盐酸土霉素与牛血清白蛋白的相互作用研究

盐酸土霉素与牛血清白蛋白的相互作用研究 盐酸土霉素与牛血清白蛋白的相互作用研 究 第27卷,第3期 2010年5月 光谱实验室 ChineseJournalofSpectroscopyLaboratory Vo1.27.No.3 May,2010 盐酸土霉素与牛血清白蛋白的相互作用研究? 崔艳陈建秋严拯宇? (中国药科大学分析化学教研室南京市童家巷24号210009) "(中国药科大学药物质量与安全预警教育部重点实验室南京市210009) 摘要采用同步荧光和紫外吸收光谱法,研究了在pH7.4o的Tris—HC1缓冲体系下,盐酸土霉素 (OxytetracyclineHCI)与牛血清白蛋白的相互作用,研究表明在正常生理条件下盐酸土霉索对牛血清白蛋 白有较强的猝灭作用,根据不同的药物浓度,温度及紫外吸收光谱的变化,判断其猝灭方式可能为静态猝 灭,同时考察了不同离子存在条件下盐酸土霉素对BSA荧光猝灭的影响.得出在不同温度下反应的结合 常数KD分别为4.167×10tool?L(25?),3.6×10tool?L(37C),盐酸土霉素与BSA按1:1的 比例结合;根据反应热力学参数确定了它们之间相互作用的主要形式为疏水作用力;采用同步荧光考察 了盐酸土霉素对BSA构象的影响,发现随药物浓度的增大,色氨酸残基的最大发射波长不变,而酪氨酸残 基所处环境的疏水性改变,从而导致BSA的构象发生了变化. 关键词盐酸土霉素;牛血清白蛋白;荧光光谱;相互作用 中图分类号:0657.32文献标识码:A文章编号:1004—8138(2010)03-1064-06 1引言 血清白蛋白可与许多内源及外源性化合物结合,有关蛋白质的结构和功能研究以及与药物分 子的相互作用,是目前生命科学,化学和医学界共同关注和感兴趣的课题[1].本文在生理条件下, 采用荧光光谱法研究盐酸土霉素(OxytetracyclineHC1)与牛血清白蛋白的相互作用.计算了不同温 度下的结合常数,并讨论了盐酸土霉素与BSA之间的作用力类型,采用同步荧光技术考察了盐酸 土霉素对BSA构象的影响. 2实验部分 2.1仪器与试剂 (上海雷磁分析F一5301PC型荧光分光光度计(日本岛津公司);pHS一25型pH计仪器厂); HH一6恒温水浴锅(国华电器有限公司);UV一2100紫外分光光度计(日本岛津公司). 牛血清白蛋白(BovineSerumAlbumin,BSA,南京瑞创生物技术有限公司),用三羟甲基氨基 甲烷(Tris)缓冲溶液(0.1tool?I_.,pH一7.4,内含0.1moi?INaC1维持离子强度)配成 4.0×10tool?L-1储备溶液并于冰箱中(温度低于5?)保存. 盐酸土霉素储备溶液浓度为1×10tool?I_.,使用前用0.1mol?L-i的NaC1水溶液稀释.实 ?国家自然科学基金项目(30370404)资助 ?联系人,手机:(0);E—mail:yanzhengyujiang@hotmail.COrn;cjqer@163.com 作者简介:崔艳(1985一),女,安徽省灵璧县人,硕士研究生,主要从事溴酸盐的含量测定方面的研究工作. 收稿日期;2009—08—31;接受日期:2009—09—14 第3期崔艳等:盐酸土霉素与牛血清白蛋白的相互作用研究 验所用溶液均以0.]tool?k1的NaCI水溶液配制,以维持生理条件下的离子强度.除Tris为生化 试剂外,其余试剂均为分析纯.实验用水为二次蒸馏水. 2.2试验 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 于一系列l0mI容量瓶中加入lmI4.0×10mol?I的BSA溶液,依次加入0,0.5,1.0, 1.5,2.0,2.5,3.0,3.5,4.0mI1×10mol?I-1盐酸土霉素溶液,再加入5mI0.1mol?IpH一 7.4的Tris—HC1缓冲液,用0.]mol?INaC1定容摇匀,静置20min,测其荧光光谱.固定激发波长 为280nm,测定220--550nm的发射光谱,同时扫描同步荧光(固定荧光发射与激发的波长差分别 为?,l一60nm和?一15nm,其他条件相同).激发和发射狭缝均为3nm,测定温度分别为25_C和 37C.紫外光谱测定温度为25C. 3结果与讨论 3.1猝灭类型的确定 3.1.1盐酸土霉素与BSA的荧光猝灭三 ? 光谱 蛋白质吸收270--300nm的紫外光而 发生紫外光荧光,这是由于包氨酸,酪氨 酸的存在,使其具有内源荧光.固定BSA 的量,在其中加入盐酸土霉素溶液.随着波长^/nm 浓度的增加,BSA的内源荧光强度有规律图1盐酸土霉素与BSA的相互作用荧光光谱图 地降低,见图1.在此过程中其最大发射峰C,SA:4.0X10mo|?L,,pH7.4,=280~I11;Co 一一c: 位由最初的341nm变为最终的336nm,稍1?0X10m.1'L-1),从上到下加入盐酸土霉 素的体积为: 有蓝移,荧光强度下降69.9,这说明盐.'.?'?.'_'?.'?'.?.,.?,?."L. 酸土霉素对BSA的荧光有猝灭作用,使其构象发生变化. 3.1.2荧光猝灭作用的Stern—Volmer分析一温度的影响 荧光猝灭过程可以分为2种:一种是动态猝灭,另一种是静态猝灭.动态猝灭是猝灭剂和荧光 物质的激发态分子之间所发生的相互作用过程,其效率受荧光物质激发态分子的寿命和猝灭剂的 浓度所限制.而静态猝灭的特征是猝灭剂和荧光物4 质分子在基态时发生配合反应,生成不发光的配合 体,从而降低荧光物质的荧光强度.在动态猝灭中,j 荧光的量子产率是由光反应的动力学控制,而在静2 态猝灭中,量子产率通常只受基态的配合作用的热 力学控制.是动态猝灭还是静态猝灭作用,可根据结 合常数Ksv随温度的变化关系加以判断.对于动态猝 光谱实验室第27卷 /F::=1+KEQ3—1+KEQ3 式中:和F——猝灭剂不存在和存在时蛋白的荧光强度;[Q]——猝灭剂浓度;——双分子猝 灭过程的速率常数;To——不存在猝灭剂时蛋白的荧光寿命,本文取r.一10一S;K——双分子猝灭 速率常数与单分子衰变速率常数的比率.利用不同温度下的实验结果作/F一1-[Q]图(见图2), 从图中可知K.一7.8×10(37?),9.6×10(25?);可求得K一7.8×10mol?I?S(37?), 9.6×10mol?I?S(25C),且随着温度的升高,BSA的猝灭曲线斜率降低.根据报道,各类猝 灭剂对生物大分子的最大碰撞猝灭速率常数为2.0×10mol?L?S_.,而本实验所求得的猝灭 速率常数远远大于此扩散控制的,则说明由碰撞引起的动态猝灭假设不成立,即此 过程是由于 药物与BSA形成了复合物而引起的静态猝灭L7]. 3.1.3吸收光谱的变化 测定了正常生理条件下,4.0×10tool?I的 BSA的紫外吸收曲线及盐酸土霉素与BSA等摩尔混 合物与盐酸土霉素的差谱.发现在各种条件下,两图谱 均没有重合,表明药物的加入使BSA的紫外吸收发生 变化,故进一步说明猝灭机理为静态猝灭.紫外吸收的 差谱图见图3. 3.2盐酸土霉素与牛血清白蛋白的结合位点数 盐酸土霉素对牛血清白蛋白的荧光猝灭不是动态 猝灭,就很可能是由盐酸土霉素与基态的BSA之间形 成了复合物,从而产生静态猝灭.假设一个BSA分子 有,z个相同且独立的结合位点可与盐酸土霉素结合, 用P——蛋白;Q——猝灭剂;Q尸——生成的复合物; 二者之间的猝灭作用可用下式表示[9]: 尸+,2Q—QP 用K表示复合物生成常数,则有 K一[QP3/([尸]EQ-]") 不难导出 lgK+lg[Q]一lg(F./F一1) 分别做不同温度下lg(/F一1)一lg[Q]的对数图 (见图4),根据斜率可求得在25?和37C时BSA对盐 酸土霉素的结合位点数分别为1.3618和1.3127,从 而推测盐酸土霉素与牛血清白蛋白二者以1:1结合. 3.3盐酸土霉素与牛血清白蛋白结合常数的计算 对于以1:1结合的静态猝灭,盐酸土霉素与牛血 清白蛋白结合常数可由 公式 小学单位换算公式大全免费下载公式下载行测公式大全下载excel公式下载逻辑回归公式下载 : F./F=1+K](1) 波长Mnm 图3BSA的紫外吸收光谱图以及BSA与 盐酸土霉素等摩尔(1:1)混合物与 盐酸土霉素的差谱(pH7.4,25C) 卜一BSA的紫外吸收谱; 2——BSA与盐酸土霉素等摩尔(1:1) 混合物与盐酸土霉素的差谱 图425~C和37~C下lg(F./F一1)对 lg[Q]的对数图 及Iineweaver—Burk方程求得. (F.--F)一=Fo+KDF[Q]一(2) 第3期崔艳等:盐酸土霉素与牛血清白蛋白的相互作用研究 (1)和(2)式均为目前研究者常用 的计算蛋白与药物结合常数的公 式E8,1o3.根据(1)式,以/F一1对[Q] 作图(如图2),可以求得不同温度下的 K;而根据(2)式,以(Fo—F)对 [Q]作图(如图5),可以求得不同温 度下的K.(r为相关系数)(见表1). 从表中数据可以认为温度对盐酸 土霉素与BSA之间的结合常数有一 定的影响,同时结合常数显示两者结 合不是较稳定且随温度降低有升高的 图525?和37C下盐酸土霉素与BSA的 1/(F.--F)对1/[Q]图 趋势,盐酸土霉素可在体内被血清白蛋白转运. 3.4热力学参数的计算及作用力类型的确定 不同的药物与蛋白质结合力的类型是不同的,包括氢键,范德华力,静电,疏水等相 互作用的多 种形式.Ross等根据大量的实验结果, 总结 初级经济法重点总结下载党员个人总结TXt高中句型全总结.doc高中句型全总结.doc理论力学知识点总结pdf 出判断一般药物小分子与生物大分子间的非共价相互 作用和生物大分子自身结合力性质的热力学规律,根据反应前后的热力学参数焓变/XH和熵变?5 的相对大小,可以用来确定它们之间的相互作用类型:Z~H>0,?S>O为疏水作用力;??<O,?5< 0为氢键和范德华力;?H<O,/xS>0为静电引力卜?].在温度变化不大时它们的焓变AH可以看 作常数. 表1盐酸土霉素与牛血清白蛋白在不同温度下的结合常数 根据公式 ln(K2/K1)一AH/R(1/丁l一1/T2) ?G一——RTinK. G—AH—T?s 用表1中的K值计算热力学参数焓变?H,熵变?S和自由能变AG,其结果见表2. 表2盐酸土霉素与牛血清白蛋白结合力的热力学参数 利用在正常生理条件下键合常数与温度的关系求得?H为正值,?均为正值,由此可以判断 盐酸土霉素与BSA的相互作用力类型是疏水作用力. 3.5盐酸土霉素对牛血清白蛋白构象的影响 在蛋白质的同步荧光光谱中,/x2=15nm只显示酪氨酸残基的光谱特性,而A2=60nm仅表现 出色氨酸残基的光谱特性.由于蛋白质中芳香氨基酸残基的最大发射波长2m.x与其所处环境的极 性有关,若发生变化,则残基所处的微环境发生了变化,故由此可判断蛋白质构象的变化[14,15]. 固定BSA的浓度,逐渐增加盐酸土霉素的浓度,测量BSA的同步荧光光谱.图6为BSA中酪氨酸 和色氨酸残基的同步荧光光谱图.从图中可以看出BSA与色氨酸残基的荧光最大 发射波长接近, 融 12O 40 光谱实验室第27卷 罨400 曩 200 敬K/nm波+~2/nm 图6BSA与盐酸土霉素的同步荧光差谱 CL~A4.0X10一tool?L一;CbyleIy…liHC1]..0×10一mol?L-., 从上至下加入盐酸土霉素的体积:0,0.5,1.0,1.5,2.0.2.5,3.0,3.5,4.0mL. 说明BSA的荧光主要由色氨酸残基所贡献,且随盐酸土霉素浓度的增大,色氨酸残基的特征荧光 光谱峰形发生了变化,因此可以知道盐酸土霉素,主要与BSA中的色氨酸残基形成了复合物.另 外从图l和图6比较中可以看出,色氨酸残基的荧光降低与BSA的荧光降低更接近,说明盐酸土 霉素与BSA的结合位点更接近于色氨酸残基. 3.6共存离子对药物一蛋白相互作用的影响 人体内存在的一些阴阳离子会影响药物与白蛋白的相互作用.本实验测定了同浓度的盐酸土 霉素对BSA的荧光猝灭作用,随着不同浓度的K,Ag,Cu抖,NH+,Ba抖,Ca抖,Zn抖,Fe抖,A1抖, N0,I一,Br一,BrO,Ac一,sol一,CO;一,HPOj一的加入而发生的变化情况.实验结果显示:除了 Ag,Cu抖,Fe抖,zn.和Ca.对药物一蛋白的相互作用影响比较大外,其他离子几乎没有影响.说明 这些离子的存在使盐酸土霉素与白蛋白的结合常数改变了,从而影响药物在体内的转运及吸收. 4结论 实验发现在正常生理条件下,盐酸土霉素对牛血清白蛋白的荧光猝灭过程属于静态猝灭,而且 紫外吸收光谱也进一步说明猝灭类型是静态猝灭.通过同步荧光光谱研究盐酸土霉素对BSA构象 的影响,说明盐酸土霉素主要与BSA中的色氨酸结合,且结合使氨基酸残基所处的微环境极性增 加.盐酸土霉素与牛血清白蛋白之间可通过疏水作用形成复合物,因此可以被白蛋白所贮存,运载, 通过血液循环达到作用部位.同时实验结果显示一些阳离子的存在对盐酸土霉素和BSA的相互作 用有较大的影响,从而影响药物的体内吸收.这对于从分子水平上了解药物的体内转运与代谢及设 计合成新药具有一定的指导意义. 参考文献 [1]李丹,姜新民,严拯字.荧光光谱法研究山梨醇与牛血清白蛋白的相互作用[J].光谱学与光谱分析,2008,28(6):1312—1316 [2]马康,陈晓青,陈景文.荧光光谱法研究三种黄酮类化合物与BSA的相互作用[J].光谱实验室,2008,25(4):662—667. 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ChinaPharmaceutcalUniversity,Nanjing210009,P.R.China) AbstractTheinteractionofoxytetracyclineHC1andbovineserumalbum(BSA)wasstudiedby synchronousfluorescenceandultravioletabsorptionspectrainphysiologicalconditions.The oxytetracyclineHCIhasstronglyquenchedthefluorescenceofbovineserumalbumininnatural physiologicalcondition,thequenchingmechanismisastaticquenchingprocedureatdifferent temperaturesanddrugconcentration.Thebindingconstantsandthenumberofbindingsitesbetween oxytetracyclineHC1andBSAwerecalculatedatdifferenttemperatures.Furthermore,theenthalpyand entropychangesintheinteractionofoxytetracyclineHC1andbovineserumalbumwerealsoobtained bytheequationsofStern—VolmerandIineweaver— Burk.Fromthethermodynamicparameter,itcan bejudgedthattheprimarybindingpowerbetweenoxytetracyclineHC1andBSAishydrophobic interaction.Moreover,thesynchronousfluorescencespectroscopywasappliedtoexaminetheeffectof oxytctracyclineHCIontheconfigurationofBSA.TheaherativeconfigurationofBSAmaybeinduced bythechangeofhydrophobicenvironmentoftyrosine. KeywordsOxytetracyc1ineHC1;BovineSerumAlbumin;FluorescenceSpectra;Interaction