碳酸钙固定化猪胰脂肪酶的制备及活性研究

碳酸钙固定化猪胰脂肪酶的制备及活性研究 碳酸钙固定化猪胰脂肪酶的制备及活性研 究 第23卷第1I期 2011年11月 化学研究与应用 ChemicalResearchandApplication Vo1.23,No.11 NOV.2011 文章编号:1004—1656(2011)111550434 碳酸钙固定化猪胰脂肪酶的制备及活性研究 黄岩,党海春,汪秀丽 (四川大学化学学院,环境友好高分子材料教育部工程研究中心,四川成都610064) 摘要:本文刷用市售普通碳酸钙(generalcalciumcarbonate,GCC)作为猪胰脂肪酶(PPL)固定化的载体材料, 研究了不同溺定化条件对所制备的固定化酶活性的影响.结果显示PPL固定化于GCC上的最佳制备工岂 为:将2OmL酶液与1.50gGCC放入置于摇床内的三角瓶中,摇床温度没为4O?,摇床转速设为180rpm,固 定化时间为2h.所得固定化酶的最大活性可达到141Us. 关键词:碳酸钙;猪胰脂肪酶;固定化 中图分类号:0614.231文献标识码:A Preparationandenzymaticactivityofimmobilized PPLoncalciumcarbonate HUANGYah,DANGHai—chun,WANGXiu一1i (CollegeofChemistry,EngineeringResearchCenterforEco—FriendlyPolymericMaterialsofMinistry ofEducation,SichuanUniversity,Chengdu610064,China) Abstract:ThepurchasedCaCO3wasusedasthesupportsfnrtheimmobilizationofporcinepancreaticlipase(PPI),andtheinflu— encesofvariousexperimentalparameters,suchasthemassratioofPPLandCaCO3,incubationtemperature,,incubationtimeandthe rotatingspeedofshakerontheactivityofPPLwereinvestigatedindetailed.TheoptimalimmobilizationconditionsforPPLcou]dbe describedasfollOWS:1.50gCaCO3wasmatchedwith20mIPP|sohnion,theincubationtemperaturewas4()(?,therotatingspeed ofshakerwas180rpm,theincubationtimewasfixedat2h.Afterthisprocession,theactivityofpreparedimmobilizedPl'Icanbe achieveditsmaximumvallleof】41l7s. Keywords:calciumcarbonate;porcinepancreaticlipase(PPL);immobilization 碳酸钙是一种在自然界中广泛存在的生物矿 物,作为一种重要的无机化工产品,其使用历史已 超过160年.近年来,随着尺寸可控碳酸钙晶体 被不断地成功合成,其潜在的应用领域也相应地 扩展到传感器基质j,药物载体J,固定化酶载 体等方面.酶的固定化是通过物理或化学的方 法,利用固定化材料将酶蛋白限制或束缚于一定 的区域内,而所固定的酶蛋白仍然能够进行其特 有的催化反应,并可回收重复利用的一类技术. 与游离酶相比,固定化酶不仅保持了酶的催化活 性,而且对热,pH,贮存等的稳定性均能够得到提 高,且酶的活力下降较少,操作稳定性高,同时产 品中不会带人生物催化剂中的酶蛋白或细胞,从 而简化了后处理过程,同时降低了生产的成本. 长期以来碳酸钙一直都是复合材料制造领域中用 量最大的填充剂和补强剂之一,遗憾的是在固定 收稿日期:201I-05—27修回151期:2011-09—12 基金项目:国家自然科学基金(20974066)资助 通讯联系人:汪秀丽(1972.),女,教授,主要从事高分子降解材料的研 究.Email:wangxiuli@$Ct1.edu.CI} 第ll期黄岩等:碳酸钙固定化猪胰脂肪酶的制备及活性研究1551 化酶领域碳酸钙却没有得到足够的重视,在有限 的应用实例中,碳酸钙作为固定化酶载体均取 得了较好效果. Rous等利用吸附法将假单胞菌脂肪酶分别 固定化于CaCO3,CaSO4?2H2O,Ca2P2O7和硅藻 土中,将所制备的固定化酶用于催化橄榄油的甘 油解反应中,通过筛选比较后得出CaCO,为最佳 载体,且此种载体所制备的固定化酶具有较高的 操作稳定性,在第五次使用后仍然能够保有初始 活性的90%左右.Ghamgui等同样利用物理吸 附法将米根酶脂肪酶固定化于碳酸钙粉末上,与 游离酶比较后发现,虽然两者的最适宜反应温度 均为37?,但固定化酶在热稳定性及贮存稳定性 上相较于游离酶均得到了较大的改善.同时通过 SEM观察碳酸钙和硅藻土545在固定化前后的形 貌,发现碳酸钙具有较大的接触面积以利于其与 酶的多点接触从而获得更高的负载效率. 本文中拟将市售颗粒尺寸为微米级的白色粉 末状普通碳酸钙(generMcMciumcarbonate,GCC) 作为PPL固定化的载体,利用溶剂沉淀法制备固 定化PPL,研究不同固定化条件对所制备的固定 化酶活性的影响.通过本文的研究将为该固定酶 在催化领域的具体应用奠定基础. 1实验部分 1.1仪器与试剂 KH-500B型超声波清洗器(昆山禾创超声仪 器有限公司),TDL-5型台式低速离心机(湖南星 科科学仪器有限公司),D-971型铝城牌无极调速 搅拌器(郑州长城科工贸有限公司),ZHWY.103B 型恒温培养振荡器(上海智城分析仪器制造有限 公司),FD一1C-50型冷冻干燥机(北京博医康实验 仪器有限公司). Na2HPO.?12HO(成都科龙化工试剂厂, AR),KH:PO(天津市致远化学试剂有限公司, AR),猪胰脂肪酶(Sigma,产品号:L,3126—100G), CaCO(成都科龙化工试剂厂,AR),聚乙烯醇(天 津市科密欧化学试剂开发中心,AR),橄榄油(成 都市科龙化工试剂厂),NaOH(天津市瑞金特化学 品有限公司,AR). 1.2实验方法 1.2.1酶液的制备称取1.00gPPL低温下溶于 0.067m0】/L,pH6.81的磷酸盐缓冲溶液(PBS) 中,超声半小时,而后离心,收集上清液即为制备 的PPL酶液. 1.2.2固定化酶的制备固定化酶的制备是利 用冷丙酮沉淀法,将PPI沉淀附着于GCC上.量 取一定体积的PPL酶液,将其与GCC按一定比例 混合于三角瓶中,将三角瓶放入摇床中在一定温 度,一定转速下固定化一定时间后加入20ml冷丙 酮溶液(冰箱中冷冻储存超过24h),而后利用水 泵抽滤,再量取2Oml冷丙酮溶液对制得的固定化 酶粗产品进行洗涤,最后冷冻干燥机中冻干8h后 所得白色粉末即为制备的固定化酶. 1.2.3固定化酶活性的表征固定化酶活性的 测定是利用橄榄油乳化法来进行测定.分别用移 液管量取5.00mLPBS和5.00mL橄榄油乳化液 混合于两个三角瓶中,将它们置于40cI=恒温水槽 中恒温5rain,而后向其中加入1.00g固定化酶混 匀,反应15rain后,加入15.00mL,95%的乙醇溶 液作为终止剂,而后再加入酚酞指示剂3滴,利用 0.05mol/LNaOH溶液滴定至粉红色为止,同时记 录下NaOH溶液的消耗量的均值计为V.按上述 相同 流程 快递问题件怎么处理流程河南自建厂房流程下载关于规范招聘需求审批流程制作流程表下载邮件下载流程设计 ,在另外两个三角瓶中不加入固定化酶, 以此作为空白样,同样 记录 混凝土 养护记录下载土方回填监理旁站记录免费下载集备记录下载集备记录下载集备记录下载 下NaOH溶液的消耗 量的均值计为V..本文中规定,固定化酶活性单 位Us定义为:1.00g固定化酶在40?的恒温水浴 中作用于聚乙烯醇橄榄油乳化液15min,最后消 耗0.05moVLNaOH溶液1.00mL,这一活性的大 小作为100个活性单位即100Us.因而固定化酶 活性大小A的计算公式为: : (二2 ,n 其中:A(Us)表示固定化酶的活性;V(mL)表 示测试样消耗氢氧化钠溶液的体积;V.(mL)表示 空白样消耗氢氧化钠溶液的体积;m(g)表示固定 化酶的质量. 2结果与讨论 2.1碳酸钙用量对固定化酶活性的影响 固定化酶制备过程中将表1所示各质量的 GCC与20mL酶液的混合物加入置于摇床中的三 角瓶内,摇床温度设为40?,转速180rpm,固定化 时间为2h.利用冷丙酮沉淀法得到固定化酶,而 后利用橄榄油乳化法对制备的固定酶活性进行测 定,具体结果列在表1中. 1552化学研究与应用第23卷 表1碳酸钙的用量对固定化酶活性的影响 TablelEffectsofthemassofGCCOnthe activityofimmobilizedPPL MassVoTest1Test2V1Activityof (g)(mL)(mI)(mL)(m1)enzyme(Us) 由表1可以看出,随着GCC质量逐渐变大,单 位质量固定化酶活性先增大而后减小,可见载体 碳酸钙对PPL的吸附量是先增大的,但碳酸钙的 吸附能力是一定的,随着载体质量的增加,而酶液 的体积一定,单位质量的固定化酶的活性反而会 降低,因此在上述条件下20mL酶液中加入1.50g 碳酸钙载体为最适宜添加量. 22负载温度对固定化酶活性的影响 将1.50g碳酸钙载体和20mL酶液加入摇床 内的三角瓶里,摇床温度分别按表2所列温度设 定,转速设为180rpm,固定化时间为2h,利用冷丙 酮沉淀法得到固定化酶,橄榄油乳化法得到各固 定化酶活性大小,具体结果见表2. 由表2的测试数据可以看到,在温度较低时, 固定化酶活性随着温度的升高而增大,这是因为 温度的升高会加快载体和酶分子的运动速度,进 而影响载体对PPL的吸附量,但是当温度超过 40~C后,由于PPI中蛋白质对于温度的敏感性,而 使其部分失活,因此固定化酶活性开始降低,上述 条件下固定化酶的最佳固定化温度为40?. 表2负载温度对固定化酶活性的影响 Table2EffectsofabsorptiontemperatureOnthe activityofimmobilizedPPL 2.3负载时间对固定化酶活性的影响 将1.50g碳酸钙载体和20mL酶液放人摇床 内的三角瓶里,摇床温度设为40?,转速设为180 rpm,固定化时间分别按下表所列时间进行固定化 操作,利用橄榄油乳化法对冷丙酮沉淀法得到的 各固定化酶的活性进行测定,具体结果见表3. 由表3的测试结果可以看出负载时间对固定 化酶活性的影响是先增大而后趋于平稳,由于碳 酸钙与PPL之间的固定化过程是一个吸附和解吸 附的过程,当固定化一定时间后,他们之间达到吸 附平衡,即使固定化时间延长也不能增加碳酸钙 对于PPL的吸附量,因此固定化酶的活性不再增 加.根据上述测试结果,可以看出固定化的最佳 吸附时间为2h. 表3负载时问对固定化酶活性的影响 Table3Effectsofabsorptiontimeontheactivity ofimmobilizedPPL tVoTest1Test2V1Activityof (h)(mL)(mL)(mL)(mL)enzyme(Us) 2.4摇床转速对固定化酶活性的影响 表4摇床转速对固定化酶活性的影响 Table4Effectofshakerspeedonactivity ofimmobilizedlipase Ss,V0Test1Test2V1Activityof (rpm)(mL)(mI一)(mI)(mL)enzyme(Us) 将1.50g碳酸钙载体和2OmI酶液放入摇床 内的三角瓶里,摇床温度设为40?,摇床转速按下 表所列分别进行固定化操作,固定化时间为2h, 利用冷丙酮将PPI沉淀附着于载体上,最后橄榄 油乳化法测出各固定化酶的活性,测试结果列于 表4中. 从表中可以看出,随着转速的提高,固定化酶 的活性逐步提高,摇床转速提高可以使得载体与 酶之间的混合更充分,利于提高它们之间的接触 面积,增加碳酸钙对于PPL的吸附量,从而使得固 定化酶的活性增大.但是当摇床转速超过180 第11期黄岩等:碳酸钙固定化猪胰脂肪酶的制备及活性研究1553 rpm后,固定化酶的活性不再升高反而下降,更高 的转速可能使得本来结合力就不是很强的固定化 于碳酸钙上的PPL脱落,从而导致固定化酶活性 的降低,可见此种条件下摇床的最佳转速为180 rpmO 3结论 根据上面的测试结果可以看到PPL固定化于 参考文献: [1]Shah,D.;Zhu,M.J.;Xue,H.,Developmentofanapero- metricbiosensorforslucosebasedonanovelattractiveen— zymeimmobilizationmatrix:Calciumcarbonatenanoparti- cles[J],BiosensBioelectron.2007,22(8):1612?1617. 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