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抗哈维氏弧菌单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立及其特性鉴定

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抗哈维氏弧菌单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立及其特性鉴定抗哈维氏弧菌单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立及其特性鉴定 抗哈维氏弧菌单克隆抗体杂交瘤细胞系的 建立及其特性鉴定 838 ? 论着? ISSN1007—8738细胞与分子免疫学杂志(— Chin— JCellMolImmuno1)2007,23(9 文章编号:1007—8738(2007)09-0838—03 抗哈维氏弧菌单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立及其特性鉴定 郝贵杰,沈锦玉,曹铮,潘晓义(浙江省淡水水产研究所,浙江湖州313001) Preparationandcharacterization...

抗哈维氏弧菌单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立及其特性鉴定
抗哈维氏弧菌单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立及其特性鉴定 抗哈维氏弧菌单克隆抗体杂交瘤细胞系的 建立及其特性鉴定 838 ? 论着? ISSN1007—8738细胞与分子免疫学杂志(— Chin— JCellMolImmuno1)2007,23(9 文章编号:1007—8738(2007)09-0838—03 抗哈维氏弧菌单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立及其特性鉴定 郝贵杰,沈锦玉,曹铮,潘晓义(浙江省淡水水产研究所,浙江湖州313001) Preparationandcharacterizationofthe mAbagainstVibrioharveyi HAOGui-jie,SHENJin—yu,CAOZheng,PANXiao—y/ InstituteofFreshwaterFisheriesofZhejiang,Huzhou313001, China [Abstract]AIM:TopreparethemAbagainstVibrio harveyiandanalysetheirbiologicalproperties.METHODS: 8-week--oldfemaleBALB/cmicewereimmunizedwithpath-- ogenicharveyiGYC1108—1.whichwasisolatedfr0mthe diseasedgreatyellowcroakerinZhejiangChinain2003. Spleencellscollectedfrclmtheimmunizedmiceafterthefifth immunizationwerefusedwithSp2/0一Ag一14myelomacells. ELISAwasusedtoscreenhybridomacellsandidentifythe specificityandsensitivityofmAbs.RESULTS:Limiteddilu— tionmethodwasusedtosubclonethepositiveclones.After threecyclesofsubcloning,5mAbsagainstGYC1108—1were obtainedandwereprovedtohavehightiterofELISA.The testofspecificitysuggestedthat1B7reactedonharveyi. alginolyticusandparahaemolyticusbutdidnotreacton mimicus,anguillarum,Aeromonashydrophilaandthe otherisolatesamongthe14bacteriumspeciestested.1B7 wasusedtodetectV.harveyiattheconcentrationof10 CFU/mLbyindirectELISA.CONCLUSION:Theobtained mAbscouldbeusedtodiagnosisandpreventofharveyi inaquaculturerapidly. [Keywords]Vibrioharveyi;indirectELISA;monoclonal antibody [摘要]目的:研制抗哈维氏弧菌特异性单克隆抗体(mAb) 并进行免疫学特性分析.方法:以哈维氏弧菌GYC1108—1颗 粒性抗原免疫8周龄雌性BALB/c小鼠,5次免疫后取其脾细 胞与Sp2/0一Ag一14骨髓瘤细胞融合.用间接酶联免疫吸附试 验(ELISA)对杂交瘤进行筛选,并鉴定mAb特异性及敏感 性.结果:各株阳性克隆经3次亚克隆后,共获得5株抗 GYC1108—1的mAb,其中1B7的细胞上清及腹水效价分别为 1:3200和1:32000,交叉反应结果 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明1B7除了与测试的多 收稿日期:2006—12—12:接受日期:2007—0l—l9 基金项目:浙江省科技厅重点项目资助(20o5Fl20o5) 作者简介:郝贵杰(1979一),女,安徽六安人,研究实习员,硕士 Tel:0572—2O4l403:E—mail:melissa511@sina.COrn 株哈维氏弧菌发生反应外,还与溶藻弧菌,麦氏弧菌和副溶 血弧菌发生免疫交叉反应,但不与拟态弧菌,鳗弧菌,嗜水气 单胞菌等发生交叉反应.ELISA检测1B7腹水对GYCll08—1 的敏感性达10/L.结论:制备的抗哈维氏弧菌mAb可为哈 维氏弧菌的检测及防治等提供有用的试剂. [关键词]哈维氏弧菌;问接ELISA;单克隆抗体 [中图分类号]Q813.2[文献标识码]A 弧菌(Vibrio)是海洋环境中常见的细菌类群之 一 ,其中某些种类会使水产动物致病,给渔业生产造 成损失,其致病性受宿主的生存状态及水质环境条 件等综合因素的影响较大,属条件致病菌.其中哈 维氏弧菌(Vibrion)是引起水产动物发病的一种 重要病原,能引起鱼,虾等多类海水养殖动物发 病?',造成很大的危害.目前在印度,泰国,印度 尼西亚,菲律宾,澳大利亚中国大陆及台湾地区等都 有报道发病'.目前,尚缺乏对此种菌的快速检测 及预防 措施 《全国民用建筑工程设计技术措施》规划•建筑•景观全国民用建筑工程设计技术措施》规划•建筑•景观软件质量保证措施下载工地伤害及预防措施下载关于贯彻落实的具体措施 ,我们采用杂交瘤技术,选取1株分离自 患病大黄鱼(浙江台州深水网箱养殖大黄鱼)的病原 菌哈维氏弧菌GYC1108—1作为抗原,首次制备了抗 哈维氏弧菌的单克隆抗体(mAb),为该菌的快速诊 断及预防免疫机制提供实验基础. 1材料和方法 1.1材料哈维氏弧菌 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 株1.1593(购自中科院微生物所 菌种保藏中心),哈维氏弧菌GYC1108—1(本实验所用免疫 菌),哈维氏弧菌BK一1,NS,哈维氏弧菌NB株(BK一1为患病 黑鲷的病原菌,NS为南美白对虾发光病病原菌,NB株由宁 波大学赠送),副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)a株,b株 分别由宁波大学,上海水产大学赠送,溶藻弧菌NB株(Vibrio alginulyticus)由宁波大学赠送,鳗弧菌E3—1(Vibrioanguilla— rum),拟态弧菌CL98116(V/br/omimicus),麦氏弧菌GYC910 (V/br/ometschnikovi),鱼类"暴发病"病原菌BSK一10(嗜水气 单胞菌)和青虾致病菌QXL一1(嗜水气单胞菌)为本实验室分 离,草鱼肠炎致病菌58—20-9购自中科院水生所. 1.2方法 1.2.1颗粒性抗原的制备将哈维氏弧菌GYC1108—1接种于 含15LNaCI的TSA培养基中,30%培养24h,加人5L甲 醛,4?静置过夜灭活细菌.离心弃上清,沉淀用灭菌生理盐 1SSN1007—8738细胞与分子免疫学杂志(Chin—JCellMollmmu—no1)2007,23(9 水(8.5s/LNaC1)洗涤3次,重悬于灭菌生理盐水中,测定 A值,根据公式计算浓度,保存一20?中备用. 1.2.2动物免疫取约10cellfL的哈维氏弧菌GYC1108—1 颗粒性抗原,与弗氏完全佐剂按1:1的比例混合乳化,腹腔 注射免疫8周龄雌性BALB/e小鼠,0.1mL/次.初次免疫后 2周,抗原与弗氏不完全佐剂混合乳化,同法免疫.以后免疫 不再加佐剂,分别在4周,6周后各加强免疫1次,融合前 3d腹腔及尾静脉途径再加强免疫1次. 1.2.3细胞融合细胞融合按常规方法J,取免疫小鼠的 脾细胞与Sp2/0混合于融合管内,1000r/min离心10min, 弃去上清,轻振融合管底,使沉淀细胞松散均匀,置37?水 浴中预热.然后在45S内缓慢滴加预热的PEG4000溶液 1mL,边加边轻转搅拌,然后在90S内缓慢加入不完全DMEM 培养基,终止融合.静置10min后,1000r/min离心10min, 弃上清,加入HAT培养基,使细胞悬浮并混匀.加入适量饲 养细胞分装至96孔细胞培养板,放于60mL/LCO,培养箱内 培养.第4,5天各孔补加1滴HAT培养基,第9,10天用 HT培养基换出全部HAT培养基,并可开始检测筛选. 1.2.4阳性杂交瘤细胞株的筛选融合后待杂交瘤细胞长 满孔底1/3,1/2时换液,3-4d后即可取细胞培养上清进行 检测.用哈维氏弧菌全菌(用免疫小鼠阳性血清做方阵试验 决定抗原包被浓度为10"eell/mL)包被ELISA板,加细胞培 养上清反应后,洗涤,加酶标羊抗鼠IgG,洗涤,加OPD.H,0 显色,检测A值,P/N>2.1者为阳性j. 1.2.5阳性杂交瘤细胞系的建立与腹水制备将阳性孔中 的细胞扩大培养并及时冻存,同时按有限稀释法进行亚克隆, 至阳性率为100%时,即可定株.然后,按Golding等的方 法进行腹水的制备. 1.2.6mAb的生物学特性mAb的细胞培养上清和腹水 ELISA效价测定按常规方法进行,用Sigma公司的mAb亚类 鉴定试剂盒进行亚类鉴定. 1.2.7相加实验用相加实验确定筛选出来的mAb是否识 别同一个抗原决定簇.取上述包被好的抗原酶标孔,每2株 阳性单克隆孔的细胞培养上清为一抗,进行问接ELISA反 应.用酶标仪测定它们反应显色后的490nm波长的A值,按 下列公式计算它们的相加系数:AI:[2A.+/(a.+A)一1]× 100%,其中A.+:为相加孔的吸光值,A.,A为非相加孔的吸 光值.A,接近100%,则两个mAb识别不同的抗原决定簇, A,接近0,则两个mAb识别同样的抗原决定簇]. 1.2.8交叉反应挑选14株不同的菌株扩增,并用甲醛灭 活菌体作为包被抗原,用间接ELISA的方法,检测所得mAb 与它们的交叉反应性. 1.2.9mAbELISA敏感性试验将哈维氏弧菌GYC1108一l 菌液稀释成不同浓度后包被EHSA板,在相同的条件下分别 做间接ELISA实验,确定1B7最小检出菌量,即测定mAb lB7的敏感性. 839 2结果 2.1mAb筛选及杂交瘤细胞系的建立采用上述免疫和融 合方法,用间接ELISA试验检测细胞培养上清,共获得了5 株抗GYC1108.1mAb的细胞株,分别命名为1B7,1D7,2G8, 3G6和3H7,杂交瘤细胞经3次亚克隆,100%的检测孔保持 了分泌抗哈维氏弧菌的能力,经连续传代培养后,依然能够 稳定分泌抗体. 2.2mAb的生物学特性5株mAb的细胞培养上清ELISA 效价及1B7mAb腹水的ELISA效价结果见表1. 表15株mAb的生物学特性 Tab1Biologicalpropertiesofthefivemonoclonalantibodies 2.3相加实验结果与腹水制备相加实验测得mAb细胞株 1B7和2G8培养上清的相加系数接近于0,1D7和3G6培养 上清的相加系数接近于0,表明它们分别识别同一个抗原决 定簇.选择其他株未制备腹水如表1,取其腹水进行实验. 2.4mAb的特异性鉴定交叉反应结果表明1B7能与多株 弧菌科细菌发生交叉反应(表2).1B7除了与各株哈维氏弧 菌发生反应外,还与副溶血弧菌a,b株,溶藻弧菌NB和麦 氏弧菌GYC910发生交叉反应,但不与鳗弧菌E3.1,拟态弧 菌CL98116,嗜水气单胞菌BSK-10及QXL-1和草鱼肠炎致病 菌58—20—9发生交叉反应. 表2mAb1B7与一些菌株的免疫交叉反应 Tab2CrossreactivityofmAblB7withsomebacteriastrains BacteriumspeciesCrossreactivity harvey/1.1593 harvey/GYC1108—1 harvey/BK.1 harvey/NS harvey/NB parahaemolyticusa parahaemol~icusb algintdyticusNB anguillarumE3—1 mimieusCL98ll6 metsch~ikovGYC9l0 AeromonashydrophilaBSK一10 AeromonashydrophilaQXL一1 Enter/t/sbacter/a58—20—9 2.5mAbELISA敏感性试验用不同浓度的菌体颗粒性抗 原包被ELISA板,间接ELISA法测定哈维氏弧菌mAb1B7的 敏感性,结果表明该mAb腹水问接ELISA方法的检测灵敏度 为10个菌细胞1L. ISSNIO07—8738细胞与分子免疫学杂志(ChinJCellMol!!垫( 3讨论 ELISA不但能对病原菌进行定性的研究,而且 还能够定量,并且可重复性强,易制成检测特定种类 病原菌的商品性试剂盒,更适合于野外操作及大量 样品的检测,在病原性弧菌检测中有着突出的优点. 目前国内外在病原性海洋弧菌的检测中已广泛应用 此种方法'mJ.哈维氏弧菌是海洋鱼类常见的病原 菌,其感染鱼类往往表现比较明显的症状,如皮肤溃 疡,鳍条腐烂,尾巴溃烂;剖检可见肠道有黄白色分 泌物,肝肾肿大变色,腹腔积液等?J.此菌引起 的大范围发病给养殖业带来巨大的经济损失.抗哈 维氏弧菌mAb及多克隆抗体的制备虽然在国外已有 记载?,但国内尚未见报道.我们用甲醛灭活的哈 维氏弧菌菌体免疫BALB/c小鼠,利用细胞融合技术 和细胞克隆技术,经筛选,克隆化得到5株能稳定分 泌mAb的细胞系. 相加实验结果表明,5株mAb分别识别3个不 同的抗原决定簇.其中选择细胞培养上清效价高的 1B7制备小鼠mAb腹水,效价达1:32000.用1B7 腹水做交叉反应实验,结果表明哈维氏弧菌与溶藻 弧菌,麦氏弧菌和副溶血弧菌的表面抗原拥有相似 的抗原决定基,而与鳗弧菌,拟态弧菌,嗜水气单胞 菌等菌株抗原差异较大.为了更进一步弄清不同弧 菌间的相似性,针对另两个抗原决定簇的细胞株还 需制备腹水并与各株弧菌做交叉反应,相关实验还 在进行. 1B7腹水用吸附法除去与其有交叉反应的因子, 进而测定对哈维氏弧菌的敏感性实验,结果表明间 接ELISA所能检测到的最小菌液的密度为l0/L. 而且有很好的重复性和稳定性,表明其具有高 度的敏感性.本检测方法简单,灵敏度高,特异性 强,并且检测时间短,有很强的实际应用前景,为开 (上接837页) [2]RiggKM,ShentonBK,BmtherickI,eta1.Alterationsincirculating lynphoeytenumberandfunctionaftercirculationthmughcolorectal carcinomas[J].Surgery,1997,109(6):747—753. 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