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实验十 血液转氨酶(谷丙转氨酶)活力的测定.doc实验十 血液转氨酶(谷丙转氨酶)活力的测定.doc 实验十、血液转氨酶(谷丙转氨酶)活力的测定 (实验:肝脏谷丙转氨酶活力测定) (本实验分2个实验完成:一、制作标准曲线 二、测酶活力和总结。或就做二就可以) 【目的和要求】 1、 了解转氨酶在代谢过程中的重要作用及其在临床诊断中的意义, 2、 学习转氨酶活力测定的原理和方法。 3、 熟悉分光光度计的使用。 【原理】 生物体内广泛存在的氨基移换酶也称转氨酶,能催化α-氨基酸的α-氨基与α-酮基酸的α-酮基互换,在氨基酸的合成和分解、尿素和嘌呤的合成等...

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实验十 血液转氨酶(谷丙转氨酶)活力的测定.doc 实验十、血液转氨酶(谷丙转氨酶)活力的测定 (实验:肝脏谷丙转氨酶活力测定) (本实验分2个实验完成:一、制作 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 曲线 二、测酶活力和 总结 初级经济法重点总结下载党员个人总结TXt高中句型全总结.doc高中句型全总结.doc理论力学知识点总结pdf 。或就做二就可以) 【目的和要求】 1、 了解转氨酶在代谢过程中的重要作用及其在临床诊断中的意义, 2、 学习转氨酶活力测定的原理和方法。 3、 熟悉分光光度计的使用。 【原理】 生物体内广泛存在的氨基移换酶也称转氨酶,能催化α-氨基酸的α-氨基与α-酮基酸的α-酮基互换,在氨基酸的合成和分解、尿素和嘌呤的合成等中间代谢过程中有重要作用。转氨酶的最适pH接近7.4,它的种类甚多,其中以谷氨酸-草酰乙酸转氨酶(简称谷草转氨酶)和谷氨酸-丙酮酸转氨酶(简称谷丙转氨酶)的活力最强。它们催化的反应如下。 正常人血清中只含有少量转氨酶。当发生肝炎,心肌梗死等病患时,血清中转氨酶活力常显著增加,所以在临床诊断上转氨酶活力的测定有重要意义。 测定转氨酶活力的方法很多,本实验采用分光光度法。谷丙转氨酶作用于丙氨酸α-酮戊二酸后,生成的丙酮酸与2,4-二硝基苯肼作用生成丙酮酸2,4-二硝基苯腙。 丙酮酸2,4-二硝基苯腙加碱处理后呈棕色,其吸收光谱的峰为439—530nm,因此在波长520nm处吸光度度增加的程度与反应体系中丙酮酸与α-酮戊二酸的摩尔比基本呈线性关系,故可藉可用分光光度法测定。从丙酮酸2,4-二硝基苯腙的生成量,可计算酶的活力。 【试剂和器材】 一、试剂 1.试管及试管架 2.吸管 3.恒温水浴 4.分光光度计 5、移液管 6、电子天平 7、研钵 8、容量瓶 9、冰箱 二、器材 1、标准丙酮酸溶液[标准丙酮酸(500μg/ml)]:准确称取纯化的丙酮酸钠62.5mg,溶于pH7.4 0.1M 的PBS中,定容到100ml。现用现配。 2、谷丙转氨酶底物:0.90g L-丙氨酸,29.2mg α-酮戊二酸,先溶于pH7.4 0.1M 的PBS中。然后用1 M NaOH调节pH到7.4,再用pH7.4 0.1mol/L的PBS定容到100ml,贮存于冰箱中,可使用1周。 3、0.1mol/L pH7.4 PBS:称取13.97g KHPO和2.69g KHPO溶于蒸馏水中,定容到1000ml。 2424 4、0.02% 2.4-二硝基苯肼溶液:称取20mg 2.4-二硝基苯肼溶于少量的1mol/L HCl中。把锥形瓶放在暗处并不时摇动(或加热溶解),待2,4-二硝基苯肼全部溶解后,用1mol/L HCl定容到100ml。滤入棕色玻璃瓶内置 [冰箱内保存]。 5、0.4mol/L NaOH :称取16g NaOH定容到1000ml。 6、0.9%生理盐水:称取0.9gNaCl,定容 到100ml。 【操作方法】 一、标准曲线的给制:取6支试管,分别标上 0,1,2,3,4,5六个号。按下 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 所列的次序 添加各试剂。 2,4-硝基苯肼可与有酮基的化合物作用 形成苯腙。底物中的α-酮戊二酸与2,4- 二硝基苯肼反应,生成α-酮戊二酸苯腙。 因此,在制作标准曲线时,须加入一定量的 底物,(内含α-酮戊二酸)以抵消由α-酮 戊二酸产生的消光影响。 先将试管置于37?恒温水浴中保温 10min以平衡内外温度。向各管内加入 0.5ml2,4-二硝基苯肼溶液后再保温20min, 最后,分别向各管内加入0.4mol/L氢氧化 钠溶液5ml。在室温下静置30min,以0号管作空白,测定520nm的光吸收值。用丙酮酸的微摩尔数为横坐标,光吸收值为纵坐标,画出标准曲线。(总图如下) 二、谷丙转氨酶活力的测定(学生只做这个) 1、样品的制备(集体制备) 将鸡处死,取肝脏后用生理盐水冲洗,滤纸吸干后,称取0.5g 肝脏,剪成小块,加入预冷(冰水或冰箱中)的pH7.4的PBS 4.5ml,在冰水浴中制成10%的匀浆, 4000rpm冷冻离心10分钟后保存在冰水中备用。(一组按10ml算:10ml*N) 2、酶活力的测定: 取6支试管,按下表操作: 测定管(A) 标准管(S) 对照管(B) 空白管 谷丙转氨酶底物(ml) 0.5 0.5 37?水浴5min 肝匀浆(或血清)(ml) 0.1 丙酮酸0.1ml 0.1 水0.1ml 混匀后,37?水浴准确保温30min 2,4-二硝基苯肼(ml) 0.5 0.5 0.5 0.5 谷丙转氨酶底物(ml) 0.5 0.5 混匀后,37?水浴准确保温20min NaOH(ml) 5.0 5.0 5.0 5.0 混匀后,静置10min A 520 3、计算:每毫升肝脏匀浆谷丙转氨酶活力单位: D=(A-B) ×500/S×2.5=(A-B) ×200/S D:每毫升肝脏匀浆谷丙转氨酶活力单位(U/ml) 式中 A:样品管吸光度值 B:对照管吸光度值 S:标准管吸光度值 500:标准丙酮酸溶液 2.5浓度谷丙转氨酶的换算单位系数 【注意事项】 1. 在测定SGPT时,应事先将底物、血清在37?水浴中保温,然后在血清管中加入底物,准确记时。 2. 标准曲线上数值在20~500U是准确可靠的,超过500U时,需将样品稀释。 3. 转氨酶只能作用于α,L,氨基酸,对D,氨基酸无作用。实验室多用α,DL,氨基酸(较L,氨基酸价廉),若用L,氨基酸,则用量减半。 4. 溶血标本不宜使用,因血细胞中转氨酶活力较高,会影响测定效果。 5. 血清样品的测定需在显色后30分钟内完成。 6( 酶在37?下与底物作用30min后,以能产生2.5μg的丙酮酸为一个活力单位。 7( α-酮戊二酸也能产生苯腙,但在520nm下远较丙酮酸的低。 8( α-酮戊二酸和2,4-二硝基苯肼对显色有一定干扰,注意添加量 琼州学院实验项目卡 生命科学 系 生化 实验室 开设日期____年___月___日 血液转氨酶(谷丙转氨酶)课程性1、必修 实验项目 面向专业 质 2、选修 活力的测定 1、还未开设的新实验 本实验学实验分实验类型 2、手段更新的实验 4 时数 组概况 3、已开设过的实验 名 称 型号规格 数量 名 称 型号规格 数量 试管及试管架 若干 冰箱 1 所用主要仪器 移液管 各规格 若干 恒温水浴箱 1 分光光度计 6 名 称 纯度级别 数量 名 称 纯度级别 数量 0.1mol/L磷酸磷酸氢二钾 氯化钠 0.9% 500ml 30ml*N 缓冲液pH7.4 磷酸二氢钾 2,4-二硝基苯肼 0.02% 20ml*N 2.0μmol/ml 丙酮酸钠 盐酸 1mol/L 200ml 25ml*N 所用主要药品 α-酮戊二酸 谷丙转氨酶 20ml*N 底物 DL-丙氨酸 1 mol/L 30ml*N 氢氧化钠 0.4 mol/L 40ml*N 血清或肝脏(兔子、当节课提取) 其他 实验情况 记录 混凝土 养护记录下载土方回填监理旁站记录免费下载集备记录下载集备记录下载集备记录下载 实验教师签名______________________ 实验员(管理员)签名______________
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分类:生活休闲
上传时间:2017-12-05
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