解淀粉芽孢杆菌Y-32-1产细菌素概述.doc

解淀粉芽孢杆菌Y-32-1产细菌素概述.doc 解淀粉芽孢杆菌Y-32-1产细菌素概述 第一章 文献综述 1.1细菌素的分类 羊毛硫细菌素是一类在自身核糖体合成，经翻译后修饰形成具有特殊氨基酸的环状多肽。这类细菌素由 19-50 个氨基酸残基组成，分子量一般小于 5kD。因其含有羊毛硫氨酸lanthionine，Lan)等特殊氨基酸而得名。一般由革兰氏阳性菌产生，包含葡萄球菌属、芽孢杆菌属、乳球菌属、链球菌属、链霉菌属、微球菌属、肠球菌属以及乳杆菌属等[5]。其中乳酸链球菌素Nisin)是这一类的代表，一般由乳酸链球菌分泌产生的一类小分子多肽化合物，其作为食品防腐剂已有 60 多年的应用历史，较化学合成防腐剂对羟基苯甲酸类、苯甲酸及其盐、山梨酸及其盐)相比，乳酸链球菌素具有热稳定性好、抗菌性强、安全无毒、作用范围广、水溶性好等合成防腐剂无法比拟的优点，另外，一些羊毛硫细菌素由于杀菌方式独特，不易产生耐药性且作用浓度较低，已处临床试验阶段或已被批准作为药品[6]。β-甲基脱氢丙氨酸Dehydrobutyrine，Dhb)和脱氢丙氨酸Dehydroalanine，Dha)。特殊氨基酸的形成过程如下:首先核糖体合成的前肽分子中苏氨酸或丝氨酸在修饰酶的作用下脱去一分子水，形成 Dha 或 Dhb，然后其与分子中的半胱氨酸发生加成反应，形成硫醚键即为 MeLan 或 Lan。其生物合成过程如下:首先结构基因编码的前肽 LanA包括原肽和前导肽两部分)被合成，依靠其前导肽的作用，修饰酶 LanB 和 LanC 或双功能的 LanM 对原肽序列的苏氨酸或苏氨酸进行脱水，然后与分子内的半胱氨酸的自由巯基发生加成反应而形成硫醚键，修饰后的 LanA 被加工转运蛋白 LanT 转运至胞外并切除或由蛋白 LanP 酶切前导肽，形成具有生物活性的成熟肽;成熟肽产生大多受基因簇上的双组份调控系统LanK/LanP 调控，同时 LanE、LanF、LanG 等蛋白对成熟肽产生免疫作用，防止对自身造成伤害[7]。 .. 1.2细菌素的作用机制 普遍认为细菌素的作用分为两个步骤:首先是以非特异性或特异性的细胞为靶向物，专一性地吸附到易感细胞表面的受体上，然后再发挥其杀菌作用。大部分乳酸菌细菌素似乎表现为一种共同的作用方式，即通过在细胞膜上形成孔洞释放出胞内的离子如 K十)， 从而造成电子传递体的解偶联，引起质子泵的丧失，影响某些物质的运输和 ATP 的合成，影响能量代谢及阻断 RNA、蛋白质、DNA 等大分子物质的合成等，最终引起细胞的死亡[16]。目前认为 lantibiotic 型细菌素的靶细胞侵入细胞膜内形成通透孔道，可允许分子量为 0.5kDa 的亲水性溶液通过，导致细胞膜去极化及 ATP 外泄，细胞外水分子流入，K+离子从胞浆中流出，细胞自溶而死亡。因其作用需膜电位的存在，通过在膜上形成通道，降低 pH 梯度和膜电位，导致细胞内溶物外泄而抑菌，故又称此类细菌素为能量依赖型细菌素[17]。非 lantibiotic 型的细菌素同样也是在细胞膜上形成一个亲水通道，但是这个亲水通道是经细胞膜上特定的受体蛋白自导的，与膜电位存在与否无关，故称此类细菌素为非能量依赖型细菌素[18]。与 lantihiofic 型相比，此型细菌素的作用是破坏细胞膜功能的稳定性如能量传导)，而不是破坏膜结构的完整性。其中细菌素对芽孢的作用机理研究了解得甚少，目前所知的大部分都是关于乳酸链球菌素方面的研究。乳酸链球菌素可以起到抑制芽孢而非杀死芽孢的作用，它可以阻断肉毒梭菌C.botulinum)芽孢前期至出芽孢之阳撇过程。其机理也许在于乳酸链球菌素可以修饰己萌发的芽孢的胞膜的巯基，也许是由于乳酸链球菌素的疏水残基可起到电子受体的作用。 第二章 高产细菌素菌株的筛选、鉴定及其所产细菌素性质的初步研究 2.1 实验材料 2.1.1 菌株来源 本实验室从烟台黄曲霉污染严重的不同地区的 44 个土壤样品中分离得到94 株细菌 2.1.2 供试指示 菌株金黄色葡萄球菌 本实验室保藏 大肠杆菌 本实验室保藏 白色念珠菌 本实验室保藏 2.1.3 实验仪器 WFZ UZ-2000 型紫外可见光分光光度计 上海尤尼柯仪器有限公司 FBZ2002-UP 标准试剂型超纯水机 青岛富勒姆科技有限公司 DHG 系列电热恒温鼓风干燥箱 上海新苗医疗器械制造有限公司 精密电子天平 上海民桥精密科学仪器有限公司 电子万用炉 北京市永光明医疗仪器厂 不锈刚手提式灭菌器 上海申安医疗器械厂 单人双面超净工作台 苏州安泰技术有限公司 2.2 实验所需培养基、试剂的配制 2.2.1 培养基 (1)LB 液体培养基配方 蛋白胨 10g/L，酵母粉 5g/L，氯化钠 10g/L，蒸馏水 1000mL，pH 调至 7，121?高温高压灭菌 20min，备用。 (2)LB 固体培养基的配方: 蛋白胨 10g/L，酵母粉 5g/L，氯化钠 10g/L，琼脂 20g/L，蒸馏水 1000mL，pH 调至 7，121?高温高压灭菌 20min，备用。 (3) 沙氏培养基的配方: 蛋白胨 10g/L，琼脂 20g/L，葡萄糖 40g/L，蒸馏水 1000mL，115?高温高压灭菌 30min，备用。 .. 第三章 Y-32-1 所产细菌素......33 3.1 实验材料 .......33 3.1.1 菌种 .....33 3.1.2 实验仪器 ....33 3.1.3 实验试剂及药品 ......34 3.1.4 培养基 ........34 3.2 实验方法 .......35 3.3 结果与分析 ......... 38 3.4 本章小结 ...... 58 第四章 Y-32-1 所产细菌素的分离........59 4.1 实验材料 .......59 4.1.1 菌种 .....59 4.1.2 实验仪器 ....59 4.1.3 实验试剂及药品 ......59 4.1.4 培养基 ........60 4.2 实验所需试剂的配制 ........60 4.3 实验方法 .......60 4.3.1 细菌素的分离和纯化 .....60 4.3.2 电喷雾质谱ESI-MS)..........62 4.4 结果与分析 ..........62 4.5 本章小结 .......67 4.4 结果与分析 洗脱液三氯甲烷/甲醇/乙酸100/1/1;v/v/v)为 1-10，洗脱液三氯甲烷/甲醇/乙酸100/3/1;v/v/v)为 11-30，洗脱液三氯甲烷/甲醇/乙酸100/8/1;v/v/v)为 31-38，洗脱液三氯甲烷/甲醇/乙酸100/13/1;v/v/v)为 39-45，洗脱液三氯甲烷/甲醇/乙酸100/30/1;v/v/v)为 46-54。由图 4-2 可知，11-30 抑菌活性最好，因此洗脱液三氯甲烷/甲醇/乙酸100/3/1;v/v/v)能够把目标产物得到纯化。将 ESI-MS 为 500-700 局部放大得到图 4.4，对其中 ESI-MS 的峰值分析表明:碎片中有许多氨基酸残基，如:Val、Glu、Thr。因此，初步鉴定该物质为脂肽类的细菌素。由于产物纯度和质量不够，因此，还不能确定出目标物质的具体结构和分子量。据报道，芽孢杆菌能够产生多种抗菌物质，Peypoux 等[93]从枯草芽孢杆菌中分离得到Iturin，Vanittanakom等[94]从枯草芽孢杆菌中分离纯化得到Fengycin。它们大多为低分子量脂肽类物质。本文所分离的物质与前人相比在性质方面有所差别:Fengycin 不溶于水，而本文的活性物质却有很好的水溶性，下一步的计划是对其结构进行更深入的研究，相应机理方面的工作也正在准备之中。 结论 1、从烟台黄曲霉污染严重的不同地区的 44 个土样中分离到的 94 株细菌，初筛到 43 株具有不同程度的抑菌活性，从中选取一株对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及白色念珠菌都有抑菌活性的菌株，命名为 Y-32-1。根据菌株 Y-32-1 的形态、生理生化特性和 16S rDNA 系统发育分析，将其鉴定为解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens)菌株 Y-32-1 所产细菌素具有很好的耐酸碱性，发酵上清液抑菌活性的 pH 值为 1-13。该细菌素对热很稳定，沸水浴 1.5h 抑菌活性没有明显变化，100?、2h 的热处理下活性降低到原来的 70%。该细菌素对胰蛋白酶不敏感，对脂肪酶敏感，因此，可以推断该细菌素中可能含有酯键。 2、在单因素实验的基础上，对发酵条件进行 Plackett-Burman 实验，确定玉米浆浓度、培养温度和培养基起始 pH 值为影响发酵液的抑菌活性的主要因素。设计爬坡实验得到最佳实验中心点，通过响应面分析法对这三个因素进行了研究，最终确定最佳培养条件为:种龄为 20h、接种量 5%、装液量70mL/250mL、温度 31.6?、初始 pH 值 7.2、摇床转速 120r/min。最佳发酵培养基条件为:玉米浆 31.7g/L、蔗糖糖蜜 2.0g/L、氯化钠 6g/L、磷酸二氢钾 5g/L、磷酸氢二钠 5g/L。优化后细菌素的抑菌圈直径 24.6667mm，比优化前相比，细菌素的抑菌圈直径提高了 12.16%。 3、本实验对菌株 Y-32-1 产生的抗菌活性物质进行了分离纯化并对其抑菌活性进行了相应的研究。在纯化过程中通过有机溶剂萃取、盐酸沉淀和柱层析的手段达到了分离纯化的目的。该物质易溶于水、极性有机溶剂，具有一定的亲水性。通过质谱推测该物质为肽类。