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小鼠肝脏过氧化物酶制备与测定.doc

小鼠肝脏过氧化物酶制备与测定

你把我伤的深_
2019-02-27 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《小鼠肝脏过氧化物酶制备与测定doc》,可适用于医药卫生领域

小鼠肝脏过氧化物酶制备与测定摘要目的 分离纯化过氧化氢酶测定其相关性质。方法 采用匀浆、盐析、透析、层析等方法分离纯化过氧化氢酶采用Lorry法测定蛋白含量SDSPAGE法测定蛋白质相对分子质量双倒数法测定酶的米氏常数。结论 相对分子质量为kD以过氧化氢为底物时酶的Km值为molL酶层析后的比活为IUmg。关键词小鼠过氧化氢酶纯化米氏常数SDSPAGE前言 过氧化氢酶(HydrogenPeroxidase)又名触酶(CatalaseCAT),是一种广泛存在于生物组织的氧化还原酶。过氧化氢酶是一种四聚体血晶素酶,由四个相同四面体排列的亚基组成,每一个亚基相对分子质量约每一个分子都包含有四个高铁血红素基团,分子量在左右。在人体内以肝和肾脏所含过氧化氢酶活性最高,结缔组织活性最弱,其它组织如红细胞、脾、小肠、肌肉等均含有过氧化氢酶。过氧化氢酶在细胞内主要与线粒体及过氧化物酶体结合,在红细胞内呈溶解状态。过氧化氢酶是一种与D-氨基酸氧化酶等一系列需氧脱氢酶相偶联的酶,具有重要的生理功能。过氧化氢酶能将细胞代谢所产生的毒性物质迅速加以清除,从而起到和谷胱肽过氧化酶共同保护琉基酶、膜蛋白和解毒的作用。近年来,过氧化氢酶的活性测定被作为与肿瘤和抗衰老有关的酶学指标而受到关注。近年来过氧化氢酶活性的测定被作为与肿瘤和抗衰老有关蛋白质的分离纯化方法是生命科学领域关注的热点之一。实验器材实验动物昆明小鼠只雌雄不限由河北医科大学动物实验中心提供。主要仪器型紫外分光光度计(上海元析仪器有限公司)UV冷冻离心机(湖南相依实验仪器开发有限公司)BCD冰箱(青岛海尔公司)微量移液器W匀浆器(江苏国华仪器厂)电泳仪(北京六一)实验方法 过氧化氢酶的分离提取颈椎脱臼法处死小鼠(只)取肝脏加入mL预冷匀浆缓冲液(molL,pH醋酸缓冲液,%乙醇)用组织捣碎机匀浆min。缓慢滴加mL的氯仿(边加边搅拌)再次匀浆min匀浆液℃rpm离心min收获上清液。留样:取匀浆后上清液μL加入μL×电泳上样Buffer沸水浴分钟备用于SDSPAGE检测℃冰箱保存。另取μL匀浆后上清液℃冰箱保存备用。盐析与透析法初步纯化过氧化氢酶 冰浴搅拌状态下向肝匀浆上清液中缓慢滴加mlMNaSO溶液继续冰浴搅拌h将盐析溶液离心(℃rpmmin)后弃去上清保留沉淀用ml的磷酸缓冲液(molLpH)溶解沉淀(用手动玻璃匀浆器助溶)min离心(℃rpm,min)弃去沉淀保留上清液留样:取盐析后上清样品μL用μL×电泳上样Buffer制样煮min备用于SDSPAGE检测。℃冰箱保存。将透析袋(截留量KD直径公分)置于沸水中煮min清洗晾凉后备用将上清液放入透析袋内置于透析液(乙醇molLpH醋酸缓冲液molLNaCl溶液)中一周(中途更换一次透析液)一周后取出透析袋内混浊溶液离心(℃rpmmin)后收集沉淀用ml的磷酸缓冲液(molLpH)溶解沉淀min(用手动玻璃匀浆器助溶)离心(℃rpmmin)后收获上清液。取上清样品μL加μL×电泳上样Buffer沸煮min放置℃冰箱保存备用。将收获的样品液(三组样品合并为一组)放入处理后的透析袋中置于的甘油中包埋浓缩天待样品浓缩至mL收样放置℃冰箱保存。凝胶层析法进一步纯化纯化过氧化氢酶 实验室老师准备凝胶。实验时取层析柱一支将层析柱出口接上乳胶管在柱底部填入一薄层棉花。将层析柱垂直夹于铁架上夹紧层析柱下端的止水夹向柱中加入约cm高的缓冲液用细玻璃棒将凝胶颗粒搅成悬液顺玻璃棒缓缓倒入层析柱中。当凝胶颗粒沉积约cm高时开启止水夹子使缓冲液缓缓流出同时继续倒入凝胶悬液掌握倒入速度使其与缓冲液流出速度大体相同直至凝胶床高度达cm(柱床体积约mL)时为止关闭止水夹子。凝胶床表面要保留cm高的缓冲液最后放入略小于层析柱内径的滤纸片打开层析柱出口控制流速为mLmin(滴min)用磷酸盐缓冲液(molLpH)流洗平衡min浓缩样品加样:打开层析柱出口使缓冲液缓缓流出当液面与凝胶床表面平齐时关上出口。用吸管吸取待分离的浓缩后样品溶液μL在接近凝胶床表面处沿层析柱内壁缓缓加入。打开层析柱出口使样品溶液进入柱床(开始收集)。待样品液恰好完全进入凝胶柱上端面内时立即用滴管沿层析柱内壁加入少量磷酸盐缓冲液(molLpH)小心冲洗壁管上的蛋白质然后再加入磷酸盐缓冲液至距凝胶床表面约cm高。不断补加磷酸盐缓冲液(molLpH)洗脱保持mLmin(约滴min)的流速当样品进胶开始用试管收集流出液每管收集mL(约滴)。收集管依次在nm和nm波长下以磷酸盐缓冲液(molLpH)调零测定各管吸光度值。以管号为横坐标吸光度为纵坐标绘制洗脱曲线合并收集ODnm和ODnm重叠峰值管再次测定即为最终纯化得到的产物留样取mL纯化产物存样备用于蛋白浓度及Km值测定再取纯化样品μL用μL×电泳上样Buffer制样沸煮min备用SDSPAGE检测,样品放入放置℃冰箱保存。Lorry法测定纯化蛋白含量 取标准蛋白按表示绘制标准曲线匀浆样品稀释倍倍层析样品稀释倍倍按照表示进行操作,测定在nm下吸光度值在标准曲线下得出蛋白含量。以HO为底物,用过氧化氢酶催化其分解min,加入硫酸终止催化反应,并用已知浓度高锰酸钾滴定剩余的HO,换算出减少的HO的量,进而计算出酶的活力。在Km值测定中采用此法测定酶活力。过氧化氢酶活力单位定义为:以每分钟催化μmolHO减少所需的过氧化氢酶的量作为一个酶活性单位(U)。样品的比活以每毫克样品蛋白所含的酶活性单位数表示。表不同浓度标准蛋白组配置 标准蛋白溶液(mgmL)生理盐水(mL)试剂AB(:)混合液(mL)混匀后置于℃水浴min冷却试剂c(mL)立即混匀置于℃水箱保温min冷却后测定nm吸光度值       表待测样品试剂配制 (匀浆稀释倍)(匀浆稀释倍)(层析稀释倍)(层析稀释倍)稀释的待测样品(mL)μLμLμLμL试剂AB(:)混合液(mL)混合后℃水浴保温分钟冷却试剂C(mL)立即混匀置于℃水箱保温min冷却后测定nm吸光度值查标准曲线以gL为单位     双倒数作图法测定纯化过氧化氢酶米氏常数取未知浓度的HO溶液mL和HSO mL,用molLKMnO滴定至微红记录滴定毫升数重复实验取平均值计算HO浓度将层析样品稀释倍匀浆样品稀释倍(置于号瓶中)取只干燥的mL锥形瓶编号按表示进行操作反应min立即加入HSO mL终止反应用标准molLKMnO进行滴定记录消耗KMnO的体积。表过氧化氢酶的稀释瓶号HOmL蒸馏水mL酶液mL       SDSPAGE法测定纯化的过氧化物酶分子量 实验室老师安装夹心式垂直板电泳槽和配胶及凝胶板的制备加样预电泳采用mAmin。待样品进入分离胶后改为mA当染料前沿距硅橡胶框底边cm时停止电泳关闭电源取下凝胶模卸下硅橡胶框用不锈钢药铲或镊子撬开短玻璃板在凝胶板切下一角作为加样标志在两侧溴酚蓝染料区带中心插入细铜丝作为前沿标记将凝胶板放在大培养皿内加入固定液固定过夜考马斯亮蓝染色h用蒸馏水漂洗数次再用脱色液脱色直到蛋白质区带清晰将大培养皿放在一张坐标纸上量出加样端距蓝色条带间的距离(cm)以及各蛋白质样品区带中心与加样端的距离(cm)计算相对迁移率绘制标准曲线。表分子量标准蛋白Marker分子量分子量log值磷酸化酶b牛血清白蛋白卵清蛋白碳酸酐酶溶菌酶    实验结果分离纯化的结果实验采用sephadexG葡萄糖凝胶层析柱可以实现过氧化氢酶与其他分子量杂蛋白的分离通过检测洗脱液在nm(过氧化氢酶特异吸波长)和nm波长下的吸光度值变化合并收集ODnm和ODnm重叠峰值管只可获得纯化的过氧化氢酶。如表和图所示可知纯化的过氧化氢酶在号和号管中。      表层析后蛋白吸光度变化曲线管号nmnm管号nmnm         

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