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鸡Zong菌染色体DNA的研究鸡Zong菌染色体DNA的研究 西兰1’’7,28(.)I.o’WUJCMS…”……一 如一4Db 鸡姒菌染色体DNA的研究 v, 堡_!!业赵呈裕万谦.9jfI7f 1?基础医学奠医学生物学与蛔囊生鞠学教研童(戚鄯610041)} 2.臣学分子生物学研究童 内毫I’?在鸡土且?(TermlamWces抽舢nH”)?壁体i点体探层培养成功的基硇上.为进一步对 其染色体进行分析.采用i点氯研磨,SDS和蛋白冀K消化的方法-鼠i点体培养的璃土且??壁体申提取出 高分子量的策色体DNA,并用紫外嗳收光...

鸡Zong菌染色体DNA的研究
鸡Zong菌染色体DNA的研究 西兰1’’7,28(.)I.o’WUJCMS…”……一 如一4Db 鸡姒菌染色体DNA的研究 v, 堡_!!业赵呈裕万谦.9jfI7f 1?基础医学奠医学生物学与蛔囊生鞠学教研童(戚鄯610041)} 2.臣学分子生物学研究童 内毫I’?在鸡土且?(TermlamWces抽舢nH”)?壁体i点体探层培养成功的基硇上.为进一步对 其染色体进行分析.采用i点氯研磨,SDS和蛋白冀K消化的方法-鼠i点体培养的璃土且??壁体申提取出 高分子量的策色体DNA,并用紫外嗳收光谱,麓腔电诛和限翻冀协等方法进行了鉴定.通过T.值推算 出砖土I?染色体DNA的G+c古量为43.7. 美t调璃土I??壁体染色硝DNA 一,—_J- 近年来.基因工程技术已经深入到遗传背 景清楚的丝状真菌.人们探讨应用基因工程技 术于工业真菌作为育种的兴趣日增,不断尝试 利用丝状真菌作为寄主生产外泌医药,工业蛋 白[I].我们在成功地从野生鸡土I菌分离出一种 可以用于工业发酵生长的菌株的基础上,对 该菌株的染色体DNA进行分离和鉴定,并测 定了T.值和G+C台量.为今后开展鸡土jl菌的 基因克隆,分子杂交,构建基因文库,外源基因 表达及原生质体融台中分子标记的建立等奠定 了基础. I材料与方法 1.I材料 鸡H菌苗丝体由本室液体发酵制备.菌种 由本室赵呈裕等从野生苗中分离,纯化,保存并 通过鉴定. 1.2方法 1.2.I茵丝体培养与收集接种鸡土I菌种至 液体马铃薯葡萄糖培养基(PD)中,28”C,125r/ min旋摇培养48小时,得一级种于液.将一级 种子液以5,1O(v/v)的接种量转接 ?四川省科薯科研基盒费助 ?研究生,现在广百卫生蕾理干部学院(膏宁530021) },裢 100ml培养基,在上述相同条件下培养36小 时,使鸡土I菌苗丝体生长至对教生长期后期.用 双层无菌纱布过滤培养液,用无菌水洗涤菌丝 体至颜色发白为止,滤纸压干. 1.2.2染色体DNA的提取菌丝体至研钵 中加液氮磨成粉末状.移入50ml消毒离心管 中,加入裂解缓冲液(10mmol/LTds—HCI,pH 7.4}0.4mol/LNaCI;20mmol/LEDTA, pH8.0}SDS0.5%(W/V),蛋白酶Kl20~tg/m1) 55~56?水浴保温消化6小时,放置至室温后, 加入1/4体积的饱和NaCa,彻底混合20分钟, 20??1000,离心15分钟,取上清液加2倍 体积的预冷无水乙醇沉淀DNA,慢慢转动离心 管,使絮状DNA分子上浮后,用细针轻轻挑 出.70乙醇洗葫}一次,控干酒精,真空干燥, 10~SPa20分钟左右溶于适量TE中. I.2.3限制性酶晦切染色体DNA酶切反应 按Sambrook等条件进行. I-2.4璋脂糖凝胶电泳用水平板凝胶电泳 测定染色体DNA及限制性酶切结果.琼脂糖 凝胶浓度为0.8.6ov电泳约2小时,254nm 紫外光观察并照相. 1-2.5紫外吸收光谱测定紫外吸收光谱测 定参照LeonardG.Davis等的方法进行. 4期张明等.鸡H曹染色体DNA的研究 uV一2201分光光度计测定. 1.2.6染色体DNA的T.值测定参照林万 明’的方法,略加改进.将DNA样品溶于0.01 ×SSC(1.5mmol/LNaCI一0.5mmol/L柠檬酸 钠,pH7.0)中,固定波长260rim,在连续升温中 测定每一温度的吸光值,根据测定结果绘出1 曲线. 2结果 2.1鸡?jl茁染色体DNA的分离鉴定结果 使用本实验方法,获得的DNA产量约达 菌丝体湿重的0.15.电泳结果表明,所得染 色体DNA完整,为均一的DNA带,纯度较高, 无RNA污染(图1).紫外吸收At*/A”o比值为 I.93. 田1砖.Li菌晕色体DNA尊瞄?簟棘电诛田谱 FigIAgarmegel*leerraphereslsofchromm2.2DNA的’r_值和G+c含量 热变性扫描曲线完成后,用各吸光度乘以 相应温度的相,对膨胀体积进行校正,绘成 DNA热变性曲线,如图2.从热变性曲线中知 鸡土jl菌的染色体DNA的T值为87.2?,应用 公式(G+c)=(1一69.3)×2.44计算染色 体DNA的G+c含量为43.7. Temperature(?) 田2砖?I?簟色体DNA播生性曲垮 nl2C_r仲ottkr??一d|_t.Int’峨ot”吨r哪 以-一-?”feb’omemmalDNA. 3讨论 目前,已经建立了多种在丝状真菌中提取 DNA的方法[.这些方法基本原理是相似 的,即一是通过机城的或酶解的方法破坏细胞 壁}二是通过去污剂将原生质体或细胞核融解; 三是通过酚,氯仿或梯度离心去除蛋白质等成 份.本实验采用了经典的酚和氯仿法及经改良 的不使用酚,氯仿的抽提方法.两种方法相比 较,改良的方法较经典的酚和氯仿法简化了提 取过程,只需一次离心,因此DNA损失较少. 且用细针捞取到高分子量的DNA,DNA分子 不易发生断裂,同时,也减少了RN DNAT值时遇到了高T值给涮定带来的困 难,即测定温度超出了紫外分光光度计的升温 限值.通过有关资料’了解到,DNA溶液的离 子强度对其T有很大的影响,高T值的困难 可以通过改变缓冲液的浓度加以解决.我们尝 试了由ISSC改为0.01SSC的缓冲液进行T 值测定,使温度约降低了32”C,顺利地完成了 T的测定. 本研究系首次从液体培养的鸡土且菌苗丝体 中分离出大分子量的染色体DNA,并对其一些 特性进行了研究,获得了一些数据,为鸡土I菌分 子生物学的研究提供了重要资科,为进一步开 展基因工程及分子育种研究奠定了基础. 参考文献 1蘩平彦.筮状真蕾的质拉.原生质雄转化和外潭基园衰 达.生物工蠢进展,1992I12(1)I21 2越皇谱.享虹.鄞雪莲苷.璃土且蕾蕾堂体的藏体耀层培 舞和I匕学威份分析.中田用蕾.1988I33C5)I18 3SamhmokJ,FritaehEF.ManlatisT.Molecularcloningl Alaboratorymanua1.2ndan.NewYorklColdSpring HarborLaorstory.1989l3.2 t田勇.汪田蕾译.分于生橱学方法.长沙t朔南科学拄 术出囊社.1990#287,888 5#万孽f.蛔蕾分于蕞传学分类鉴定.上海,上海辩学拄 木出版社.1990I86,98 8RaanerU,BrodsP.RapidpreparationofDNAfromilia— mentousf.ng1.LettApplMicrobiol?1988;1(1)l17 7BainbridgeBW.spreadburyCI,ScaliaeFG,.【切一 provedmethodsforthepreparationofhighmol~ulsr weightDN’Afrmlarse dsmallscaleculturesofilia一 1IlleIldtOU8fung~.FEMSMicrobiolLett.1990;54(3)li13 8MollerEM.BahnwegG.SandermannH,一a1.Asimple sane[flcientptotoc~foriaolationofhighmolecular we;tDNAfromfilamentousfungi.fruitbodies.andin- leeredplanrtiuues.NuclAcldRes,1992I80(22)I6115 9ChallenMP,MGoreAJ,CarteraDM.Fadhext~ction andpudl”ieazi0~offilamentousfungalDNA.B[oTech— nlque~.1995l18(6)I975 10HorgenPA,ArthurR.St哪N.4.ThenucleotldesE_ queneebomo/ogleaof”uniqueDNAsofB0mtcultivated andwildmuahr~ma.CanJMierobio1.1984l30l887 ll刘椒?.属盒讨,刘檀义辱.簟菇平菇棱DNA的研究. ?用蕾,1986I38(6)I1 (1996—10-14收曹,1997-06—04悻回) 蕾{I范集寸 PropertiesofChromosomalDNAofTermitomycesalbuminosus ZhangMlng.ZhaiChaoyangZhaoChengyuWanOlan 1.FJel~artmest口,MedicalBiolagyandCellBiology.$clmolBadc Medical$c;eaces(Chengdu610041)’2.1.,abor~ary ofMoletldarBiolog~j Ab|true!Ch~ornosomalDNAwasextractedand isolatedfrommyceliaTrrmitomycesallrdminosussub- mergedculture?groundwiqhliquidnitrogen?andtreat edwithSDSandproteinaseK.Thepropertiesofthe DNAwereidentifiedbyU.V.absorptionrate?agaro~e Kword~Termltomycesalb~mlnorusMyeellum gelelectrophoresisandrestrictionendonucIeasediges— tion.TheT-ofchromosomalDNAfromTermitom3ces albuminmusdeterminedWas87.2?.TheG+C?n_ tentw?estimattobe43.7%.
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