细菌基因组DNA提取
方法
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细菌基因组DNA提取方法
1、取1.5mL菌液于2mL 离心管，12000rpm离心5min，弃上清;
2、加入600ul 1xTE 重悬菌体沉淀，4? 12000rpm离心5min，弃上清;
3、加入450ul 1xTE和50ul 10mg/mL 溶菌酶和10ul 100mg/mL 蜗牛酶，吹吸混匀，37?孵育1h(或4?过夜)，每隔15min颠倒混匀一次;
4、加入600ul TENS裂解液，和与沉淀等体积的玻璃珠，吹吸混匀，涡旋震荡10min后，再加入30ul 20mg/mL 蛋白酶K，吹吸混匀，55?孵育1h，每隔15min颠倒混匀一次;
5、4? 12000rpm离心10min，转移上清至另一个干净的1.5mL 离心管;
6、加入等体积的酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，充分混匀，-20?静置2min，4? 12000rpm离心5min;
7、转移上清至另一个干净的1.5mL 离心管，加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1)，充分混匀，-20?静置2min，4? 12000rpm离心5min;
8、转移上清至另一个干净的1.5mL 离心管，加入1/10 体积的3M 醋酸钠，2倍体积(加入醋酸钠后的终体积)预冷的无水乙醇，充分混匀，-20?沉淀2h。(或加入0.6-0.8倍体积的异丙醇，-20?沉淀2h)，4? 12000rpm离心10min，弃上清;
注:如需得到纯度更高的样品，可先用异丙醇沉淀，无菌水充分溶解后，离心取上清，再用醋酸钠+无水乙醇沉淀一次。
9、加入600ul 预冷的70%乙醇洗涤DNA沉淀，颠倒混匀，4? 12000rpm离心5min，弃上清;重复洗涤一次。
10、吸干离心管中的残留液体，待离心管风干后，加入30ul 无菌水和0.5ul 10mg/mL 的RNase A，吹吸混匀，取3ul电泳
检测
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，剩余置于-20?保存。
附:
一、所需仪器
恒温水浴锅、高压灭菌锅、高速冷冻离心机、超净工作台、通风橱、电子天平、称量纸、药匙、各种规格移液器及吸头、剪刀、1.5mL离心管、2mL离心管、15mL离心管、50mL离心管、涡旋震荡仪、掌上离心机、4?及-20?冰箱、微波炉、电泳仪、凝胶成像仪、Nanodrop微量分光光度计、烧杯、三角瓶、量筒、玻璃棒、封口膜、橡皮筋。
二、所需试剂
75%酒精、Tris、浓盐酸、EDTA、溶菌酶、蜗牛酶、蛋白酶K、NaCl、SDS(十二烷基磺酸钠)、Triton X-100、NaAc(醋酸钠)、冰乙酸、无水乙醇、无菌水(或超纯水)、Tris饱和酚、氯仿(三氯甲烷)、异戊醇、异丙醇、玻璃珠(直径1-2mm)、琼脂糖凝胶、RNaseA
10×TE(pH 8.0)
100 mM Tris-Cl，pH 8.0
10 mM EDTA，pH 8.0
高压灭菌，室温保存，使用时超纯水稀释至1×浓度。
1M Tris-HCl(pH 8.0)
160 mL HO，24.22g Tris碱，加入浓HCl 8.4 mL后冷却至室温，调pH 8.0，定容至200 mL。2
高压灭菌，室温保存。
0.5 M EDTA(pH 8.0)
160 mL HO，EDTA-Na-2HO(37.22g)，磁力搅拌，用NaOH(约4g)调pH8.0，定容至200mL。22
高压灭菌，室温保存。
TENS裂解液 终浓度 母液浓度 体积
Tris-Cl 100 mM(pH 8.0) 1M 20mL 四种溶液混合后，再加入1mL EDTA 50 mM 0.5M 20mL Triton X-100，超纯水定容至NaCl 200 mM 5M 8mL 200mL。 SDS 2.0 %(w/v) 10% 40mL Triton X-100 0.5%(v/v)
高压灭菌，室温保存。
蛋白酶K(20 mg/mL)——工作浓度:1-2mg/mL
用50 mM Tris-Cl(pH 8.0)，1.5 Mm Ca(Ac)溶解蛋白酶K粉末，配制成20 mg/mL的贮存2
液，过滤除菌，分装，-20?保存。
溶菌酶(10 mg/mL)——工作浓度: 1mg/mL
用10 mM Tris-Cl(pH 8.0)溶解溶菌酶粉末，配制成10 mg/mL的贮存液，过滤除菌，分装，-20?保存。
蜗牛酶(100 mg/mL)——工作浓度:1mg/mL
用10 mM Tris-Cl(pH 8.0)溶解蜗牛酶，配制成100mg/mL的贮存液，过滤除菌，分装，-20?保存。
RNase A(10 mg/mL)——工作浓度: 0.1mg/mL
将RNase A溶解在10 mM NaAc(pH 5.2)中，使终浓度为10 mg/mL，100?加热15 min，室温下缓慢冷却，用0.1倍体积的1M Tris-Cl调整pH至7.4后，过滤除菌，分装，-20?保存。
TAE电泳母液(50×)
Tris 242g
冰乙酸 57.1 ml
EDTA 37.2g
ddHO 定容至 1L 2
浙公网安备 33021202002483