鸡Zong菌染色体DNA的研究
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鸡姒菌染色体DNA的研究
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1?基础医学奠医学生物学与蛔囊生鞠学教研童(戚鄯610041)}
2.臣学分子生物学研究童
内毫I’?在鸡土且?(TermlamWces抽舢nH”)?壁体i点体探层培养成功的基硇上.为进一步对
其染色体进行分析.采用i点氯研磨,SDS和蛋白冀K消化的方法-鼠i点体培养的璃土且??壁体申提取出
高分子量的策色体DNA,并用紫外嗳收光谱,麓腔电诛和限翻冀协等方法进行了鉴定.通过T.值推算
出砖土I?染色体DNA的G+c古量为43.7.
美t调璃土I??壁体染色硝DNA
一,—_J-
近年来.基因工程技术已经深入到遗传背
景清楚的丝状真菌.人们探讨应用基因工程技
术于工业真菌作为育种的兴趣日增,不断尝试
利用丝状真菌作为寄主生产外泌医药,工业蛋
白[I].我们在成功地从野生鸡土I菌分离出一种
可以用于工业发酵生长的菌株的基础上,对
该菌株的染色体DNA进行分离和鉴定,并测
定了T.值和G+C台量.为今后开展鸡土jl菌的
基因克隆,分子杂交,构建基因文库,外源基因
表达及原生质体融台中分子标记的建立等奠定
了基础.
I材料与方法
1.I材料
鸡H菌苗丝体由本室液体发酵制备.菌种
由本室赵呈裕等从野生苗中分离,纯化,保存并
通过鉴定.
1.2方法
1.2.I茵丝体培养与收集接种鸡土I菌种至
液体马铃薯葡萄糖培养基(PD)中,28”C,125r/
min旋摇培养48小时,得一级种于液.将一级
种子液以5,1O(v/v)的接种量转接
?四川省科薯科研基盒费助
?研究生,现在广百卫生蕾理干部学院(膏宁530021)
},裢
100ml培养基,在上述相同条件下培养36小
时,使鸡土I菌苗丝体生长至对教生长期后期.用
双层无菌纱布过滤培养液,用无菌水洗涤菌丝
体至颜色发白为止,滤纸压干.
1.2.2染色体DNA的提取菌丝体至研钵
中加液氮磨成粉末状.移入50ml消毒离心管
中,加入裂解缓冲液(10mmol/LTds—HCI,pH
7.4}0.4mol/LNaCI;20mmol/LEDTA,
pH8.0}SDS0.5%(W/V),蛋白酶Kl20~tg/m1)
55~56?水浴保温消化6小时,放置至室温后,
加入1/4体积的饱和NaCa,彻底混合20分钟,
20??1000,离心15分钟,取上清液加2倍
体积的预冷无水乙醇沉淀DNA,慢慢转动离心
管,使絮状DNA分子上浮后,用细针轻轻挑
出.70乙醇洗葫}一次,控干酒精,真空干燥,
10~SPa20分钟左右溶于适量TE中.
I.2.3限制性酶晦切染色体DNA酶切反应
按Sambrook等条件进行.
I-2.4璋脂糖凝胶电泳用水平板凝胶电泳
测定染色体DNA及限制性酶切结果.琼脂糖
凝胶浓度为0.8.6ov电泳约2小时,254nm
紫外光观察并照相.
1-2.5紫外吸收光谱测定紫外吸收光谱测
定参照LeonardG.Davis等的方法进行.
4期张明等.鸡H曹染色体DNA的研究
uV一2201分光光度计测定.
1.2.6染色体DNA的T.值测定参照林万
明’的方法,略加改进.将DNA样品溶于0.01
×SSC(1.5mmol/LNaCI一0.5mmol/L柠檬酸
钠,pH7.0)中,固定波长260rim,在连续升温中
测定每一温度的吸光值,根据测定结果绘出1
曲线.
2结果
2.1鸡?jl茁染色体DNA的分离鉴定结果
使用本实验方法,获得的DNA产量约达
菌丝体湿重的0.15.电泳结果表明,所得染
色体DNA完整,为均一的DNA带,纯度较高,
无RNA污染(图1).紫外吸收At*/A”o比值为
I.93.
田1砖.Li菌晕色体DNA尊瞄?簟棘电诛田谱
FigIAgarmegel*leerraphereslsofchromm2.2DNA的’r_值和G+c含量
热变性扫描曲线完成后,用各吸光度乘以
相应温度的相,对膨胀体积进行校正,绘成
DNA热变性曲线,如图2.从热变性曲线中知
鸡土jl菌的染色体DNA的T值为87.2?,应用
公式(G+c)=(1一69.3)×2.44计算染色
体DNA的G+c含量为43.7.
Temperature(?)
田2砖?I?簟色体DNA播生性曲垮
nl2C_r仲ottkr??一d|_t.Int’峨ot”吨r哪
以-一-?”feb’omemmalDNA.
3讨论
目前,已经建立了多种在丝状真菌中提取
DNA的方法[.这些方法基本原理是相似
的,即一是通过机城的或酶解的方法破坏细胞
壁}二是通过去污剂将原生质体或细胞核融解;
三是通过酚,氯仿或梯度离心去除蛋白质等成
份.本实验采用了经典的酚和氯仿法及经改良
的不使用酚,氯仿的抽提方法.两种方法相比
较,改良的方法较经典的酚和氯仿法简化了提
取过程,只需一次离心,因此DNA损失较少.
且用细针捞取到高分子量的DNA,DNA分子
不易发生断裂,同时,也减少了RN
DNAT值时遇到了高T值给涮定带来的困
难,即测定温度超出了紫外分光光度计的升温
限值.通过有关资料’了解到,DNA溶液的离
子强度对其T有很大的影响,高T值的困难
可以通过改变缓冲液的浓度加以解决.我们尝
试了由ISSC改为0.01SSC的缓冲液进行T
值测定,使温度约降低了32”C,顺利地完成了
T的测定.
本研究系首次从液体培养的鸡土且菌苗丝体
中分离出大分子量的染色体DNA,并对其一些
特性进行了研究,获得了一些数据,为鸡土I菌分
子生物学的研究提供了重要资科,为进一步开
展基因工程及分子育种研究奠定了基础.
参考文献
1蘩平彦.筮状真蕾的质拉.原生质雄转化和外潭基园衰
达.生物工蠢进展,1992I12(1)I21
2越皇谱.享虹.鄞雪莲苷.璃土且蕾蕾堂体的藏体耀层培
舞和I匕学威份分析.中田用蕾.1988I33C5)I18
3SamhmokJ,FritaehEF.ManlatisT.Molecularcloningl
Alaboratorymanua1.2ndan.NewYorklColdSpring
HarborLaorstory.1989l3.2
t田勇.汪田蕾译.分于生橱学方法.长沙t朔南科学拄
术出囊社.1990#287,888
5#万孽f.蛔蕾分于蕞传学分类鉴定.上海,上海辩学拄
木出版社.1990I86,98
8RaanerU,BrodsP.RapidpreparationofDNAfromilia—
mentousf.ng1.LettApplMicrobiol?1988;1(1)l17
7BainbridgeBW.spreadburyCI,ScaliaeFG,.【切一
provedmethodsforthepreparationofhighmol~ulsr
weightDN’Afrmlarse
dsmallscaleculturesofilia一
1IlleIldtOU8fung~.FEMSMicrobiolLett.1990;54(3)li13
8MollerEM.BahnwegG.SandermannH,一a1.Asimple
sane[flcientptotoc~foriaolationofhighmolecular
we;tDNAfromfilamentousfungi.fruitbodies.andin-
leeredplanrtiuues.NuclAcldRes,1992I80(22)I6115
9ChallenMP,MGoreAJ,CarteraDM.Fadhext~ction
andpudl”ieazi0~offilamentousfungalDNA.B[oTech—
nlque~.1995l18(6)I975
10HorgenPA,ArthurR.St哪N.4.ThenucleotldesE_
queneebomo/ogleaof”uniqueDNAsofB0mtcultivated
andwildmuahr~ma.CanJMierobio1.1984l30l887
ll刘椒?.属盒讨,刘檀义辱.簟菇平菇棱DNA的研究.
?用蕾,1986I38(6)I1
(1996—10-14收曹,1997-06—04悻回)
蕾{I范集寸
PropertiesofChromosomalDNAofTermitomycesalbuminosus
ZhangMlng.ZhaiChaoyangZhaoChengyuWanOlan
1.FJel~artmest口,MedicalBiolagyandCellBiology.$clmolBadc
Medical$c;eaces(Chengdu610041)’2.1.,abor~ary
ofMoletldarBiolog~j
Ab|true!Ch~ornosomalDNAwasextractedand
isolatedfrommyceliaTrrmitomycesallrdminosussub-
mergedculture?groundwiqhliquidnitrogen?andtreat
edwithSDSandproteinaseK.Thepropertiesofthe
DNAwereidentifiedbyU.V.absorptionrate?agaro~e
Kword~Termltomycesalb~mlnorusMyeellum
gelelectrophoresisandrestrictionendonucIeasediges—
tion.TheT-ofchromosomalDNAfromTermitom3ces
albuminmusdeterminedWas87.2?.TheG+C?n_
tentw?estimattobe43.7%.
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