.5ml,
混匀后在400mm处比色，酶液加入后开始计时，每30s
记录一次OD随时间的变化值，以最初直线段的斜率(?
D/t)计算酶活力，一个酶活力单位定义为:在测定条件
下，每分钟引起吸光度改变0.01所需的酶量。 2， ph对PPO活性及稳定性的影响 配制0.05M醋酸钠缓
冲液(ph 3.5/5.6),0.05M磷酸盐(KH2PO4—NAOH)缓冲
溶液(ph 5.8/8.0)在1cm比色皿中，加入食盐所设定的
缓冲溶液1.5ml,0.1M邻苯二酚溶液1ml,PPO粗酶液
0.5ml,混匀，在室温下测定PPO的活性。
采用常规方法，在不同温度(范围10~60?，间隔为2?，ph为6.2)和不同ph(范围3.0~9.0，间隔为0.2，温度28?)条件下测定PPO活性(最大活性管为100,相对活性)。 稳定性的影响:分别吸取0.2ml酶液，加在0.4ml不同ph的缓冲液中于30?保温30分钟，然后将此保温的PPO酶液与2.4ml0.05mol/L的邻苯二酚溶液(ph5.0)于30?反应，测定PPO的残留活力。
3， 温度对PPO活性的影响及其热稳定性的影响 在1cm比色皿中，加入0.05M磷酸盐缓冲液(ph6.6)1.5ml,0.1M邻苯二酚溶液1ml,在某一温度(20/50)保温5min,加入相同温度下保温5min粗酶液0.5ml，迅速测定PPO的活性。
热稳定性 PPO粗酶液在100 水浴处理一定时间后立即置于水浴中，然后再反应体系Ph6.0室温下测定PPO的活性。
4， 抑制剂对PPO活性的影响 用0.2mol/L磷酸盐缓冲溶液(ph6.0)，配制不同浓度的黄酮化合物和抗坏血酸抑制剂溶液，在反应体系ph6.0，室温下测定PPO的活性。
第一次实验失败原因:
1， 邻苯二酚已经被氧化，所以测出的实验
数据不正确;
2， 对紫外可见分光光度仪的应用不熟练; 3， 在实验过程中Ph的调节不是非常正
确，应该有较大的误差;
4， 在溶液的配制中，存在着某些不确定因
素，因而对实验造成的误差; 5， 在制取出PPO后，有较长时间没有进
行处理，所以存在较大误差; 6， 在研磨时温度没有控制好，造成酶的失
活可能性较大;
7， 澳洲青苹，富士，红星，金帅， 8， 如何测酶活力,在紫外可见分光光度
仪上怎样辨别,吸光度和酶活力有什
么关系,该如何去对应,在最大吸收
峰处(首先如何测定较为准确的最大吸
收峰)怎样测定酶活力,相对酶活力? 9， 对PVPP的配制，要找出确定的值，因
不考虑其对实验的影响因素，所以不做
详细的实验，只加进去适量就可 10， 峰值高度和酶活力呈正相关。 11， 以吸光度为竖坐标，不用一酶活力
为竖坐标，进行比较，因其与酶活力呈
正相关。
12， PPO活性测定时，底物邻苯二酚与
PPO酶的用量之间的比例, 13， 在进行单因素实验时，试验因素的
机动性如何安排,间隔为多少,温度，
Ph,以多大为间隔，需要多少组数据可
以完成实验安排,
14， 酶的比活力如何计算，如何对应紫
外可见分光光度仪上的吸光度, 15， 如何用酶的比活力做竖坐标，来绘
制曲线,
16， 对照组如何控制?以什么为底物,
以什么为参照,
17， 各种溶液的浓度如何控制, 18， 在410，412，420处的最大吸收峰
是如何出现的,
19，
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