灵芝多糖的研究综述

灵芝多糖的研究综述 摘 要：灵芝多糖是灵芝的主要活性成分，近年来以其独特的保健功能成为研究的热点。灵芝多糖结构如分子量、单糖组成和糖苷键类型等，对其活性影响很大，本文列举了灵芝多糖结构通用的检测方法。已有实验证实，灵芝多糖的生物保健功能主要体现在降血糖、降血脂、抗肿瘤、提高免疫力和抗氧化方面，由于固态栽培灵芝有诸多因素的制约，液体发酵培养成为获取灵芝多糖的主要手段，而液态发酵条件的优化研究主要集中于菌种的筛选、碳源氮源的选择及微量元素的添加、发酵调控、发酵液预处理、灵芝多糖的提取和纯化以及灵芝多糖的医疗保健作用。传统提取灵芝多糖的方法如热水浸提法、碱提取法，有提取时间长、提取效率不高的缺点，而利用超声波辅助提取多糖受到人们的关注，并和传统提取方法做了比较，显示了这种方法的广阔应用前景。 关键词：灵芝多糖；发酵；提取；保健功能 前言 灵芝是担子菌门担子菌纲多孔菌科灵芝属药用真菌，古代就认为其有扶正固本、滋补强壮的功效，对其药性十分推崇。现代科学检测 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明，灵芝在免疫系统的调节、通过增强宿主免疫调节功能达到抗肿瘤作用[1]、抗病毒作用、通过提高氧化酶活性而清除体内自由基达到抗衰老的作用[2]、降血脂等方面有着极其重要的医学作用。随着近年来对灵芝研究的不断深入，发现灵芝多糖是灵芝的主要活性物质之一，其重要性不言而喻。本文综述了近年来国内外对灵芝多糖的主要研究进展。 1 灵芝多糖的结构分析 如同其他的生物活性大分子，灵芝多糖的生物活性依赖于化学结构，因此，要研究灵芝多糖生物活性的机理，不可避免的要研究其化学结构。对灵芝多糖的化学结构的研究，主要集中于其单糖的组成、多糖分子量范围、单糖连接方式等方面。近年来，随着研究的不断深入，对灵芝多糖的化学结构已经有了一定的了解。虽然灵芝多糖化学结构由于灵芝种类的不同而有所差异，但其化学结构的某些方面是固定不变的。如，其单糖组成普遍 D-葡萄糖、D-果糖糖、D-半乳糖、D-甘露糖、D-木糖、L-岩藻糖、L-鼠李糖、L-阿拉伯糖，差异主要体现在组成的种类和比例的不同。罗立新等[3]通过研究确定，在灵芝的菌丝体和子实体中得到的多糖，其单糖的组成不同，而且单糖的组成比例也不同。菌丝体多糖单糖是 D-2 葡萄糖、D-2 半乳糖、D-2 甘露糖、D-2 木糖、L-2 岩藻糖、L-2 鼠李糖，而子实体多糖却是由 D-2 葡萄糖、D-2 半乳糖、D-2 甘露糖、D-2 木糖、L-2 阿拉伯糖、L-2 鼠李糖组成。而在 Ye 等[4]的研究中，一种水溶性多糖的单糖组成仅由D-葡萄糖、D-半乳糖和L-果糖组成。单糖之间的连接方式，主链以β-(1→3)、β-(1→4)糖苷键连接，支链以β-(1→6)糖苷键连接。多糖分子量随着多糖种类的不同，有很大差异，但一般都以104D为数量级。 2 高产灵芝多糖的菌种筛选 利用微生物发酵法生产更好的发酵产品,首先要有一个良好的菌种。要达到我们所需要的代谢产物主要就是进行菌种选育和控制培养条件。菌种选育有自然选育、诱变育种、杂交育种、分子育种等方法以改良菌种的特性,使其符合工业生产的要求。现在以诱变育种为主,利用60Co-r射线和紫外线交替累积诱变所得CjL990菌株[5],王振福等[6]通过卫星搭载实现空间诱变获得卫星灵芝2号。通过不段的实验证明赤芝G2[7]、灵芝0770[8]、GA-6[9]、GL020[10]等菌株适宜深层培养,弥补了人工栽培的缺点,目前对灵芝进行深层发酵筛选优良菌株的研究主要随机筛选(摇瓶筛选法)和理性化筛选这两种方法。因此筛选出供发酵培养的灵芝菌株的应用基础研究显得十分重要。 3培养基的优化 培养基组成是灵芝发酵控制过程中最基本的因素,对灵芝生物量乃至最终代谢产物的产生可起决定性的作用。培养基中包括碳源、氮源、无机盐和维生素等营养物质,常见的碳源有葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、淀粉、玉米粉等。一般认为单糖(如葡萄糖),可直接被灵芝菌丝体吸收,对菌丝体生长和多糖生成最为有利。常见的氮源有硫酸按、氯化按、硝酸钱、酵母膏、蛋白胨、豆饼粉、鼓皮等。有机氮源比无机氮源更能促进灵芝菌丝体的生长,因而灵芝发酵大都采用有机氮源。卫军等[11]发现灵芝液体发酵的最适碳、氮源分别为葡萄糖和蛋白胨。曾晓希等[12]认为灵芝发酵的最佳碳源、氮源和生长因子分别是葡萄糖、酵母膏和维生素B1。而Fang等[13]认为使用酵母膏或蛋白陈作为单一的氮源时,菌丝都不能生长良好,菌丝生长和代谢产物积累的最佳氮源是0.5%酵母膏和0.5%蛋白胨组成的复合氮源。碳源的影响不仅在于其成分不同,碳源浓度对灵芝发酵也有影响。Hsieh等[14]报道,当葡萄糖浓度从60g/L降低至20g/L,灵芝多糖的浓度也从1.79g/L降至0.91g/L,提示充分的碳源供应是保证菌丝体中多糖含量的关键。罗建成等[15]报道, 在一定范围内,灵芝的生物量和胞外多糖积累随葡萄糖含量升高而增大,然而当葡萄糖含量超过5%时,灵芝菌丝体的生长反而受到抑制。碳氮比(C/N)对微生物的生长和产物形成常有很大的影响,碳氮比不当会妨碍菌丝按比例吸收营养物。Babitskaya等[16]研究发现,灵芝发酵过程的C/N比值在18:1-25:1之间时,对多糖的形成最为有利。孙东平等[l7]用正交法研究了不同条件对灵芝菌生长影响,从中选出了灵芝菌液体深层发酵的优化培养基:葡萄糖3.6%,蛋白胨0.4%,酵母膏0.2%,KHZPO 0.1%,MgSO4·7H2O 0.05%, VitB1 0.005%,PH 6.0。 有人曾研究过中药提取液对灵芝深层发酵的影响。杨海龙等[18]研究了以惹该仁为基质的灵芝液体发酵,发现惹该仁油可促进灵芝的生长及胞外多糖的积累,其最适加入量为1.5%-2.0%。刘媛等[19]研究了10种中药对灵芝液体发酵的影响,结果证明金银花、淡豆豉、淡竹叶、连翘和甘草的添加对灵芝菌的生长及发酵液中灵芝酸的产生均有一定促进作用;薄荷、芦根对灵芝菌生长有促进作用,但不能促进发酵液中灵芝酸的产生。 4发酵工艺条件的控制 确定优良的灵芝菌种和适宜的培养基之后,还需要有最佳的发酵条件,灵芝才能快速生长并积累目标代谢产物。发酵过程中主要控制的参数有培养温度、pH条件、接种量、溶氧及发酵罐搅拌速度等等。 一般培养灵芝的适宜pH范围为5.0-6.5,但针对不同产物生产的最适初始pH并不相同。凌庆枝等[20]研究表明,菌丝体生长、胞内外灵芝酸及胞外多糖分泌与pH值紧密相关,菌丝体生长及胞内灵芝酸生成的最适pH值为5.5,胞外灵芝酸产生最适pH值为4.5,胞外多糖形成最适pH值为4.6。Fang等[21]研究了灵芝菌液体发酵的初始pH与灵芝菌生物量及其生物活性物质产量间的关系,发现在初始pH为6.5时,菌丝体产量和灵芝酸最高;而随着初始pH的下降,灵芝多糖产量上升。 灵芝发酵的生长温度范围较广,在22-35℃内都可以生长,但最适温度因不同情况而有所不同。Yang等[22]研究了环境参数对灵芝生长及多糖形成的影响,得到灵芝发酵的最佳温度和pH值分别在30℃-35℃和4.0-4.5的范围内。Chang 等[23]研究了灵芝摇瓶发酵的培养条件,得到最佳培养温度和初始pH值分别是34℃和6.5。 接种量对灵芝菌丝的生长有较大影响,一般认为接种量过低时,菌丝生长速度慢,会延长发酵周期;而接种量过高则菌丝老化快,不利于有效物质的积累。方庆华等[24,25]研究发现,接种量对最终菌丝干重影响不大,但是对产物积累量影响较大;当接种量在70-670mg/L之间时,随着接种量增加,菌丝球直径下降,灵芝多糖产量上升,而当接种量减少,菌丝球直径增大,灵芝酸产量上升。灵芝发酵过程中溶氧的控制也是很重要的参数,种子摇瓶培养时的振荡频率、大罐发酵时的通气量与搅拌速度和溶氧关系密切。贺新生等[26]研究了树舌灵芝摇瓶培养的发酵工艺,发现菌丝生长的最适转速为15or/min。Tang等[27]研究得知,当溶氧浓度(DOT)只占发酵液饱和空气的10%时.菌丝体生长受到抑制,与DOT为25%时相比,胞外多糖产量以及菌丝体中胞内多糖和灵芝酸含量都较高。然而高溶氧浓度条件下,灵芝胞内多糖和灵芝酸的总产量要更高。 5发酵液预处理 5.1菌丝体胞外多糖的粗提 灵芝发酵液中的多糖有两种:一是存在于灵芝发酵液中的胞外多糖;一是存在于菌丝体中的胞内多糖。对于不同的多糖应采取不同的分离方法,对于同一种多糖也应选取合适的分离纯化方法。将灵芝发酵液进行离心分离[28],上清液在90℃条件下浓缩,再将浓缩液置于透析袋中,流水透析直到透析液中无还原糖为止,加人95%的乙醇,在5-10℃下静置12h以上,沉淀粗多糖,沉淀物用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤后,真空抽干,然后置于P2O5干燥器中进一步干燥得到细胞外多糖干品,其工艺流程如下:         离心、浓缩、透析                离心            乙醇沉淀 发酵液                        透析液              上清液                                 丙酮、乙醚洗涤    沉淀物                P2O5 干燥                      胞外多糖 5.2菌丝体胞内多糖的粗提 将离心分离得到的菌丝体在60℃下干燥,粉碎,再按下面方法分为水溶性、冷碱提水溶、热水提水溶三个部分提取。 (l)水溶性多糖的提取[29]:菌丝体经过干燥,粉碎后,在80-90℃水浴中水煮抽提2次,每次lh,浓缩后,取上清液透析,加人3倍体积的95%乙醇沉淀,干燥得部分多糖。 (2)冷碱提水溶性多糖的提取:提取水溶性多糖后的残渣,再用不同浓度的碱,在25℃常温下提取两次,每次1h,用95%乙醇沉淀,从而得到部分多糖。 (3)热碱提水溶性多糖的提取:将冷碱提取后的残渣,再用不同浓度的碱在65℃下提取两次,每次lh,然后用95%乙醇沉淀。 上述三部分多糖之和为胞内多糖的总量。 其工程流程如下[30]: 5.3粗多糖的纯化[31] 将粗多糖的样品溶于热水,按Sevag法用丁醇:氯仿为l:4混合摇匀,脱去蛋白质,反复操作多次,直至丁醇氯仿层不浑浊为止。菌丝体和发酵液多糖脱蛋白质比较容易,不需要蛋白质处理,直接用Sevag法就可以基本上除去杂蛋白,除去杂蛋白的粗多糖,称取一定量,溶于0.lmol/l NaCI中,加人DEAE-SephadexA一25层析柱内,层析柱先用0.lmol/1NaCI平衡,上样后先用0.lmol/lNaCl洗至无糖检出为止,然后采用梯度法洗脱,分步收集,流速为.70ml/1min,用苯酚一硫酸法跟踪检测,合并含糖部分,透析除去氯化钠,浓缩至最小体积,加人3倍体积乙醇,经无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤,真空干燥,得到灰白色粉末[32],为比较纯的多糖。 6 灵芝多糖的医疗保健作用及其作用机理 6.1降血糖 随着人们生活水平的提高，人口老龄化以及肥胖发生率的增加，糖尿病的发病率呈逐年上升趋势。糖尿病在中国的发病率达到 2%，据统计，中国已确诊的糖尿病患者达 4000 万，并且呈逐年上升趋势。糖尿病在临床上主要以高血糖为标志，如何降低人们的血糖，预防人们患糖尿病成为关键。近年来随着灵芝的保健作用得到重视，其中多糖作为主要的活性物质，其降低血糖的效果显著。 黄智璇等[33]研究发现，灵芝多糖对降低血糖有很好的效果。由四氧嘧啶致高血糖小鼠，在高剂量(400mg/kg)灵芝多糖条件下，小鼠血糖浓度为13.53mmol/L，而对照组小鼠血糖浓度为14.68mmol/L，血糖降低7.83%；由去甲肾上腺素致高血糖小鼠，高剂量(400mg/kg)灵芝多糖条件下，小鼠血糖浓度为6.9mmol/L，而对照组小鼠血糖浓度为 8.71mmol/L，血糖降低20.8%。赵晶等[34]除了研究了灵芝多糖对降血糖的作用外，还研究了不同剂量的灵芝多糖随时间对降血糖的作用，发现在200mg/kg以下，血糖随时间的变化很小，但高于 200mg/kg 后，降低血糖效果随时间变化十分明显。 6.2降血脂 高血脂症，指血液中一种或几种脂肪成分的增加，如胆固醇、脂蛋白、甘油三酯等，是造成动脉硬化症和心脏病发生的一个重要危险因子。研究显示，灵芝多糖对降血脂有很好的效果。吴锋等[35]在研究灵芝多糖对血脂的作用时，发现使用灵芝多糖的小鼠的血脂中的胆固醇(TG)和甘油三酯(TC)都有明显降低，而对于脂蛋白，其中高密度脂蛋白(HDL)没有明显的效果，而低密度脂蛋白(LDL)和脂蛋白(LPa)有非常明显的降低。陈伟强等[36]发现，在大鼠血清中TG 和 TC 的含量，随灵芝多糖剂量的增加而降低，在灵芝多糖剂量在400mg/kg条件下，TC降低47%、TG降低46.87%。 6.3抗肿瘤 实验表明，灵芝多糖可以在一定程度上抑制肿瘤的活性，但灵芝多糖对肿瘤细胞的抗癌构效关系和抗癌机制仍不明了。曹琦珍等[37]的研究表明，灵芝多糖对人肺癌PG 细胞增殖无直接抑制作用，但是对PG 细胞的运动性和黏附性有明显的抑制，对金属蛋白酶 MMP-9，不但抑制其活性，并且对 MMP-9mRNA 的表达也有不同程度的抑制。同样，在李颖博等[38]的研究中，证实了灵芝多糖对人前列腺癌细胞(PC-3M)并没有毒害作用，对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的增殖也没有作用，但是对这两种细胞的运动性和黏附性有明显的抑制。因此，有种对灵芝多糖的抗肿瘤机理的说法是，通过抑制肿瘤细胞的运动和黏附特性达到的。 林华型[39]在总结了多人的结论后，认为灵芝多糖并不能直接抑制或杀死肿瘤细胞，也不能诱导肿瘤细胞凋亡，其抑制肿瘤细胞的作用是通过通过介导加强宿主免疫功能而激活机体内各种免疫应答而实现的。而李建军等[40]的研究支持了林华型的结论，灵芝多糖会使在体肿瘤细胞 DNA 和 RNA的比值下降，由此达到抑制肿瘤细胞的效果，但是离体肿瘤细胞却没有这种效果，因此说明灵芝多糖主要通过免疫介导对肿瘤细胞产生毒性作用。 6.4 免疫调节 人体免疫系统，可以抵御外来细菌、病毒和其他有害物质的侵袭，还能清除体内衰老、突变、恶化或死亡的细胞。灵芝多糖主要是通过对淋巴细胞、巨噬细胞、网状内皮系统等免疫细胞的作用来调节机体的免疫功能，其增强免疫应答机制之一，就是通过对多种细胞因子进行诱生或促诱生作用。作为生物反应调节剂，它不仅能够激活 T、B 淋巴细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞(NK)等免疫细胞，还能活化补体，促进细胞因子的生成，全面发挥对机体的调节作用。研究表明，灵芝多糖还对淋巴细胞中的 NK 细胞有增强作用。TNF-α、L-2、L-10 等在免疫系统中占有重要地位。TNF-α在机体免疫防护方面有重要作用，还参与集体的免疫病理损伤；L-2 有促进淋巴细胞增殖、促进B 淋巴细胞分泌抗体、增强 T 细胞杀伤及增强 NK 细胞活性等作用。周桂琴等[41]的研究结果表明灵芝多糖可以抑制肿瘤生长，其机理可能是通过刺激淋巴细胞，影响了TNF-α、L-2、L-10 等因子的分泌，从而增强细胞及体液免疫，巨噬细胞的吞噬作用。任玮等[42]的研究也显示，灵芝多糖可提高小鼠的免疫功能，增强 NK 细胞数量的作用，通过对 L-2、L-4 和 IFN-γ的影响，调节免疫应答。冯鹏等[43]的研究结果表明，灵芝孢子多糖可以显著提高荷瘤小鼠的体液免疫功能和网状内皮系统的吞噬功能，并且对荷瘤小鼠的外周血的T 细胞亚群中的杀伤性 T细胞和辅助性 T细胞均有一定的激活作用，而且对荷瘤小鼠的 NK 细胞具有一定的激活作用。李丽等[44]在研究中发现，灵芝多糖可以增加小鼠血清中干扰素 IFN-γ的含量，对肿瘤生长也有抑制作用，在剂量的使用上，以中剂量(10mg/kg)的抑瘤率最好。 6.5 抗氧化 近年来，众多学者对人衰老的原因提出了很多学说，如免疫学说、遗传学说、自由基学说等，其中，自由基学说越来越引起人们的关注。Harman[45]提出衰老的自由基学说，自由基是在细胞代谢过程中不断产生的，具有强氧化性，在细胞内可以与多种生物大分子，如蛋白质、DNA、细胞膜中的不饱和脂肪酸等发生反应，从而导致多聚核蛋白解聚、抑制蛋白质的合成，而这些正是细胞衰老的特征。 最近的研究发现，灵芝多糖对细胞的抗氧化作用十分明显。游育红等[46]研究了灵芝多糖对 ECV304 氧化损伤的保护作用，结果显示灵芝多糖可以减少氧自由基对细胞器的损伤，对细胞凋亡、细胞坏死也有很好的抑制作用，使细胞存活率提高，证明了灵芝多糖保护细胞、抗氧化的作用。王宏勋等[47]研究了混合使用多糖对去除羟自由基的效果，发现复合使用多糖比仅使用一种多糖去除羟自由基效果要好，并且探索了不同比例的灵芝多糖和枸杞多糖对去除羟自由基的效果。胡太平等[48]首次证明了，在血管壁中产生O2-·的NHDPH 氧化酶酶系的活性受到灵芝多糖的抑制，而O2-·含量过高会导致多种高血压病症的发生。 7灵芝多糖的发展前景与展望[49] 在我国,在开发灵芝多糖产品的方面,产品科技含量偏低,大多数产品属粗提取物,还不符合中药现代制剂的要求;提取工艺不完善,使灵芝的一部分重要成分白白浪费。为充分开发、利用灵芝这一我国中药宝库的珍品,应以企业为主导,企业与科研院所、高校相结合,走产、研、学协作开发之路,进一步提高我国灵芝的科研水平,从而使之在国际市场上占有更大份额。另外,随着生物工程技术的发展,尤其是随着基因工程和体外扩增等先进技术的发展,进一步明确灵芝多糖结构与活性关系,以及对灵芝多糖的抗肿瘤机制的深入研究,新的抗肿瘤药品将会问世。 参考文献 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