【精品论文】比格犬注射重组腺病毒AdHGF后血清中抗腺病毒抗体及中和抗体的检测

【精品 论文 政研论文下载论文大学下载论文大学下载关于长拳的论文浙大论文封面下载 】比格犬注射重组腺病毒AdHGF后血清中抗腺病毒抗体及中和抗体的检测 比格犬注射重组腺病毒AdHGF后血清中抗腺病 毒抗体及中和抗体的检测 ====================================================================== 作者:哈小琴,赵治华,吕同德,劳妙芬,吴丹莉,吴祖泽 目的: 观察Beagle犬重复给予后血清中抗腺病毒抗体及【摘要】 抗肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)抗体的出现时间及消失规律. 方法: 将24只比格犬随机分为四组:正常对照组、手术对照组、 小剂量组(2.4×107 pfu/ kg)和大剂量组(2.4×108 pfu/ 各组犬给予不同剂量共14次. 在给药2次后分别利用病毒中和反应和ELISA 方法检测血清中抗腺病毒抗体和抗HGF抗体. 结果: 手术组、正常对照组及实验组动物于给药前及给药3次时血清细胞均未出现明显中和反应. 给药4次后各剂量组动物血清均对腺病毒有不同程度中和作用，至停药后12 wk抗体水平很低或已不存在. 各时间点血清样品中未检测到抗HGF抗体. 结论: 犬肌注次后动物血清中检测到了抗腺病毒抗体，停药4 wk后抗体水平有不同程度下降，直至12 wk后血清中腺病毒抗体基本消失. 【关键词】 ;抗腺病毒抗体;中和抗体;血清 0引言 基因治疗可能成为一些重大疾病如恶性肿瘤、心血管疾病、神经系统疾病、传染病包括艾滋病等的有效治疗手段,1,. 而基因治疗用于临床所面临的最大问题就是如何将治疗基因有效地转移至靶组织，其中载体的选择十分重要. 腺病毒载体是基因治疗中广为应用的一种载体，目前已成功地应用于多项基因治疗的临床试验中,2,. 我们对重组腺病毒长期毒性试验中比格犬血清中抗腺病毒抗体进行检测分析，将对的实际应用具有指导意义. 1材料和方法 1.1材料Beagle犬24只， 5~7 mo龄，体质量6~7.5 kg，雌雄各半(军事医学科学院动物实验中心)携带人肝细胞生长因子基因的重组腺病毒)，携带绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒)和293细胞(以腺病毒E1基因转化的人胚肾细胞系)均由军事医学科学院二所三室提供. 鼠抗人HGF mAb(R&D)，辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories,Inc ),重组人HGF蛋白纯品(R&D), DMEM(Gibco), 小牛血清(天津血研所), 猴抗血清(军事医学科学院五所昭衍新药研究中心)，洁净工作台(北京半导体设备一厂)，CO2培养箱(Sanyo), IX70倒置荧光显微镜(Olympus)自动照相系统(Olympus). 1.2方法 1.2.1动物分组设正常对照组、手术对照组、小剂量组(2.4×107 pfu/ kg, 拟临床用量3.4倍)和大剂量组(2.4×108 pfu/ kg, 拟临床用量34倍)，每组6只. 1.2.2给药途径采用心肌注射和臀部肌肉注射相结合,首次心肌注射，其余13次为肌肉注射给药. 给药期限为7 wk, 2次/wk，给药次数合计14次. 给药2次后利用病毒中和反应每周检测1次犬血清中抗腺病毒抗体，直到停止注射后3 mo. 1.2.3犬血清中抗腺病毒抗体测定利用病毒中和反应方法，即病毒与抗血清中和后，将其感染细胞，细胞不产生病变为抗腺病毒抗体阳性，反之细胞出现病变为抗腺病毒抗体阴性，并观察绿色荧光是否出现. 将293细胞接种于96孔细胞培养板上， 5×104个/ 孔. 次日感染病毒()与血清的混合液: 取20 μL犬血清加8 u的青霉素，再加5×106 pfu病毒, 相当于100 MOI (multiplicity of infection, 感染强度)，混匀后37? 水浴 30 min. 吸弃原培养液，加入上述混合液，每个样品双份，每孔加入200 μL，以小牛血清加病毒液作阴性对照, 猴抗血清为阳性对照，置37?，50 mL/L CO2的培养箱继续孵育. 24，36，48 h观察荧光及CPE(细胞病变效应). 1.2.4犬血清中中和抗体测定用ELISA方法测定血清中抗HGF抗体水平. 收集稳定分泌表达HGF的CHO细胞的培养上清作为抗原，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG为二抗，新鲜配制的OPD 为底物显色液，测A490 nm值. 同时用抗HGF mAb作一 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 曲线，以计算抗体的滴度. 2结果 2.1血清抗腺病毒抗体检测共12次采血，受试动物212只次，手术对照组及正常对照动物血清均出现明显CPE及强荧光(图1). 给药前及给药2次后24 h的血清也出现明显的阳性结果. 给药4次后大剂量组5只动物血清均对腺病毒有中和作用(图2A)，小剂量组3只动物也已检测到抗体. 给药6次后，动物全部检测到高滴度抗体(图2B). 停药后4 wk，抗体水平下降，直至停药12 wk，大剂量和小剂量组动物抗体水平基本都已下降为“?”，分别出现明显CPE及荧光. 同时观察到动物性别及给药剂量大小无差异. A: 293细胞表达强绿色荧光蛋白; B: 与(A)同视野293细胞出现明显CPE. 图1荧光显微镜观察示强荧光和明显CPE×100(略) A: 少量293细胞表达绿色荧光蛋白; B: 极少量293细胞表达绿色荧光蛋白. 图2荧光显微镜观察示弱荧光×100 (略) 2.2血清中抗HGF抗体的检测结果各时间点血清样品中未检测到抗HGF抗体，表明局部注射重组腺病毒后，犬血清中可能不产生抗HGF抗体. 3讨论 腺病毒载体是继逆转录病毒载体之后在基因治疗中广为应用的一种基因转移载体，可感染种类相当广泛的有丝分裂后细胞，甚至包括来自高度分化的组织中的细胞，例如骨骼肌细胞、肺细胞、脑细胞和心肌细胞. 该病毒有以下优点,3-6,: ? 对人类安全，无致畸、致病及致癌性;? 对分裂细胞及癌细胞株的转染效率达到90%,100%;? 腺病毒感染细胞时DNA不整合到宿主细胞染色体中;? 腺病毒容易制备、纯化和浓缩，可达到较高滴度;? 腺病毒载体插入外原基因的容量较大，所以目前国外多用复制缺陷的腺病毒为载体介导p53基因转移. p53基因治疗的研究虽然取得了一定的成绩，也存在不少问题. 最突出的问题为抗体的产生,病毒载体均可引起抗体产生. 腺病毒能引发强烈的免疫反应，在第一次感染后两wk内恒河猴血浆中的抗腺病毒体滴度升高,7,. 由于抗体的产生，腺病毒为载体的基因导入难以反复应用. 近年来，人们对这种载体作了大量改造工作，细胞毒性和免疫原性都有所减弱,3,. 由于比格犬的长期多次开胸心肌注射有困难，故本实验给药方法为:心肌注射和臀部肌肉注射相结合的给药方法. 一方面考虑到长毒的用药途径与临床用药的一致性;另一方面，考虑到犬心肌注射开胸腔造成的创伤太大，若反复多次开胸给药，创伤所引起的反应可能会干扰毒性反应的观察指标，故采用首次心肌注射，其余13次为肌肉注射给药. 本研究结果显示 : ? 手术对照、正常对照组，细胞出现明显CPE，GFP为阳性，而接受多次注射的动物，细胞不出现CPE，GFP阴性，说明多次注射后出现抗腺病毒抗体. ? 停药7 wk后出现不完全中和反应，抗体水平开始下降. 停药12 wk抗体逐渐消失，分别出现明显CPE及荧光，两项检测指标互补，实验结果可信. ? 比格犬血清对293细胞毒性较大，有时影响观察，必须事先56?灭活. ? 受试动物抗体滴度不低于军事医学科学院五所昭衍新药研究中心提供的猴抗5型腺病毒抗血清效价1?800. 各时间点血清样品中未检测到抗HGF抗体，表明局部注射重组腺病毒后，犬血清中可能不产生抗HGF抗体，可能因为HGF是一生理性生长因子，局部注射后HGF的表达仅在局部，而且HGF蛋白的半衰期很短. 【参考文献】 ,1, 任斌 ，译. 基因治疗学,M,. 西安:世界图书出版公司. 2000:89-270. ,2,Edelstein ML,Abedi MR,Wixon,J, et al. Gene therapy clinical trials worldwide 1989-,J,. J Gene Med,2004,6:597- 602. ,3,Shayakhmetov DM, Gaggar A, Ni S, et al. Adenovirus binding to blood factors results in liver cell infection and hepatotoxicity,J,. J Virol, 2005,79 (12):7478-7491. ,4, conjugates possess enhanced infectivity: a new strategy for localized gene delivery,J,. Virology, 2002,299(2):204-212. ,5,Nasz I, Adam E. Recombinant adenovirus vectors for gene therapy and clinical trials,J,. Acta Microbiol Immunol Hung, -348. 6, Adam E, Nasz I. Adenovirus vectors and their clinical , application in gene therapy,J,. Orv Hetil, 2001,142(38):2061-2070. 7, Zabner J, Petersen DM, Puga AP, et al. Safety and efficacy , epithelia of primates and cotton rats ,J,. Nat Genet ,1994,6:75-83.