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QIAGEN--miScript PCR系统中文说明书(初次翻译,如有错误,敬请包涵).doc

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小小水马走
2017-09-20 0人阅读 举报 0 0 0 暂无简介

简介:本文档为《QIAGEN--miScript PCR系统中文说明书(初次翻译,如有错误,敬请包涵)doc》,可适用于初中教育领域

QIAGENmiScriptPCR系统中文说明书(初次翻译,如有错误,敬请包涵)miScriptPCR系统操作手册试剂盒成分:miScriptReverseTranscriptionKitmiScriptPrimerAssaysmiScriptSYBRGreenPCRKitxmiScriptPrimerAssay和xmiScriptPrecursorAssay是干粉状的需要稀释。首先短暂离心小管然后加入μlTEpH最后在漩涡震荡仪上次。为了保持引物的活性在冷冻条件下将稀释的引物分装成小管。实验步骤:反转录反应、在冰上融化RNA室温下(–ºC)融化xmiScriptRTBuffer和RNasefreewater。先轻弹每个小管使其充分混匀然后短暂离心以收集管壁和管盖上的液体最后放置在冰上。、在冰上配制reversetranscriptionmastermix。配好后混合并放置在冰上。如果miScriptReverseTranscriptaseMix是从C冰箱拿出来的话那么在使用完毕后立刻放入冰箱。如果要配制多次反应先在一个大管中准备Mix并且多配制。、将miScriptReverseTranscriptaseMix分装到每个小管中然后加入RNA。、在C下孵育分钟、在C下孵育分钟以灭活miScriptReverseTranscriptaseMix、如果马上进行PCR讲产物放置在冰上如果不立刻做PCR那么将反转录产物放置在C实验步骤:RealTimePCR检测miRNA或NoncodingRNA、融化xQuantiTectSYBRGreenPCRMasterMixxmiScriptUniversalPrimer,xmiScriptPrimerAssay,templatecDNA,和RNasefreewater。用前分别混匀各试剂。、按下表准备反应mix。因为PCR反应是热启动反应所以在配制mix时不须放置在冰上。cDNA的添加量不要超过PCR反应体系的。、加入模板cDNA到每个小管中如果同时检测miRNA和miRNA前体miRNA的cDNA加入量就要和检测前体时的加入量相同(ng)。、充分混合好反应mix然后分装到有cDNA的小管中。、短暂离心、按一下程序进行PCR反应在每次PCR反应中都要实施融解曲线以确定反应的特异性和一致性。miRNAspecificPCR产物的Tm值大概为–C。合成的单链miRNA可以用来作为内部的阳性对照。和miRNA同时进行融解曲线分析。也可以进行cDNA合成后再进行标准曲线构建以确定miRNA的拷贝数。实验步骤:RealTimePCRforDetectionofPrecursormiRNARNA纯化步骤必须包含基因组DNA去除步骤。并且要求有“noRT”control。、融化xQuantiTectSYBRGreenPCRMasterMix,xmiScriptPrecursorAssay,templatecDNA,和RNasefreewater。并分别混匀。、按下表配制反应mix。cDNA的加入量不要超过反转录反应体系的。、分装模板cDNA(ngreaction)到每个小管中。、充分混匀反应mix后分装到每个小管。、短暂离心、按下列程序进行PCR反应基因组DNA(ngreaction)可以用作阳性对照。讲基因组DNA和miRNA前体同时扩增并比较融解曲线可以确定融解曲线的重复性。附录:ProtocolforUseofSyntheticmiRNAasPositiveControlinmiRNADetection、按下表准备一个μl体积的反转录反应使用μl的合成miRNA(终浓度copiesμl)和ng细菌载体RNA。、在C孵育分钟、在C孵育分钟后转至冰上、加入μl细菌载体RNA(终浓度ngμl)用移液器轻轻上下吹打混匀并短暂离心。这时稀释的产物浓度为copiescDNAμl、用第一步产生的cDNA和载体RNA(ngμl)做一下的梯度稀释、使用管中的产物μ来制作标准曲线。运输和储存miScriptReverseTranscriptionKit和miScriptSYBRGreenPCRKit是干冰运输的。两个试剂盒包括所有的试剂和缓冲剂都应该立刻放入度冰箱。miScriptPrimerAssays和miScriptPrecursorAssays是干粉状室温运输的。储存时无论是干粉状还是稀释后也应该在度。避免反复冻融。如果正确处理其可以保持个月的优秀性能。稀释xmiScriptPrimerAssay或xmiScriptPrecursorAssay时先短暂离心再添加μlTEPh*最后用漩涡震荡仪震荡次。这样可以得到次μl的引物。我们要求对引物进行分装后再冻存避免反复的冻融引物。*具体请参见“用户提供的仪器和试剂”介绍miScriptPCRSystem是一个由三个部分组成的系统它包含了miScriptReverseTranscriptionKit,miScriptSYBRGreenPCRKit,和miScriptPrimerAssay。这个系统能够敏锐的特异的定量miRNA。最重要的是确保用于miScriptPCRSystem的RNA包含有miRNA。QIAGEN提供一系列的方案从总RNA中纯化长度在以上的核苷酸。我们推荐miRNeasyMiniKit或miRNeasyKit来纯化各种动物人的组织和细胞中的RNA或miRNeasyFFPEKit来纯化FFPE中的组织切片中的RNA。我们推荐在用于miScriptPCRSystem之前先对RNA进行柱上DNase消化步骤。另外miRNeasyProtectAnimalBloodKit能够从大鼠小鼠和其他小动物的血液中纯化RNA于RNAprotectAnimalBloodTube中。PAXgenemiRNAKits能够从固定在PAXgeneTissueContainers中的动物人组织或PAXgeneBloodRNATubes中人的血液组织中纯化miRNA和总RNA。miScriptReverseTranscriptionKit能有效的一步将miRNA,mRNA和其它非编码RNA转录成cDNA。miScriptPrimerAssay和miScriptSYBRGreenPCRKit一起运用可以通过SYBRGreen实时定量miRNA。(表一)相对于其他的系统用miScriptReverseTranscriptionKit生成cDNA能用以检测多重miRNA。一个cDNA可用于不同的miScriptPrimerAssays检测上百种miRNA并进行综合性的表达谱分析。miScriptReverseTranscriptionKit也可用于miRNA前体其它非编码RNA和细胞mRNA。通过合适的引物也可以用实时PCR检测它们。(例如:miScriptPrecursorAssays用于前体检测QuantiTectPrimerAssays用于mRNA检测)。表一:miRNA,mRNA,和其它小RNA检测原理和步骤反转录步骤miScriptReverseTranscriptionKit包括miScriptReverseTranscriptaseMix和miScriptRTBuffer。miScriptReverseTranscriptaseMix是一种优化好的酶混合物包含poly(A)聚合酶和反转录酶。miScriptRTBuffer是专门为miScriptReverseTranscriptaseMix设计的。此Buffer系统能最大化的激活两种酶。miScriptRTBuffer也包含Mg,dNTPs,oligodTprimers,和randomprimers。不同于mRNAmiRNA没有多腺苷酸尾巴。在反转录步骤中miRNA会被加上poly(A)尾巴。反转录酶通过oligodT和randomprimers转化RNA(包括miRNA前体成熟miRNA其它非编码小RNA和mRNA)成cDNA。多腺苷酸化和反转录是在同一管中进行。oligodT引物有一个universaltagsequence在’端。这个universaltag可用于实时PCR扩增。(表二)表二miScriptprinciple。miRNA和其它非编码RNA被poly(A)polymerase多腺苷酸化然后被oligodT和反转录酶转化为cDNA。mRNA被oligodT,randomprimer和反转录酶反转录成cDNA。cDNA被用于成熟miRNA的实时PCR定量检测(用miScriptPrimerAssay和themiScriptUniversalPrimer)miRNA前体(用miScriptPrecursorAssay)非编码RNA(用特异性miScriptPrimerAssay和miScriptUniversalPrimer)或mRNA(用QuantiTectPrimerAssay)。实时PCR步骤一个样品制备的cDNA可以用于成熟和前体miRNAmRNA和其它小RNA的多重实时PCR定量检测。成熟miRNA的检测以cDNA为模板用miRNAspecificmiScriptPrimerAssay和miScriptSYBRGreenPCRKit进行。用miScriptUniversalPrimer(miScriptSYBRGreenPCRKit中)来扩增miRNAuniversaltagsequence和miScriptPrimerAssay都是特异性的。前体miRNA检测以cDNA为模板用miScriptPrecursorAssay和miScriptSYBRGreenPCRKit进行。用miScriptPrecursorAssay:包含前后引物它们都与前体miRNA的茎环序列结合。miScriptUniversaPrimer为被使用。miScriptPrecursorAssay结合的茎环序列在两种前体miRNA(primiRNA和premiRNA)中都存在所以miScriptPrecursorAssays同时对两种前体进行了定量。mRNA检测以cDNA为模板用QuantiTectPrimerAssay和miScriptSYBRGreenPCRKit进行。QuantiTectPrimerAssay:包含前后引物。miScriptUniversalPrimer没有被使用。参考基因如GAPDHmiRNA的潜在目标mRNA或其它mRNA可以被定量。其它非编码小RNA检测以cDNA为模板,用smallRNA–specificmiScriptPrimerAssay和miScriptSYBRGreenPCRKit进行实时PCR分析。小RNA用miScriptUniversalPrimer(miScriptSYBRGreenPCRKit中)扩增。universaltagsequence和miScriptPrimerAssay是特异性的。如果没有可使用的miScriptPrimerAssays可以为感兴趣的小RNA传统设计。(wwwqiagencommiDesign)用户提供的仪器和试剂用化学试剂来工作穿着合适的实验服一次性的手套和防护眼镜。更多信息查阅合适的MSDSs可向供应商购买。稀释xmiScriptPrimerAssay或xmiScriptPrecursorAssayTE,pH包含mMTrisCl和mMEDTA。ml的TE:mlofMTrisCl,pH(autoclaved)mlofMEDTA,pH(autoclaved)mlofdistilledwater稀释xmiScriptPrimerAssay或xmiScriptPrecursorAssay短暂离心加入μlTE,pH漩涡震荡次。我们要求稀释后立刻分装。反转录塑料管(μl反应体系)冰阻热块或水浴锅(可加热至度)漩涡振荡器微型离心机实时定量PCR参考RNA阵列引物设计(访问wwwqiagencomGeneGlobe选择和定制感兴趣的基因引物)重点标准化control为了精确和可重复的miRNA实时定量PCR结果有必要用合适的内生性参照RNA对目的miRNA进行标准化。此方法以相对定量而著称。标准化可以校正不利于准确定量的因素。这些因素包括加入的RNA变异RNA降解或RNA抑制剂和样品处理方式不同。标准化后也可以对不同实验和样品的结果直接进行比较。miScriptPCRControls是可以用miScriptPCRSystem对miRNA进行实时PCR定量研究的引物。它是snoRNAsandsnRNAs在设计时已经考虑了人小鼠大鼠中的序列同源性这样它们就可以直接用于这三种物种。所有的control的扩增效率将近。更多信息和数据请访问wwwqiagencommiRNAControls实验步骤:反转录反应实验前重点此方法优化了使用量为pg至μg的RNA。如果使用量>μgRNA相应扩大反应体系。此方法RNA最低使用量为pg可提供多于pg的cDNA给后续的实时PCR反应。但具体的用量参见miRNA和非编码RNA,前体miRNA或mRNA。所有反应液的配制都应在冰上进行是RNA的降解最小化。可选:可添加RNaseinhibitorRTprimersanddNTPs已经包含在试剂盒中无需另外添加。在反转录反应前无需单独的变性和热处理步骤。反转录完成后需要在度孵育分钟以灭火反转录酶。如果第一次使用RNA请阅读附件B步骤、在冰上融化RNA室温下(–ºC)融化xmiScriptRTBuffer和RNasefreewater。先轻弹每个小管使其充分混匀然后短暂离心以收集管壁和管盖上的液体最后放置在冰上。重点:miScriptReverseTranscriptionKit使用的总RNA必须包含后miRNA。我们要求使用miRNeasyKits。要求在使用miRNeasyKits纯化RNA时进行柱上DNase消化。这样可以去除任何微量的基因组DNA对结果的影响特别是对于含量很低的前体miRNA的定量。另外PAXgenemiRNAKits可以从固定在PAXgeneTissueContainers中的组织或PAXgeneBloodRNATubes中的血液中纯化miRNA和总RNA。、在冰上配制reversetranscriptionmastermix。配好后混合并放置在冰上。reversetranscriptionmastermix包含了第一链cDNA合成的所有成分除了模板RNA。注意:miScriptReverseTranscriptaseMix是从C冰箱拿出来的话那么在使用完毕后立刻放入冰箱。注意:如果要配制多次反应先在一个大管中准备Mix并且多配制。注意:此方法适用于pg至μgRNA。如果>μgRNA相应扩大反应体系。例如如果使用μgRNA配制倍的反应体系μl、将miScriptReverseTranscriptaseMix分装到每个小管中然后加入RNA。、在C下孵育分钟、在C下孵育分钟以灭活miScriptReverseTranscriptaseMix、如果马上进行PCR将产物放置在冰上如果不立刻做PCR那么将反转录产物放置在C冰箱。注意:成熟miRNA和前体miRNA要求不同量的cDNA模板。实验步骤:RealTimePCR检测miRNA或NoncodingRNA开始前的重点PCR必须从度孵育分钟开始以激活HotStarTaqDNAPolymerase(包含在xQuantiTectSYBRGreenPCRMasterMix)。每次运行的分析都要重新校正极限值。当使用ABIPRISM强烈要求使用光学粘合盖以密封PCR板。不要使最终反应体积小于μl。开始前准备的物品如果第一次使用miScriptPrimerAssay先遵照“运输和储存”中的说明稀释。(miScriptUniversalPrimer已经是xsolution了不用再稀释)检测多重miRNA非编码RNA,前体miRNA和mRNA有必要将cDNA用RNasefreewater或TE,pH稀释。、融化xQuantiTectSYBRGreenPCRMasterMixxmiScriptUniversalPrimer,xmiScriptPrimerAssay,templatecDNA,和RNasefreewater。用前分别混匀各试剂。、按下表准备反应mix。Reactionmix包含了模板cDNA以外的所有成分。因为PCR反应是热启动反应所以在配制体系和编辑实时定量仪程序时不须讲样品放置在冰上。重点:cDNA的添加量不要超过PCR反应体系的。有必要对cDNA进行稀释以确保每个反应中的终浓度为–ng而且体积。注意:无需优化Mg终浓度。xQuantiTectSYBRGreenPCRMasterMix中mMMg终浓度试已经优化好了的。、加入模板cDNA到每个小管中注意:ng的cDNA模板通常可以做出成功的实时PCR。如果需要可以稀释cDNA。因为高浓度的模板cDNA会导致非特异性PCR产物是结果难以解释。然而根据miRNA的含量也可以增加cDNA的量以优化结果。另外加入量也由实验的优化决定。注意:如果平行检测miRNA和miRNA前体miRNA的cDNA加入量就要和检测前体时的加入量相同(ng)以便直接比较实验结果。、充分混合好反应mix然后分装到有cDNA的小管中。、短暂离心、按一下程序进行PCR反应、PCR反应。如果使用AppliedBiosystems要求调节默认的“ManualCT”极限值到更低的值(如)以适合数据分析。注意:在每次PCR反应中都要实施融解曲线以确定反应的特异性和一致性。注意:miRNAspecificPCR产物的Tm值大概为–C。但它会因循环数的不同而不同。PCR产物的Tm值也跟buffer盐离子浓度有关。用QuantiTectSYBRGreenPCRreagents获得的Tm值会不同于其它试剂。注意:合成的单链miRNA可以用来作为内部的阳性对照。和miRNA同时进行融解曲线分析。也可以进行cDNA合成后再进行标准曲线构建以确定miRNA的拷贝数。实验步骤:RealTimePCRforDetectionofPrecursormiRNAmiScriptReverseTranscriptionKit合成的cDNA也可以用于检测前体miRNA。此步骤可使用miScriptPrecursorAssays和themiScriptSYBRGreenPCRKit有效的检测前体miRNA。使用前的重点PCR必须从度孵育分钟开始以激活HotStarTaqDNAPolymerase(包含在xQuantiTectSYBRGreenPCRMasterMix)。此步骤用miScriptPrecursorAssay来检测前体miRNA。miScriptPrecursorAssay包含了miRNA前体特异性前后引物。不要使用miScriptUniversalPrimer。检测前体miRNA重点要避免有基因组DNA包含在RNA样品中。通常前体miRNA的含量很少任何基因组DNA在样品中都会在PCR中被扩增导致不可信的结果。RNA纯化步骤应该包括基因组DNA处理以去除任何微量的基因组DNA。(如miRNeasyKits进行柱上DNase消化)另外“noRT”control也应该被包括。它是未添加miScriptReverseTranscriptaseMix的反转录产物。每次反应都要校正极限值。当使用ABIPRISM强烈要求使用光学粘合盖以密封PCR板。不要使最终反应体积小于μl。开始前准备的物品如果第一次使用miScriptPrimerAssay先遵照“运输和储存”中的说明稀释。(miScriptUniversalPrimer已经是xsolution了不用再稀释)检测多重miRNA非编码RNA,前体miRNA和mRNA有必要将cDNA用RNasefreewater或TE,pH稀释。、融化xQuantiTectSYBRGreenPCRMasterMix,xmiScriptPrecursorAssay,templatecDNA,和RNasefreewater。并分别混匀。、按下表配制反应mix。Reactionmix包含了模板cDNA以外的所有成分。因为PCR反应是热启动反应所以在配制体系和编辑实时定量仪程序时不须讲样品放置在冰上。重点:cDNA的添加量不要超过PCR反应体系的。有必要对cDNA进行稀释以确保每个反应中的终浓度为–ng而且体积。注意:无需优化Mg终浓度。xQuantiTectSYBRGreenPCRMasterMix中mMMg终浓度试已经优化好了的。注意:如果配制的总体积不是μl或μl调整反应混合物的体积至终浓度为X但是保持cDNA终浓度为–ngreaction。注意:如果平行检测miRNA和miRNA前体miRNA的cDNA加入量就要和检测前体时的加入量相同(ng)以便直接比较实验结果。、分装模板cDNA(ngreaction)到每个小管中。、充分混匀反应mix后分装到每个小管。、短暂离心、按下列程序进行PCR反应数据采集应该在延伸时进行。、PCR如果使用AppliedBiosystems要求调节默认的“ManualCT”极限值到更低的值(如)以适合数据分析。注意:在每次PCR反应中都要实施融解曲线以确定反应的特异性和一致性。注意:基因组DNA(ngreaction)可用来作为阳性对照。平行扩增基因组DNA和前体miRNA并比较两者的融解曲线可确认融解曲线的重复性。注意:前体miRNA和成熟miRNA可以用同一cDNA在同一次PCR中平行定量。实验步骤:mRNA的实时PCR检测miScriptReverseTranscriptionKit合成的cDNA也可以用于检测任何mRNA。此步骤可使用QuantiTectPrimerAssays和themiScriptSYBRGreenPCRKit有效的检测mRNA。更多细节信息请参考QuantiTectPrimerAssayHandbook(wwwqiagencomHBPrimerAssay)。使用前的重点PCR必须从度孵育分钟开始以激活HotStarTaqDNAPolymerase(包含在xQuantiTectSYBRGreenPCRMasterMix)。此步骤用基因特异性前后引物(QuantiTectPrimerAssay)来检测mRNA。不要使用miScriptUniversalPrimer。每次反应都要校正极限值。当使用ABIPRISM强烈要求使用光学粘合盖以密封PCR板。不要使最终反应体积小于μl。开始前准备的物品如果第一次使用QuantiTectPrimerAssay先遵照QuantiTectPrimerAssayHandbook中的说明稀释。检测多重miRNA非编码RNA,前体miRNA和mRNA有必要将cDNA用RNasefreewater或TE,pH稀释。、融化xQuantiTectSYBRGreenPCRMasterMixxQuantiTectPrimerAssay,templatecDNA,和RNasefreewater用前分别混匀各试剂。、按下表准备反应mix。Reactionmix包含了模板cDNA以外的所有成分。因为PCR反应是热启动反应所以在配制体系和编辑实时定量仪程序时不须讲样品放置在冰上。重点:cDNA的添加量不要超过PCR反应体系的。有必要对cDNA进行稀释以确保每个反应中的终浓度为–ng而且体积。注意:无需优化Mg终浓度。xQuantiTectSYBRGreenPCRMasterMix中mMMg终浓度试已经优化好了的。、加入模板cDNA(–ngreaction)到每个小管中、充分混合好反应mix然后分装到有cDNA的小管中。、短暂离心、按一下程序进行PCR反应数据采集应该在延伸的时候进行、PCR反应。如果使用AppliedBiosystems要求调节默认的“ManualCT”极限值到更低的值(如)以适合数据分析。注意:在每次PCR反应中都要实施融解曲线以确定反应的特异性和一致性。注意:PCR产物的Tm值跟buffer盐离子浓度有关。用QuantiTectSYBRGreenPCRreagents获得的Tm值会不同于其它试剂。注意:避免在RNA样品中有DNA污染。根据RNA纯化的组织不同“noRT”control也可能会有荧光信号。当使用QuantiTectPrimerAssays有基因组DNA污染假基因总是跟基因转录序列一样确实内含子的基因也会在PCR循环后期产生信号。当RNA从脾脏或胸腺纯化而来又没有进行DNaseI消化大量的基因组DNA污染存在。为了避免这样的问题发生在使用miRNeasyMiniKit或miRNeasyKit纯化RNA时强烈要求进行DNase消化(如使用QIAGENRNaseFreeDNaseSet,catno)问题检测指南更多内容访问技术支持中心的常见问题解答:wwwqiagencomFAQFAQListaspx。评论与建议没有产物或产物信号推迟(问题发生在反转录反应)a)移液错误或某个试剂忘加检查每步使用的移液器。每个试剂溶解后充分混匀再次反转录。b)反转录试剂配制错误确定反转录在冰上配制c)质量不好或反转录时模板RNA加入量不正确在开始反转录前检查模板RNA的纯度浓度和完整性。模板RNA融解后充分混匀。甚至微量的RNase都能影响cDNA的合成和RTPCR的灵敏度特别是含量较少的RNA。d)RNA浓度太高或太低miScriptReverseTranscriptaseMix需要pg至μgRNA。如果>μgRNA按比例扩大反应体系。不要使用RNA的量低于pg。e)RNA变性模板RNA不需要变性。如果变性RNA的完整性会被影响。f)孵育温度太高反转录反应在度进行。高于此温度会减少cDNA产物的长度或miScriptReverseTranscriptaseMix的活性。检查加热仪器的温度。没有产物或信号推迟或只有引物二聚体被检测到(问题出现在实时PCR)a)反转录产物添加量太高在PCRmix中加入太多反转录产物会降低扩增效率和反应的线性。通常反转录产物的加入量不超过PCR反应体积的。b)PCR退火时间太短按操作说明设置退火温度。c)PCR延伸温度太短按操作说明设置退火温度。d)移液错误或忘加某种试剂检查试剂的浓度和储存条件包括引物和cDNA。e)HotStarTaqDNAPolymerase在热启动时没有被激活确定循环程序包括了热启动步骤仔细检查程序。f)实时PCR中引物浓度没有优化按实时PCR试剂盒要求的浓度使用引物。g)循环数不足增加循环数h)PCR退火温度太高按每次度逐步减低退火温度。i)PCR退火温度太低按每次度逐步升高退火温度。j)没有检测信号检查在程序中包含有荧光信号采集k)错误的信号采集步骤确定荧光信号采集的步骤是在PCR循环的延伸步骤。l)实时PCR引物降解用聚丙烯酰胺凝胶电泳检查怀疑的降解的引物m)错误的染料过滤器确保合适的过滤器被激活n)起始模板不足增加模板cDNA的量。CT值比例模板量的log值交点线性关系不好a)模板量太高不要超过最大的模板cDNA使用量。细节请见操作步骤。b)模板量太低增加模板RNA的使用量“NoTemplate”control荧光信号值太高a)试剂有污染抛弃污染的反应试剂用新的试剂重做b)反应试剂配制中污染采取合适的安全措施(如:带过滤嘴的枪头)荧光强度不稳地a)实时循环器污染清洁仪器仪不准确b)PCR校正PCR仪“NoRT”control出现信号值RNA样品中含有DNA确定RNA样品中没有基因组DNA。(如:miRNeasyKits进行柱上DNase消化)

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