矿山酸性水微生物研究方向论文之一

矿山酸性水微生物研究方向论文之一 08级生物技术专业毕业论文 1. 绪 论 1.1矿山酸性污水的介绍 酸性矿井水AMD(acidmine drainage) 是由煤层和围岩中含有的硫化物(主要是 3+[1]黄铁矿 FeS) ,在化学氧化剂 (O, Fe)和氧化亚铁硫杆菌(Thiobacillus ferro 2 [2][3]简称 T. f菌)作用下,发生氧化反应而形成的。AMD的 pH通常很低..严重oxidans, 3+2-的地方可达 pH2.0 ,富含SO离子和 Fe 离子,易浸出废矿石中的有毒元素 ,如铅、砷、4 [4]铬、铜等以及氰化物 ,对矿业生产、生态环境造成严重危害 ,因而近几十年来 ,关于酸性矿井水的研究一直受到人们的关注。一般认为酸性矿井水的形成是氧化亚铁硫杆 3 +菌、Fe和O 共同作用的结果 ,其中 T. f菌起着决定性的作用。只有在分子水平上研2 究该菌种..才能对它的机理进行全面的了解。 1.2嗜酸菌的研究概况 1.2.1嗜酸菌的生理特性 氧化亚铁硫杆菌(Thiobacillusfe rrooxidans):是生物湿法冶金过程主要的浸矿菌种。这种菌系短杆菌..很小..0.3-0.5x1.0-2.0um..圆钝末端..以单个、双个或几个成短链状存在。是一种化能自养菌..专性好氧..嗜酸性..广泛生活在金属硫化矿和煤矿的酸性矿坑水中。最适生长温度25-30?。生长在pH1.4-6.0之间..最适pH2.0-2.5。T.f以氧化亚铁、元素硫以及还原态的硫化合物等来获得生命过程所需的能量..以空气中的二氧化碳为碳源..以氨或铵盐为氮源。有鞭毛..能快速游动..革兰氏染色阴性。在9K固 [5]体培养基上呈红棕色菌落..近杆形。 [6]Schrenket用DNA印迹技术和 SSUrRNA序列荧光分子杂交技术 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 了氧化亚铁硫杆菌的分布和丰度 ,认为该菌不生长在矿体区 ,而是生长于较近的温度更低( <30 ?)的 pH更高( >1.3)的区域 ,是一种机会菌。其生长周期为 6,10d,菌落为黑色 ,直径为 0.5 mm,菌落周围为分散的铁锈色的斑渍区域 ,细菌和菌落形态分别见图1,1、1,2 1 08级生物技术专业毕业论文 图1-1 电镜观察氧化亚铁硫杆菌的细胞图 图1-2 电镜观察氧化亚铁硫杆菌的细胞图 [7]氧化硫硫杆菌(Thiobacillusth iooxidans,T.t)由Waksman和Joffe首先分离得到。短杆菌..0.5x1.0-2um..单生、对生或成短链。以硫单质、无机硫化物为能源..因能迅速氧化硫单质而著称。生长温度2-40?..最适温度25-35?生长pH0.5-6.0..最适pH2.0-3.5。在硫代硫酸盐固体培养基上的菌落极小(一般小l.0mm)..透明或白黄色..在延长培养时变清亮..边缘完整;在液体培养基中均一浑浊..含硫培养液pH<1。革兰氏阴性..严格好氧..是专性自养极端嗜酸性的化能无机营养菌..广泛分布硫化矿床和酸性矿水及土壤中..在细菌浸矿等多方面都有应用价值..但生长缓慢..对重金属如砷、汞、银等缺乏 [8]抗性。 1.2.2嗜酸菌的氧化机理 自二十世纪六十年代以来..因为它们具有特殊的生物学功能..吸引了许多学者对T.f和T.t的生理特性进行了研究。许多研究表明..T.t利用单质硫的能力比T.f强..但 [9]T.t不能利用硫酸亚铁。Wong和Henry对氧化硫酸亚铁的机理进行了详细的研究..指出能将亚铁氧化成三价铁..三价铁会与硫酸根离子发生反应产生铁矾沉淀..同时产生硫酸而引起pH的下降: 4FeSO+ 0+2HSO? 2Fe(SO)+2HO (1-1) 4224 2432 3++ 2-6Fe+4SO+12HO ? 2HFe(SO)(OH)+10H(1-2) 423426 [10][11]Templellvl和Leathen等人研究发现氧化亚铁硫杆菌能将矿物中的硫化矿物氧 [12]化为硫酸和硫酸盐。Bryne等对T.f氧化硫化矿物的机制进行了详细的研究。并提出了一些常见矿物的主要反应机理..如黄铁矿和黄铜矿: 2 08级生物技术专业毕业论文 2FeS+ 70+2H0?2FeSO+2H SO (1-3) 222424 [13]4FeSO+ 0+2HSO?2Fe(SO)+2H0(1-4)42242432 [14]Cu FeS+40?Cu S0+FeSO(1-5) 2244 2CuS+0+2H SO?2CuS+2CuSO+2H0(1-6)222442 CuS+20?Cu S0(1-7) 24 1.3.微生物分子生态学研究的一般 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 和原理 微生物分子生态学是分子生态学的重要组成部分..是分子生物学、微生物生态学、微生物生理学与遗传学相互结合而产生的一门边缘学科。从目前的发展状况来看..当前的主要研究领域有:采用分子生物学技术研究不同自然环境中微生物的种类组成和群落结构以及它们的数量动态;环境因子对微生物基因表达的影响:自然条件下微生物之间遗传物质的转移:微生物与高等生物相互作用的分子机制..包括共生关系的建立、病原微生物的致病机制等。因此..微生物分子生态学是利用现代分子生物学的基础理论与技术..在分子水平上..研究微生物与其生态环境间相互关系的一门新兴学科。 1.3.1.一般研究方法 1)平板涂布分离。 2)显微镜观察:普通光镜、相差显微镜、透射电镜、扫描电镜。 3)MPN法..即最大或然值计数法..是平板涂布分离法的一种..但由于广泛应用..被单 独作为微生物研究的一种技术。 4)活菌计数法..常见的用哑咙橙染色..活菌死菌颜色不一样。 1.3.2 分子研究方法 1)纯种分离..G+C测定、16S rDNA, ISR测序、比对。 2)变性梯度凝胶电泳(DGGE)..通用引物PCR扩增同样长度的基因..常为16S的一段(300-400bp ),割胶纯化、克隆测序..比对变性梯度凝胶电泳((DGGE)技术以土壤微生物群体的基因组DNA为研究对象..通过比较不同土壤中各种微生物的16SrRNA基因信息来了解微生物的多样性。 3 08级生物技术专业毕业论文 3) FISH荧光原位杂交..设计不同荧光染料标记的特异探针.. 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 不同分类界元水平的细菌..可在细胞水平或者核酸水平与目标菌种杂交..在表面荧光显微镜或者CLSM(共聚焦激光扫描显微镜)下监测。 4) TRFLP..末端限制性长度多态性。 5) ARDREA. RISA。 6) 流式细胞仪计数。 7) Real-time实时荧光定量PCR监测技术。 8)克隆转化法:通用引物扩增从水样、土样中提取得总DNA..获得全长的16S rDNA序列..随机克隆入载体..转化到大肠杆菌..挑取阳性菌落..用不同的限制酶酶切检测不同的克隆..测序、比对。 9) DNA芯片技术..主要用来研究微生物的功能基因组学。 1.4 本论文的立论依据 3+2-AMD的 pH通常很低..严重的地方可达 pH2.0 ,富含SO离子和 Fe 离子,易浸出废4 矿石中的有毒元素 ,如铅、砷、铬、铜等以及氰化物 ,对矿业生产、生态环境造成严重危害 ,所以就AMD的研究越来越重要。我国自1959年以来..对微生物处理污水的技术的研究已取得了一定的成果..但重点放在污水菌种的保藏的研究方面..而且就整体情况而言与国外相比要差的远..在污水处理微生物生物学方面的研究相对于前者明显滞后。不仅设备、工艺落后..更主要的是对微生物本身没有作进一步的研究..缺乏对菌种生物学性状较为全面的认识..譬如菌种的生理、生化性状以及分类地位的了解..缺乏对菌种分子水平上的认识及其在污水处理过程中菌种所参与的机理等的研究..因而也就不能很好的指导生产实践。从目前发表的一些较为零碎的文献及几本专著看出..在酸性污水中细菌的研究方面..生物领域的科技工作非常薄弱..主要是一些污水治理方面的专业人员在从事相关研究。 目前..我国对浸矿细菌的资源开发工作做的远远不够..根据国内外文献报道..用于处理酸性污水的细菌有氧化硫硫杆菌(A.Thiooxidans)和氧化亚铁硫杆菌((Acidithi );钩端螺菌(Leptospirillum)、中等嗜高温菌..如文献报道的obacillus ferrooxidans 硫化杆菌属(Sulfobacillus)..如热氧化硫化杆菌(Sulfobacillus thermosuidooxidan) 4 08级生物技术专业毕业论文 以及一些未确定分类位置的细菌、嗜酸嗜高温古细菌等。就细菌遗传多样性、系统学研究工作来说..目前国内发表的文献主要集中在放线菌、根瘤菌、嗜盐碱的古菌方面..对硫杆菌其他浸矿细菌的多样性及系统发育工作而言..国内尚见较为系统的报道。因此..对硫杆菌及其它浸矿细菌的多样性研究就很有必要。 1.4.1硫杆菌(Thiobacillus)及其它嗜酸菌分子系统学研究目标及意义 在地球表面广泛分布有元素硫及其金属化合物而形成的许多特殊环境..如硫铁矿、地表及海底的含硫热泉等。近年来..由于各国微生物学家对极端环境条件中的微生物资 使得硫铁矿、含硫热泉等酸性条件中的微生物多样性的研源的研究开发成为一个热点.. 究取得了较快的进展..发现了许多生理生化性状特殊的细菌..其中有些归属于硫杆菌..有些目前还未确定其系统位置。分子生物学技术在含硫的酸性环境微生物系统学、生态学研究中的广泛应用..不仅发现了许多常规技术不能发现的新细菌..也对这些细菌的分类及系统学地位的确定提供了有力的手段..同时对一些已知细菌的分类及系统位置进行了修订..使得传统意义上的硫杆菌分类更趋合理..尽量可以建立一个亚利士多德所谓的接近于自然的分类体系。对氧化亚铁硫杆菌系统学地位的确定不仅具有重要的理论意义..对指导细菌浸矿等生产实践中优良菌株的选择也具有直接的应用价值。我国地域广阔..各种含硫的矿产资源及自然生态环境非常多样化..蕴含着非常丰富的代谢硫的细菌资源..而倍受国外微生物学家的关注..因此加大这些细菌资源的开发和研究力度..将为这些细菌的生产应用实践奠定理论基础。本课 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 研究的目标之一就是大量开发我国不同酸矿环境中的微生物资源..尤其是一些硫氧化细菌及其这些细菌的分子系统学的研究。 1.4.2 不同环境中嗜酸菌的遗传多样性研究及其意义 由于Acidithiobacillusferrooxidans,A.thiooxidans, A.caldus, Leptospirill 这几种细菌能够氧化亚铁、还原性的金属硫化矿..目前被广泛应用于微umferrooxidans 生物湿法冶金、煤和天然气脱硫、酸性矿区的生态恢复治理、污水处理等技术..使得这些细菌成为微生物学家研究的热点之一。但是由于硫矿的化学组成不同与含硫酸性环境在地球上的生态分布与多样性极其复杂..使得这类细菌同一种不同菌株的生理生化性状表现出显著的不同..形成了表型差异明显不同的菌株..同时造成这些细菌不同菌株的遗传组成差异显著..即所谓的遗传多样性.利用分子生物学技术研究这些细菌的遗传差异..不仅有助于筛选、鉴定出性状明显不同、在浸矿实践中针对不同化学组成的矿体 5 08级生物技术专业毕业论文 表现高效的菌株..反过来也可以从物种进化上阐明不同环境造成的选择压对细菌进化的作用以及细菌对环境的适应性..进一步对表型差异悬殊、介于相似种之间的菌株的系统学地位重新进行研究修订..并且有助于阐明自然界广泛分布的许多代谢硫、铁有关的细菌的起源及进化关系。目前..虽然微生物冶金基础研究被列为国家973重点基础发展计划..但我国在浸矿细菌的生物学基础研究方面所作的工作几为空白..对这些细菌的多样性有待进一步研究挖掘。从世界各地大量采集分离纯化菌株..进一步阐明这些细菌的分子系统学及进化关系..从遗传多样性的角度选择优良菌株..为应用于生产实践提供理论基础。 由于我国生态环境多样性非常丰富..存在各种各样的富含金属及硫化合物的生态环境..因此有可能分离到生理及遗传差异明显的不同菌种..存在非常丰富的种以上水平和种下水平的多样性。但到目前为止..国内对嗜酸细菌物种多样性和遗传多样性的研究几乎为空白..基于此这两个细菌多样性的研究是本课题的主要目标之一。 1.5 本论文研究内容 本论文采用了铜陵矿区酸性污水..对其中的优势菌进行了分离..并且提取了它们的DNA..对其进行了PCR..然后测出它们的序列..研究该菌种的性质..对其进行了分子学方面的研究..为后续的研究做好基础。 1.6 技术路线图 6 08级生物技术专业毕业论文 第一步:查阅资料，在适宜的温度和培养基的配制、细菌的了解菌各方面的性质 时间里去矿区取培养、细菌提取、细菌 酸性污水和污泥 DNA的提取及鉴定 查阅有关9K液体培养基的配对去年夏季酸性菌的制、9K固体培养基取的污水进文献、资的配制 行培养 料 查阅有关对细菌进行了液体细菌及其于今年4月去培养和固体培养 DNA的铜陵矿区去 提取的文酸性污水和 献和资料 污泥 杂质的去除、细菌的查阅有关提取、细菌DNA的对污泥进行了DNA鉴提取 初步的提菌和定方法的 培养 文献和资 料 聚合酶链式反应 (PCR)体系的选 择、进行PCR 制胶、将PCR产物 进行凝胶电泳、紫外 透射成像、测序 铜陵矿区酸性污水 的中DNA的鉴定 7 08级生物技术专业毕业论文 2. 材料和方法 2.1 实验材料 2.1.1 废水水样 (1)采样地点的选择 硫杆菌分布较广..矿区的土壤、水体、污泥中都可能存在。经过分析比较..本研究决定从铜陵矿区采集含有T.f和T.t的两种菌种的污水样品。 (2)采样方法 在铜陵矿区用已经灭菌的样品瓶直接取酸性污水..因为考虑T.f和T.t这两种菌的最适生长温度都在25-30?..所以取污水应该选择天气较好的日子..我选择了在四月底取污水。这时的温度大概在20,30?..可以避免温度对菌的影响。此时pH为2.0左右。 2.1.2 仪器 GL20A 高速冷冻离心机 ZHWY-2112B 全温度恒温摇床 TDL-5-A 离心机 ALC-110.4 电子天平称 Biosens SC8108 电泳凝胶成像分析系统 MIKRO 22R 高速冷冻离心机 DYY-11型 电泳仪 Applied Biosystems 2720 Thermal cycler PCR扩增仪 2.1.3 基本试剂 名称 生产厂家 CaCl0.1mol/L) 广东汕头市西陇化工厂 2( 10×buffer TDNA Ligase Fermentas 4 8 08级生物技术专业毕业论文 RNaseA (10 mg/mL) Solarbio dNTP(10mM) Solarbio Primer 1(10μM) 上海生工生物科技服务有限公司 Primer 2 (10μM) 上海生工生物科技服务有限公司 DNA Marker 上海Sangon公司 Taq DNA Polymerase(2.5U/μL) Fermentas 10×Taq buffer Fermentas 琼脂(AR) 青岛冻粉厂 氢氧化钠(AR) 宿州化学试剂厂 NHCl(AR) 天津化学试剂厂 4 Tris-饱和酚(BR) 北京市双翔达生化试剂仪器经营部 氯仿 (AR) 上海化学试剂有限公司 异戊醇(AR) 国药集团化学试剂有限公司 CATB Solarbio NaCl (AR) 广东汕头市西陇化工厂 蛋白酶K Fermentas SDS Sigma 无水乙醇 上海苏懿化学试剂有限公司 琼脂糖 Solarbio Tris Solarbio 乙二胺四乙酸(EDTA) 上海东懿化学试剂公司 溴化乙锭(EB) 上海东懿化学试剂公司 TE缓冲液 上海东懿化学试剂公司 9 08级生物技术专业毕业论文 KHPO天津化学试剂三厂 24 KNO 天津化学试剂三厂 3 MgSO•7HO 天津化学试剂三厂 24 FeSO•7HO 天津化学试剂三厂 24 DNA Template 自提 2.1.4 培养基 [13](1)固体平板分离TSM (Vista, P. , J. Gen. Appl Microbial. 1989) solution A: (NH4)2 SO4 3.0g, KC10.1 g, K2HP04 0.05g, MgS04.7H20 0.5g, Ca(N O3)2 0.01 g蒸馏水600mL 用稀H2SO4调p H 2.5 121?高压灭菌15min冷却至60 ? solution B: FeS04.7H20 22.0g溶于150m1蒸馏水..用稀H2SO4调p H 2.5虑膜过滤除菌 solution C: 6g凝胶溶于250m1蒸馏水p H7.0 1210C高压灭菌15min冷却至60?凝胶选用agarose 或agar (bacteriological) solution A与B, C依次混合均匀..无菌的倒平板 (约25m1) [14] (2) 9K液体培养基 将4.8gFeS04-7H20溶于60m1蒸馏水中..搅拌均匀..用1:1(体积比..下同)硫酸调节pH至2.0..装于100m1棕色试剂瓶中。将( NH4)2SO4 3.00g,KC1 0.1Og,K2HP04 0.50g,MgS04- 7H20 0.50g,Ca(N03)20.0lg加入800m1蒸馏水..用1:1硫酸调pH至2.0左右..分别取80 m1分装于3个250m1锥形瓶中..塞上棉塞..用牛皮纸包扎..120?下高压灭菌30min。然后加入上述经过滤的FeSO4-7H20溶液20m1..摇匀待用。 2.1.5 DNA提取试剂 TE : 1 M Tris-Hcl (PH8.0) 1ml+0.5 MEDTA (PH8.0) 0.2ml+100mlddH2O,高压灭菌20分钟..4?保存。 1 M Tris-Hcl (PH8.0): 12.11g Tris+80mlH2O?调至PH8.0(加Hcl)?100ml,灭菌..4?保存。 10 08级生物技术专业毕业论文 0.5 MEDTA (PH8.0):18.61 gEDTA+80mlH2O?磁力搅拌?调至PH8.0(加NaOH)?100ml,灭菌..4?保存。 10,SDS:10GSDS+H2O?100ml 5mol/l Nacl: 5M Nacl+ H2O?100ml CTAB/ Nacl: 4.1g Nacl+ 80 ml H2O?缓慢加入CTAB 10g?100ml 0.8,凝胶 0.8g凝胶+100ml 10×TBE缓冲液 10×TBE缓冲液 10.8gTris+5.4g硼酸+0.93gEDTA(2 ml0.5M EDTA溶液)..?100ml,灭菌..4?保存。 13,聚乙二醇 13gPEG+1.6mol/lNacl溶液?100ml STE:10g蔗糖，5ml 1 M Tris-Hcl (PH8.0)+2ml 0.5 MEDTA (PH8.0)+2ml5mol/l Na cl定容至100ml 溶菌酶0.5g/ml: 0.25g酶，500ulddH2O 70,乙醇: 70 ml乙醇+30 ml超纯水 氯仿:异戊醇(24:1): 氯仿24 ml+异戊醇1ml 2.2 实验方法 2.2.1 废水微生物的分离 2.2.1.1 分离培养微生物常用器皿的准备 ?将要用到的器皿进行灭菌(如三角瓶、培养皿、玻璃棒等)。 ?用高温蒸汽灭菌..具体操作是:将水加到一定高度..放入待灭菌的物体.. 盖上锅盖..将温度调节到121?..时间调节到30分钟..查看是否漏气..开始灭菌。 等压力降到0..打开锅盖..取出物品..放到烘箱里烘干。 ?取出物品..进行下一步实验。 2.2.1.2 分离培养微生物 ?将无菌操作台进行灭菌处理半小时..然后打开通风扇..通风10分钟..将物品放 11 08级生物技术专业毕业论文 在操作台上。 ?实验步骤进行实验..实验结束..将操作台打扫干净。 (2(2 微生物的纯化 2 [15]采用平板划线法对要分离的菌落进行纯化:在超净工作台的无菌环境下..用接种环从每种培养基上挑取要分离纯化的菌落..采取划线法接种到相应同样的培养基上培养。培养条件与分离培养时的培养条件保持一致..纯化培养皿标记应与挑取菌落的培养皿标记一致 。记录所挑取菌落的形态、颜色、大小等特征..并每天观察培养基上菌的生长情况。 2.2.3 微生物的富集 采用液态培养的方法对分离的菌株富集培养:首先..纯化培养后观察培养基上应形成形态、颜色等特性均一的菌群..且与纯化过程中接入的菌落特性保持一致..否则说明纯培养染杂菌。确定为纯培养后..在超净工作台的无菌环境下..用接种环挑取纯培养的菌落接入到同样的液态培养基中。最后..于37?..200r/min的 恒温摇床上培养..24h后观察培养基中菌株的生长情况。 2.2.4 显微镜初步鉴定分离的菌落 2.2.4.1 涂片 在超净台的无菌环境下..滴一滴蒸馏水于载玻片中央..用接种环或接种针挑取少许目的菌落到蒸馏水滴中..混匀并涂成薄膜。 2.2.4.2干燥固定 室温自然干燥后..涂面朝上通过酒精灯火焰2~3次。 2.2.4.3镜检 先用普通光学显微镜10倍物镜找到..再用40倍、100倍物镜观察..并记录下观察菌株的显微形态..最后用显微镜成像仪拍照。 2.2.5 16S rRNA分子生物学方法鉴定 2.2.5.1 总DNA的提取和纯化 12 08级生物技术专业毕业论文 1)DNA提取准备 ?清洗移液管;准备好高速冷冻离心机,、台式离心机、水浴锅、50mL离心管、移液器、吸头、0.5 mL或1.5 mL离心管。 ?配制CTAB/NaCl溶液、氯仿:异戊醇(24:1)..酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)..异丙醇..70% 乙醇..TE..10% SDS..蛋白酶 K (20mg/ml或粉剂)..5mol/L NaCl。 2)DNA提取 ()[17]..[18]传统方法: ?100ml 菌株过夜富集培养液, 4000r/pm离心5分钟, 去上清液。 ?用PH2.0的硫酸洗沉淀2遍..10000rpm/min 离心10分钟。加600μlSTE。 ?加9.5ml TE悬浮沉淀, 并加0.5ml 10% SDS, 50μl 20mg/ml(或1mg干粉)蛋 K, 混匀, 37?保温1小时。 白酶 ?加1.5ml 5mol/L NaCl, 混匀。加1.5ml CTAB/NaCl溶液, 混匀, 65?保温20 分钟。 ?用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提, 5000r/pm离心10分钟, 将上清液移至 干净离心管。 ?等体积氯仿:异戊醇(24:1)抽提, 取上清液移至干净管中。 ?加1倍体积异丙醇, 颠倒混合, 室温下静止10分钟..沉淀DNA。用玻棒捞出DN A沉淀, 70%乙醇漂洗后, 吸干,溶解于1ml TE, -20?保存。如DNA沉淀无法捞 出,可5000rpm离心, 使DNA沉淀。 ?用加入10 μl RNaseA(10μg/μl), 37? 10分钟, 除去RNA (RNA对DNA的操 作、分析一般无影响..可省略该步骤)。 加入1/10体积的3mol/L NaAc及2×体积的冰乙醇,混匀,-20?放置20分钟左右,D NA形成絮状沉淀。 ?DNA沉淀用70%乙醇漂洗3次,再在干净吸水纸上吸干。 ?将DNA重溶解于1ml TE, -20贮存。 13 08级生物技术专业毕业论文 试剂盒法: (1) 加入200μlTE..加6μl溶菌酶..加入400μl Digestoin Buffer ..混匀..加3μl Proteinase K.. 55?保温5分钟。 (2)加260μl 无水乙醇..混匀..然后用1,ml Tip 头将样品全部转移到2,ml收集管内的UNIP-10柱中。 (3)8000rpm离心一分钟。 (4)取下UNIP-10柱..弃去收集管中的废液。将柱放回收集管中..加入500μl Wash solution, 10000rpm离心半分钟。 (5)重复(4)一次。 (6)取下UNIP-10柱..弃去收集管中的废液。将柱放回收集管中..10000rpm离心一分钟..以去除残留的Wash solution。 (7)将柱放回新的洁净的1.5ml离心管中..在柱中央加50μl Elution Buffer,室温放置2分钟。 (8)10000rpm离心一分钟..得到DNA..重复(7)可提高DNA浓度。 2.2.5.2 PCR扩增 ()[19]..[20]1)PCR扩增准备 2)配制试剂 0.8,凝胶 0.8g凝胶+100ml 10×TBE缓冲液 10×TBE缓冲液 10.8gTris+5.4g硼酸+0.93gEDTA(2 ml0.5M EDTA溶液)..?100ml, 灭菌..4?保存 500 mmol/L KCl 100 mmol/L Tris?HCl(pH8.3..室温) 15 mmol/L MgCl 2 4×dNTP: 14 08级生物技术专业毕业论文 1 mmol/L dATP 1 mmol/L dCTP 1 mmol/L dGTP 1 mmol/L dTTP Taq酶 1U/μL 1ng/μL DNA模板 引物1(27tf):5’- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3’ 引物2(R1492):5’- TACCTTGTTACGACTT -3’ 引物溶液浓度 10 pmol/μL (2)准备好PCR热循环仪、琼脂糖凝胶电泳系统、吸头、0.2 mL PCR管。 2)PCR扩增 (1)在0.5 mL Eppendorf管内配制25 μL反应体系 反应物 体积/μL ddHO 11.0 2 10x PCB缓冲液 2.5 2.5 mmol/L dNTP 2.0 25mmol/L MgCl2 1.5 引物1 1.0μL 引物2 1.0μL 模板DNA 5.0μL Taq酶 1.0 (2)按下述程序进行扩增 ? 94? 预变性5min; 15 08级生物技术专业毕业论文 ? 94? 变性 1min; ? 52? 退火 1min; ? 72? 延伸 1min; ? 重复步骤?,?35次; ? 72? 延伸7 min。 (3)琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果 取10 μL PCR产物加2.0 μL loading buffer..在1.0%琼脂糖凝胶(含EB终浓度为0.5 μg/mL)上..进行电泳..电泳条件为80 V..90 min..电泳结束后在Biosens凝胶成像系统进行检测和记录。 2.2.5.3 测序分析 将检测到的阳性克隆送测序公司(上海生工)测序..测序仪器为ABI377DNA自动测序仪。 所得核酸序列通过运行BLAST程序对NBCI GeneBank数据库进行序列同 [21]源性比对..以确定待测微生物的种属。 16 08级生物技术专业毕业论文 3.结果与分析 3.1培养结果与分析 3.1.1分离培养结果与分析 1)分离培养结果 表3-1 分离培养结果 来源 培养基 培养状况 1号 营养琼脂 菌斑呈不规则形状..黑色 2号 嗜酸选择性 菌斑呈圆形..红棕色 分离培养如图3-1、3-2 图3-1 分离培养1号 加亚铁硫杆菌 图3-2 分离培养2号 加亚铁硫杆菌 (2)分离培养结果分析 1号培养基很可能被空气中的霉菌污染 2号培养基是在PH2.0的条件下进行培养..所以具有很高的选择性..长出的是我们所需要的菌。 3.1.2纯化培养结果与分析 17 08级生物技术专业毕业论文 纯化培养结果如图3,3..3,4 1) 图3-3 同等条件下不加细菌的培养液 图3-4 同等条件下加细菌的培养液 2)纯化培养结果分析 加入细菌和不加细菌培养结果完全不一样..所以..通过这个实验..我们既可以得到细 菌培养液..也可以就此鉴别出细菌有无氧化亚铁的能力。 3.2显微镜镜检结果与分析 1)我们将培养出的细菌进行了显微镜镜检 显微镜镜检结果如图3-5 图3-5 显微镜镜检图 18 08级生物技术专业毕业论文 2)显微镜镜检分析 图中有呈杆状的细胞..几个成一个链或单个分散..体积较小..这正是硫杆菌的特点。 3.3分子生物学结果与分析 3.3.1 PCR扩增结果分析 将提取出的DNA样品依据细菌16s rDNA 保守序列设计的引物进行PCR扩增..扩增湖电泳结果如图3-6 Stl1 Stl2 Stl3 Maker 图3-6 16s rDNA片段PCR扩增的电泳图谱 由图可以看出..从培养矿区污水微生物中都扩增出三段16s rDNA片段..扩增特异性较强..产物条带均一..可直接用于测序。 3.3.2 测序结果分析 Stl 16s rDNA片段测序结果如下 Stl AACATGGCGGCTGCTGACCATGCAGTCGAACGGTAACAGGTCTTCGGGTGCTGAC 19 08级生物技术专业毕业论文 GAGTGGCGGACGGGTGAGTAATGCGTAGGAATCTGTCTTTTAGTGGGGGACAACCCAGGGAAACTTGGGCTAATACCGCATGAGCCCTGAGGGGGAAAGCGGGGGATCTTCGGACCTCGCGCTAAGGGAAGAGCCTACGTCTGATTAGCTAGTTGGTAGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCAGTAGCTGGTCTGAGAGGACGACCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTTCGCAATGGGGGCAACCCTGACGAAGCAATGCCGCGTGGATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTCCTTTCGTGGGGGACGAAAAGGCGGGTCCTAATACGATCTGCTGTTGACGTGAACCCAAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGGGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATCACTGGGCGTAAAGGGTGCGTAGGCGGTACGTTAGGTCTGTCGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAATGGCGGTAGAAACCGGCGAACTAGAGTATGGGAGAGGGTGGTGGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAACATCAGTGGCGAAGGCGGCCACCTGGCCCAATACTGACGCTGAGGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGAATACTAGATGTTTGGTACCTAGCGTACTGAGTGTCGTAGCTAACGCGATAAGTATTCCGCCTGGGAAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGGCTTGACATGTCCGGAATTCTGCAGAGATGCGGGAGTGCCCTTCGGGGAATCGGAACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTGCCAGCGGTTCGGCCGGGCACTCTAGGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCTTTATGTCCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGCGTACAGAGGGAAGCCAAACCGCGAGGTGGAGCAGACCCCAGAAAGCGCGTCGTAGTTCGGATTGCAGTCTGCAACTCGACTGCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTAGATTGTACCAGAAGCAGCTAGCCTAACCTTCGGGAGGGCGGTAGTCACGATACGACCTGGGCT 将测序结果输入NBCI..利用软件进行序列同源性对比..结果见表3-1 表3-2 Stl 样品和其他微生物16s rDNA序列同源性比对 Accession No. similarity Bacteriun with related bacterial sequence EF059759 1441/1441 Acidithiobacillus ferrooxidans strain TGS 16S ribosomal RNA gene (100,) 20 08级生物技术专业毕业论文 EU652051 1441/1469 Acidithiobacillus ferrooxidans strain af1 16S r ibosomal RNA gene (98,) EU084700 1441/1450 Acidithiobacillus ferrooxidans strain S-2 16S r ibosomal RNA gene (99,) EF446232 1441/1493 Uncultured bacterium clone placa1_f6 16S rib osomal RNA gene (96,) EF059757 1439/1441 Acidithiobacillus ferrooxidans strain S-1 16S r ibosomal RNA gene (99,) DQ909077 1441/1587 Acidithiobacillus ferrooxidans strain 2 16S rib osomal RNA gene (90,) AF376018 1441/1460 Acidithiobacillus sp. NO-8 16S ribosomal RN A gene (99,) 比对结果显示:菌株Stl 16S rDNA的全系列与细菌氧化亚铁硫杆菌亲缘关系较近.. 16SrDNA序列的相似性达到98,。该菌最常发现在酸性矿区废水中。 将测序结果及BLAST比对结构..并用mega4软件构建进化树分析序列同源性..如图 3-7 21 08级生物技术专业毕业论文 图3-7 用mega4软件构建Stl进化树 比对结果显示:菌株Stl与与嗜酸氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans,简称A.f)亲缘关系较近..16S rDNA序列相似性达到98,以上。嗜酸氧化亚铁硫杆菌是一种能够以亚铁、单质硫、以及硫化物作为能量来源的化能自养菌,因为此特性,其是生物湿法冶金中主要浸矿菌种之一. 3.4 讨论 3.4(1 酸性污水中菌的分离纯化 在酸性污水中有很多中菌种..但是具有优势的菌种就只有嗜酸菌..所以在分离培养过程中..我们主要是抓住这点..所以在制培养基时我们采用PH2.0..所以得到的菌种大部分是我们想要的菌种..这给分离培养带来了很大的便利。 3.4(2 酸性污水中嗜酸菌DNA的提取 我们试图从污水中直接取出它的DNA..但是屡试屡败..所以我们不得不先进行扩大培养..再从培养液中提取菌种的DNA。而且就提取DNA的方法我们用了将近半年的时间就提取方法进行改进..终于我们研究出了一套提取方法。 22 08级生物技术专业毕业论文 3.4(3 PCR 由于PCR扩增的偏向性..即对不同的模板..采用不同的引物和扩增条将..扩增结果 [22]不同。PCR扩增的偏向性导致扩增出的16s rDNA结果有一定的偏向性..构建的16s rDNA克隆文库中所代表的各种微生物类群的比例并不一定能反映原样品中各种微生物的类群比例..进行优势类群的研究也就缺少了科学依据..因此对PCR反映条件的摸索是相当有必要的。由于实验条件的限制..本研究采用细菌的16s rDNA通用引物为扩增引物..循环35次..其他条件与 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 条件一致..PCR扩增结果有一定的偏向性。 23 08级生物技术专业毕业论文 4.结论与展望 通过传统的显微镜镜检技术结合16S rDNA分子生物学方法鉴定从矿区酸性污水中获取的菌株(Stl)..通过构建进化树进行16S rDNA同源性分析..S1的16S rDNA的全系列与氧化亚铁硫杆菌亲缘关系较近..16S rDNA序列相似性达到98,。 在研究的基础上..进行微生物优势群落的生理生化分析和限制多态性分析..可继续进行矿区酸性污水微生物类群多样性的研究..进而研究矿区酸性污水微生物类群的结构和分布的特异性..进而确定这些菌株分类学和系统发育学地位。由于条件有限..本研究许多方法、步骤还有待改进和完善(比如在提取污泥中细菌的方法上我们有待改进)..在未分离和测序的种群中..还蕴藏着丰富的微生物资源..需要进行进一步的研究。随着工业污水微生物资源研究理论的发展和研究技术的完善..人们必定从工业污水微生物中获得瞩目成果..更好地为人们的生产生活服务。 24 08级生物技术专业毕业论文 参考文献 [1] 布坎南 R E,吉本斯 N E(中国科学院微生物研究所译 ). 伯杰细菌鉴定手册 (第八 版 ) [M ].北京:北京科学出版社 ,1981. 636,637. 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