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医学论文-使用FLAG标签肽及慢病毒载体共同筛选小鼠foxp3基因RNA干扰的有效靶点.doc

医学论文-使用FLAG标签肽及慢病毒载体共同筛选小鼠foxp3…

海河里的鱼本尊
2017-10-30 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《医学论文-使用FLAG标签肽及慢病毒载体共同筛选小鼠foxp3基因RNA干扰的有效靶点doc》,可适用于学术研究领域

医学论文使用FLAG标签肽及慢病毒载体共同筛选小鼠foxp基因RNA干扰的有效靶点使用FLAG标签肽及慢病毒载体共同筛选小鼠foxp基因RNA干扰的有效靶点作者:史艳侠韩文杰彭柔君张景航黄慧强姜文奇【摘要】【目的】筛选高效的foxpRNA干扰的靶点用于阻断CDCDTreg细胞的免疫抑制功能。【方法】使用oligoengine软件设计foxp基因shRNA序列化学合成法合成条shRNA序列构建含foxp的靶序列的慢病毒载体构建出表达FLAG融合蛋白和目的基因的工具细胞T细胞用于筛选RNA干扰的有效靶点【结果】成功包装了条foxp基因靶序列相应的慢病毒颗粒成功构建了表达融合蛋白和目的基因的T工具细胞在工具细胞上筛选出了条RNAi效率分别为,和,的有效靶点。【结论】使用FLAG融合蛋白和慢病毒载体能够筛选出Foxp基因的RNAi最佳靶点。【关键词】foxpFLAG蛋白慢病毒载体,CDCDTregRNA干扰Abstract:【Objective】ToscreenthehigheffectiveRNAinterveningtargetsoffoxpgenetoblocktheimmunosuppressionofCDCDTregs【Method】FourshRNAsequencesweredesignedbyoligoenginesoftwareandsynthesizedbychemicalmethodLentiviralvectorthatconsiststargetsequencesoffoxpwasconstructedTheTtoolcelllinethatexpressFLAGfusionproteinandtargetgenewasconstructedtoscreentheeffectivetargetsforRNAinterference【Result】LentiviralvectorthatcontainsfoxpcDNAsequenceswasconstructedsuccessfullyTheTtoolcellsthatexpressFLAGfusionproteinandfoxpgenefragmentswereconstructedsuccessfullyTwoeffectivetargetsforRNAiwerescreenedinTtoolcells,theblockingefficiencywereandrespectively【Conclusion】TheoptimaltargetsofFoxpgeneforRNAicanbescreenedbyFLAGfusionproteinandlentivirusvectorKeywords:FoxpFLAGfusionproteinLentiviral,CDCDTreg,RNAinterfereFoxp是一种转录抑制因子是forkheadwingedhelix家族成员和细胞生长发育的调控有关后来越来越多的证据表明foxp可能是一种CDCDTreg免疫抑制性调节细胞发育、分化的至关重要的基因并在其表型和功能的维持中起非常关键的作用。目前foxp基因已经成为免疫治疗的一个重要的靶点引起越来越多的关注。但是CDCDTreg细胞仅占外周CDT淋巴细胞的,体外分离的成本高昂而且目前还没有很好的体外扩增方法这为进一步的体外研究带来很大困难。使用慢病毒为载体进行RNA干扰阻断foxp的功能并使之能在Treg细胞中长期表达是解决这一问题的较好的方法。Flag是一个由十几个氨基酸组成的蛋白标签由目的蛋白(targetprotein)和标签(tag)共同构成的蛋白嵌合体常标记于重组蛋白质的氨基端以帮助分析靶蛋白的生物学功能用于目的细胞暂时不易得到或目的细胞转染效率非常低基因靶点的筛选。本实验采用FLAG融合蛋白和foxp基因共同构建靶基因重组真核表达质粒瞬时转染进T工具细胞中筛选出具有RNAi效率的有效靶点为进一步敲除foxp基因功能的免疫治疗研究奠定基础。材料和方法动物与细胞周龄雌性CBL小鼠,由中山大学实验动物中心提供。试剂小鼠CDCDTreg细胞磁珠分离试剂盒、小鼠CDFITC单抗、小鼠CDPE单克隆抗体均购自MiltenyiBiotec公司。HRP标记的羊抗小鼠IgG及小鼠mAbIg亚类检测试剂盒均购自Sigma公司。RPMI培养基购自Gibco公司。小牛血清购自Gibco公司。羊抗小鼠foxpmAb购自eBioscience公司。foxp慢病毒载体由本试验室构建。Foxp引物由上海吉凯公司合成,FoxpHindFoxpKpn的引物序列为:Forward′CAGATCTCGAGCTCAAGCTTGGATGCCCAACCCTAGGCCAGC′:Reverse′GATCCCGGGCCCGCGGTACCTCACTTGTCGTCATCGTCTTTGTAGTCAGGGCAGGGATTGGAGCACTTG′。器材硝酸纤维素膜(NC膜)购自Amersham公司。SDSPAGE设备购自BIORAD公司。流式细胞仪为美国BECKMANCOUTER公司产品。CDCDTreg细胞的分离颈脱臼法处死小鼠,取脾脏,在目滤网上磨碎脾脏红细胞裂解液裂解红细胞按照小鼠CDCDTreg细胞磁珠分离试剂盒说明书进行操作先阴性选择获得CDT细胞加入FITC标记抗小鼠CD单克隆抗体,再加入磁珠标记抗FITC,阳性选择获得CDT细胞,阴性选择获得CDT细胞,通过流式细胞仪(BDFACSCalibur)分析获得的CDCDT细胞纯度。Foxp总RNA抽提和RTPCR测定foxpmRNA水平取×细胞,加入mLTrizol,提取总RNA,根据试剂盒说明书进行操作将总RNA反转录为cDNA。PCR总反应体系μL循环参数:min预变性ssmin共个循环最后以延伸min。表达mfoxp的T细胞制备回收mfoxpPCR产物后进行HindKpn酶切回收酶切片段后可以进入后续克隆构建入真核表达载体中。将pEGFP,C:HindKpn酶切回收Kb片段使用连接酶连接mfoxp酶切产物和pEGFP,C形成mfoxpRseqEGFPCF阳性克隆。PCR片段长度为bp。将阳性克隆送上海Invitrogen公司进行型测序仪进行测序分析引物序列如下:foxpHindCAGATCTCGAGCTCAAGCTTGGATGCCCAACCCTAGGCCAGCfoxpKpnGATCCCGGGCCCGCGGTACCTCACTTGTCGTCATCGTCTTTGTAGTCAGGGCAGGGATTGGAGCACTfoxpRseqAACCAGGCCACTTGCAGACEGFPCFCATGGTCCTGCTGGAGTTCGTG。用无血清培养基把T细胞悬液稀释到,个mL在mL的细胞悬液中加入mL的gL的台盼兰溶液。轻轻混匀数分钟后计数细胞。取培养,d生长旺盛的细胞用培养液将细胞配成×,×细胞mL。在孔培养板中每孔加入mL细胞悬液培养h后细胞融合度控制在,。将孔板的每个孔的培养液体积调整至mL,用×gmfoxpDNA质粒与(LDMEM混合。把稀释后的DNA与稀释后的Lipofectamine进行混合轻轻地颠倒混匀。混合后在室温下温育min以便形成质粒DNA与Lipofectamine稀释液的转染复合物。加入转染复合物培养细胞在转染满h后需更换新鲜的含血清的培养液。转染后h取一部分细胞用westernblot检测mfoxp的表达。另一部分细胞扩大培养进入靶点筛选流程。foxp有效靶点的筛选使用Oligotide软件设计foxp基因shRNA序列化学合成法合成四条shRNA序列分别为:#TAAGGTGCAGAGTAGAGCTGGCTTCAAGAGAGCCAGCTCTACTCTGCACCTTTTTTTTCTCGAGAAAAAAAAGGTGCAGAGTAGAGCTGGCTCTCTTGAAGCCAGCTCTACTCTGCACCTTA。#TGAGGACACTCAATGAAATCTATTCAAGAGATAGATTTCATTGAGTGTCCTCTTTTTTCTCGAGAAAAAAGAGGACACTCAATGAAATCTATCTCTTGAATAGATTTCATTGAGTGTCCTCA。#TGAGAGAAGTGGTGCAGTCTCTTTCAAGAGAAGAGACTGCACCACTTCTCTCTTTTTTCTCGAGAAAAAAGAGAGAAGTGGTGCAGTCTCTTCTCTTGAAAGAGACTGCACCACTTCTCTCA。#TCAGACCACACTTCATGCATCATTCAAGAGATGATGCATGAAGTGTGGTCTGTTTTTTCTCGAGAAAAAACAGACCACACTTCATGCATCATCTCTTGAATGATGCATGAAGTGTGGTCTGA。分别构建含有以上条foxpRNAishRNA的种慢病毒载体。使用慢病毒感染前d以,的融合度进行目的细胞的接种培养。感染当天加入适量的病毒。h后观察细胞状态如果没有明显的细胞毒性作用待到h以后更换为正常培养基。如果有明显的细胞毒性作用h以后马上更换为正常培养基。感染d后首先观察报告基因GFP的表达情况感染效率大于收集总蛋白进入后续WesternBlot的实验。结果CDCDTreg细胞的分离使用小鼠CDCDTreg细胞磁珠分离试剂盒从脾脏分离出了小鼠CDCDTreg细胞经流式细胞仪鉴定其纯度达到了。foxp总RNA抽提和RTPCR测定foxpmRNA水平我们从小鼠CDCDT细胞中提取出总RNA如图所示总RNA样品质量良好,无明显降解现象,可以进入RTPCR实验。之后应用RTPCR方法成功克隆出foxpcDNA片段长度为bp(图)。表达mfoxp的T细胞制备按照的实验步骤构建FoxpRseqEGFPCF阳性克隆然后使用lipofectamine转染进T细胞使T细胞能够表达FLAG融合蛋白(图)以用于RNA干扰有效靶点筛选。Foxp有效靶点的筛选将含有合成的条shRNA互补DNA双链的慢病毒颗粒分别转染工具细胞如图、中所示在干扰质粒:过表达质粒=时条shRNA互补双链都具有阻断效率但当干扰质粒:过表达质粒=、时只有#和#靶点具有阻断效率再次重复干扰质粒:过表达质粒=的实验仍然得到相同的结果从而筛选出了具有阻断效率的#和#靶点其阻断效率分别为,和,。讨论CDCDTreg在人和小鼠的免疫耐受和肿瘤免疫抑制方面都具有十分重要的作用它具有免疫抑制性和免疫无能性两大特点。而foxp是CDCDTreg细胞中最重要的免疫抑制性调节因子可能是Treg细胞启动免疫抑制功能的“开关”。在小鼠它的移码突变导致半合子的雄性小鼠发生X连锁的致死性淋巴增殖性疾病在出生后周内死亡。foxp基因位于X染色体,cDNA全长为bp编码的蛋白质(Scurfy)由个氨基酸组成其结构和功能均与人类类似但是它特异性表达于CDCDTreg细胞是其特异性的核转录因子被看作是Treg细胞的管家基因,。在人类foxp不仅可表达于CDCDTreg细胞,还可表达于CDCD等抑制型T细胞。它定位于Xp,Xq包含个外显子和个内含子,cDNA全长bp。本实验使用RTPCR方法从CDCDTreg中克隆出了foxp基因的cDNA片段长度为bp测序发现其序列与Genebank上的foxp()序列具有同源性证实了CDCDTreg中确实存在foxp基因表达。本实验也证实了CDCDTreg细胞约占外周CDT细胞的,从,×小鼠脾脏CDT细胞中仅能够分选出,×CDCDTreg细胞这与以前的研究结果相符合。本实验还发现分选出的CDCDTreg细胞在含有UmLIL的培养液(含FBS)中可以存活但是细胞不增殖增加IL达到UmL时细胞仍不增殖这种原因仍不清楚Shevach认为CDCDTreg细胞作为一种Treg细胞在体外不具有自我扩增增殖的能力只有在高剂量的IL和CD、CD持续共刺激的情况下才具有低水平扩增的能力。目前尚无一个可靠的、稳定的CDCDTreg细胞的体外扩增方法这为体外研究CDCDTreg的功能和其作用的分子机制带来很大困难。由于慢病毒载体可以转染非分裂细胞同时对CDT细胞具有高度的亲和力并能整合入细胞的基因组中长期持续的表达外源基因因此对于CDCDTreg细胞来说是比较理想的基因转染的载体。FLAG融合蛋白作为一种筛选靶点的工具具有不受细胞数量限制对于在体外难于转染的细胞的靶点筛选准确的优点【】。本研究利用PCR扩增出目的片段,设计引物时在上游与下游引物′端分别加入不同的酶切位点:Hind和Kpn。可确保片段酶切位点的正确性。本实验利用FLAG融合蛋白作为一种筛选靶点的工具筛选出了具有RNAi阻断效率的#、#靶点并构建了包含该片段的慢病毒载体该载体可以直接封闭foxp基因的表达为进行foxp基因功能的研究提供了重要的工具亦可以直接应用于阻断foxp基因的免疫治疗的研究本研究也为受细胞数量限制、难于转染的细胞的RNAi靶点的筛选奠定了方法学基础因此具有很高的实用价值。【参考文献】COFFERPJ,BURGERINGBMForkheadboxtranscriptionfactorsandtheirroleintheimmunesystemJNatRevImmunol,,():HORIS,NOMURAT,SAKAGUCHISControlofregulatoryTcelldevelopmentbythetranscriptionfactorFoxpJScience,,():MORGANME,VANBILSENJH,BAKKERAM,etalExpressionofFOXPmRNAisnotconfinedtoCDCDTregulatorycellsinhumansJHumImmunol,,():SUCIUFOCAN,MANAVALANJS,SCOTTOL,etalMolecularcharacterizationofallospecificTsuppressorandtolerogenicdendriticcells:reviewJIntImmunopharmacol,,():FONTENOTJD,GAVINMA,RUDENSKYAYFoxpprogramsthedevelopmentandfunctionofCDCDregulatoryTcellsJNatImmunol,,():KURACHIS,KOIZUMIN,SAKURAIF,etaladenovirusvectorscontainingheterologouspeptidesinthefiberknob,proteinIX,orhexon,,,GeneTher():BLUESTONEJA,ABBASAKNaturalversusadaptiveregulatoryTcellsJNatRevImmunol,,():SHEVACHEMCDCDsuppressorTcells:morequestionsthananswersJNatRevImmunol,,():CORDELIERP,STRAYERDSUsinggenedeliverytoprotectHIVsusceptibleCNScells:inhibitingHIVreplicationinmicroglia,,,VirusRes,,():黄云剑赵景宏杨唐俊等Smad和Smad基因腺相关病毒载体的构建及其表达,,,细胞与分子免疫学杂志,,():

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