生物防治-05昆虫原生动物及利用

生物防治-05昆虫原生动物及利用 昆虫病原线虫及其应用 昆虫病原线虫是线形动物门(Nemathelminthes)侧腺纲(Secernentia)小杆目(Rhabditida)。形态结构简单，种类繁多，分布很广。世界上已知有11个科的线虫能寄生昆虫，具有用于生物防治的潜力。目前的研究集中在下列5个科的线虫，即斯氏线虫科(Steinernematidae)、异小杆线虫科(Heterorhabditidae)、索线虫科(Mermithidae)、新垫刃线虫科(Neotylenchidae)和滑刃线虫科(Aphelenchidae)。斯氏线虫科和异小杆线虫科能迅速杀死害虫，被称为昆虫病原线虫。 我国对昆虫病原线虫的研究起始于20世纪80年代。中国农科院生物防治研究所。 一、 形态及类群 1.特征 身体细长，横切面呈圆形，不分节或仅体表具横皱纹;具原体腔，内充满体腔液，可运输营养，又因无孔道与外界相通，故内部保持一定压力，使虫体具一定形状;消化道由口、咽部、食道球、肠道组成，雌虫肛门单独开口，雄虫后肠与射精管相连形成泄殖腔开口体外;无循环系统，也无特殊的呼吸器官;神经系统包括一个围绕食道的神经环和几个神经索;大多为雌雄异体，卵生或卵胎生;感觉器官不发达，无变态发生。 2.昆虫病原线虫的类群 斯氏线虫科:体表光滑，头前端稍钝园，口缘有6个唇瓣，每个唇瓣上各有1个乳突排成内环;在唇乳突外侧有4个头乳突和2个头感器排成外环。食道球单个，瓣膜退化。神经环在食道球前端，排泄孔位于神经环之前。雌雄异体，两性生殖。雄虫尾部无交合伞。 本科有2属，即斯氏线虫属(Steinernema Travassos 1927 异名Neoaplectana)和新斯氏线虫属(Neosteinernama Khuong,1994)。 斯氏线虫属能够体现种间差异且有一定稳定性的形态特征是:?侵染期幼虫的长度。这是因为侵染期线虫在特定的发育阶段形成，那时寄主体内的营养已经耗尽，对侵染期线虫的体长不会产生影响，而成虫发育却在很大程度上受体内营养状况的影响。?雄虫生殖乳突数目、尾端是否有刺及交合刺形态。?虫体各部位比值如根据测量求出的E值(头端至排泄孔距离与尾长之比)。 至1991年,斯氏线虫属已知有16种，其中3种采自我国，并由中国学者订名。长尾斯氏线虫Steinernema longicaudum Shen et al., 1991),尖尾斯氏线虫S. caudatum Xu et al. 1991, 踞齿尾斯氏线虫S.serratum Liu, 1990)。此外在我国发现的种类还有小卷蛾线虫S. carpocapsae 和格氏线虫S. glaseri. 新斯氏线虫属:该属的形态特征与斯氏线虫属的成员比较，其雌体有明显的尾感器，弯曲的尾部大于肛门的体宽;雄体尾端指状，生殖乳突13-14对。目前只发现1种，Neosteinerema longicurvicauda Khuong,1994 异小杆线虫科:只有异小杆线虫属(Heterorhabditis Poinar,1976) 本科线虫的口缘有6个唇瓣，排泄孔位于神经环之后。雄虫有交合伞，并由9对乳突支撑。营雌雄同体和异体两种繁殖方式。与其形成共生关系的细菌有荧光。 异小杆线虫属，已知有6个种，其中短尾异小杆线虫(H. brevicaudis)在我国采到和订名。 二、生物学特性 斯氏线虫在适温(24-30)条件下，在大蜡螟幼虫体内可繁殖2-3代，从自然感染至再产生侵染期(3龄)幼虫的历期为5-7天。格氏线虫中国品系侵染期进入昆虫体腔后，很快脱去体鞘，成为体短而粗的4龄幼虫，进而发育为第一世代的雄虫和巨型母虫。经交配后，巨型母虫早期进行卵生，但一般卵产出时胚胎发育已至后期，有时尚可见到卵内的1龄幼虫，故所产的卵很快孵出幼虫;巨型母虫后期进行卵胎生，卵在母体内孵化，幼虫在母体内发育，以母体为食，至2-3龄时，母体已被吃成空壳，线虫幼虫便破壳而 1 出，继续在昆虫体腔内发育成第二代雌虫和雄虫。第二代雌虫比第一代的小，一般都进行卵胎生。线虫在大蜡螟幼虫体内经两个世代后，大量3龄带鞘的侵染期线虫及少量成虫由昆虫尸体内钻出，去寻找新的寄主。在室温28-32条件下，格氏线虫中国品系从入浸昆虫至从昆虫尸体钻出，约需96小时。 昆虫病原线虫对寄主的侵染受着温度的影响。在不适宜的温度条件下，线虫的活动能力收到抑制，直接影响它的搜索和进攻活动，同时也影响到线虫在寄主体内的发育和繁殖。实验证明，在34?下线虫Steinernema carpocapsae对东方粘虫完全失去致病力，31?和16?均不适其寄主，21-28?范围内其致病力大为增强，25-28?为最适温度。在28?时24小时就开始出现寄主死亡，而25?和21?时分别在36和48小时才出现死亡。据认为，温度对寄主死亡的影响，可能与线虫的共生细菌有关，由于温度直接影响它的增殖过程，从而决定了寄主的死亡速率。 关于线虫与寄主密度对感染的影响，夏北成1987指出，假如粘虫在一定时间内运动的距离是一定的，那么粘虫与线虫相互接触的结肠黑变病随着线虫密度的增加而增加，是一种线性关系。但这种机会的增加与感染率的关系则不一样，试验表明，感染率与接触机会之间呈一种指数变化关系，可选用下列指数方程来描述: 湿度:斯氏线虫侵染昆虫的成功与否，与湿度关系十分密切，它们必须在充分潮湿甚至具有水膜的条件下才能成功地感染寄主。若吸附线虫的基质没有形成能使其运动的水膜，即使空气湿度达到95%以上也不能感染寄主，所以目前研究湿度的影响就转化为具水膜的适宜湿度条件的维持时间，维持的时间越长，寄主被感染的机会也就越多。粘虫与线虫接触时间在4小时以下时，其感染率极低，当其达12小时时，感染率可达90%以上。 异小杆线虫引起的昆虫疾病与斯氏线虫相似。在自然环境中，特别是在土壤中，它们找寻和入浸昆虫的能力很强，可从口、肛门、气门等自然孔口进入昆虫体内，也可以通过身体的特殊构造突破昆虫的体壁直接进入昆虫体腔。这个构造就是其头部特有的附器(头钩)，能粘着和刺破昆虫表皮，有些种类还能通过特殊腺体分泌出具有溶解表皮几丁质的溶液，以帮助线虫从体壁主动入侵昆虫。 大蜡螟幼虫被异小杆线虫侵染后，一般在24小时内死亡，虫尸显示棕红色，黑暗中可见明显的荧光。对从山东苹果园土壤中分离得到的异小杆线虫泰山1号进行生活史观察，发现从侵染期入侵寄主到产生下一代侵染期需历力偶9天。侵染期线虫进入寄主后脱皮发育，很快进入4龄，进而全部发育成雌雄同体的巨型母虫。第二代幼虫发育为两性世代的雌虫和雄虫。从巨型母虫产出卵到两性世代雌虫产卵，称为卵生世代，历期约3天。在两性世代出现的同时，巨母虫停止向外产卵，产的卵都在体内发育，开始卵胎生世代。卵在母体内发育到2龄，便钻破母体而出，完成整个生活史。 三、昆虫病原线虫的致病机理 当线虫接触到寄主后，通过昆虫的口、肛门、气门或节间膜进入寄主，然后穿透肠壁或气管壁进入血腔。昆虫病原线虫的消化道内有细菌囊，此囊内有与之共生的嗜线虫致病杆菌。细菌是使昆虫致死的根本原因。线虫进入寄主几小时后，3龄的侵染期线虫脱掉所带鞘，将共生细菌释放到寄主血腔中，杆菌在昆虫体内繁殖，同时产生毒素，使寄主血液中毒而死亡。由于共生菌的作用，此类线虫一般在48—72小时内导致寄主死亡。由于斯氏科与异小杆科线虫繁殖倍数高，因此此类线虫易于在短时间内获得大量个体。 线虫与共生菌的关系:细菌的繁殖是线虫生存繁殖的必要条件，若无细菌与其共生，线虫发育则很慢， 2 生殖力下降、逐渐退化。细菌必须在线虫的携带下，进入昆虫体内。 共生菌:斯氏线虫的共生菌能把一系列物质转变为适于线虫生长繁殖的培养基。Akhust(1980)发现斯氏线虫和异小杆线虫的共生菌存在两种型，即初生型和次生型。初生型产生在侵染期幼虫内，当进入昆虫体腔时，其菌全部为初生型，或在开始的几天内，初生型占优势;其后在寄主的尸体里有时产生次生型菌，尤其是在人工培养基上都会产生次生菌。两种型在培养性状及染色反应方面有区别。在初生型菌存在时，线虫生长繁殖良好，如果次生型占优势，线虫的生长繁殖较差。但也有人认为，异小杆线虫在两种型的细菌中繁殖能力与线虫品系有关。这对于线虫的工业化生产意义重大。 4.寄主的专一性:昆虫病原线虫的寄主范围较为广泛，目前室内外测定仅小卷蛾线虫能寄生的昆虫有10目250种。尽管不像昆虫病毒对寄主那样专一， 但不同种的线虫对寄主仍有选择性。同一种线虫对不同种害虫可侵染力也表现很大的差异。这要求在应用线虫防治时害虫时，一定选择使用最佳的线虫种或品系。 四、 大量繁殖(斯氏科和异小杆科线虫的生产) 实验室用线虫繁殖:大蜡螟 昆虫病原线虫的大量繁殖，是关系到直接应用与害虫防治的重要问题，一向受到人们的重视。目前已有两种方法可大量生产昆虫病原线虫。一种是固相培养法，一种是液相培养法。 1.繁殖技术的发展 经历了多年的研究，至90年代，昆虫病原线虫已可在发酵罐中培养，或是通过固相法大量生产，成为一种生物杀虫剂进入了市场。比较成功的方法:1981年Bedding 用粉碎的泡沫塑料作载体，用鸡内脏为主要原料，先将共生菌液接入消毒后的培养基中，然后再接入线虫，获得了廉价的高产量线虫，70克培养基产出了小卷蛾线虫4千万条。此方法被广泛的采用，因为低耗能，尤其适应发展中国家，在固相培养法发展的同时，昆虫病原线虫的液体培养已进入发酵罐，每毫升培养液可产出线虫19万条。 2.繁殖技术 线虫的离体培养有4个基本条件:需在无菌条件下培养;线虫的培养基的原料必须含有蛋白质和一定量的油脂;在培养基中接入初生型的共生菌;保证培养过程中适量的通气。 线虫培养的技术发展到今天，用离体的方法培养线虫已不十分困难，但要培养出高产量又高毒力的线虫，则要求一定的技术水平。 3.剂型 由于昆虫病原线虫是一种活的生物杀虫剂，在选择制备线虫剂型的添加剂时，应考虑侵染期线虫的毒力应不受影响、存活期长、运输方便和易于喷施。 生产 流程 快递问题件怎么处理流程河南自建厂房流程下载关于规范招聘需求审批流程制作流程表下载邮件下载流程设计 如下:主要是在引进澳大利亚的技术的基础上不断完善起来的生产模式。 ? 共生菌试管原种的培养:从侵染期线虫中分离初生菌进行纯种培养，在12?下保存于营养琼脂 斜面试管中，每月转管1次。 ? 制备线虫试管种:把以上共生菌接到脂肪—鸡内脏海绵培养基斜面上进行培养，备用。把侵染 期线虫用自来水冲洗几次后在0.1%乙汞硫代水杨酸钠溶液里进行表面消毒，再用无菌水冲洗几 次。然后把这些线虫接入到脂肪—鸡内脏海绵为培养基的共生菌斜面上，在20-30?下培养。 ? 三角瓶培养:用500毫升三角瓶放入海绵培养基，每瓶脂肪—鸡内脏匀浆为70克，进行高压消 毒后，趁热将培养基振动，使之松散，以满足线虫移动和通气要求。 将初生型共生菌接到高压消毒过的营养肉汤里，在20-30?下振荡培养1-2天。然后把这菌液接 到上述三角瓶内，在25-28?下培养4天后才接线虫。线虫的接种量约为培养物的1/20.在20-28?条 件下，斯氏线虫培养约3周，异小杆线虫4-5周便可收作大盒生产的线虫种。 ? 大盒生产:大盒生产施用的金属盒为43X36X10cm，盛装上述海绵培养基2.5公斤，密封消毒后 先接入共生菌液培养2-3天，然后接入线虫种液，在20-28?条件下培养。斯氏线虫约3周， 3 异小杆线虫经4-5周便可收获。 ? 收获线虫:把培养好的线虫海绵倒进清洗池中的过滤框内(用60-100目左右的钢筛制成)，用 水浸泡，水量以淹没后不超过5厘米为宜。再用气泵通气冲洗2-3小时。通过这样清晰，95% 以上的线虫后相继离开海绵碎片。停止泵气后，线虫将逐渐沉至水的底层。移开过滤框，待积 水滴干后清除海绵渣。经倾注上清液和换清水数次，洗出的线虫经晾干后便可贮藏处理。 ? 线虫的贮存:可用海绵碎片吸附已清洗干净的线虫浓液，一般1亿线虫可用50克海绵碎片，用 食品袋包装，在4-8?贮藏室内冷藏半年以上。 五、 昆虫病原线虫的应用及注意问题 斯氏科和异小杆科的线虫都已用来大规模防治害虫，应用最广的是斯氏线虫的小卷蛾线虫，该线虫杀虫谱较广，易长期贮存，大量培养常量高，侵染期共生菌的携带率高。目前世界上，大规模应用昆虫病原线虫防治的主要害虫有:葡萄根象甲、蔗根象甲、日本丽金龟、香蕉蛀茎象甲、蝼蛄、小木蠹蛾和桃小食心虫等。因此目前还只用于防治土栖性害虫或钻蛀性害虫，还没有用于防治食叶类害虫的成功实例。国内用线虫防治行道树的小木蠹蛾获得成功。在美国、澳大利亚、英国、日本和欧洲研究较多。 1.防治对象:线虫大多适宜于防治生活于隐蔽场所的害虫:土栖性害虫和钻蛀性害虫。一是这两类害虫栖息地隐蔽，施用化学农药往往效果不佳，但线虫能主动运动寻找寄主;二是这两类害虫的生活环境适宜于线虫的运动和存活，由于线虫要借助于水膜运动寻找寄主，同时它本身的生理要求，在干燥环境中无法存活;三是线虫可在致死寄主尸体内繁殖，产生新一代侵染线虫，继续感染此生境中健康幼虫，因此能在相当长时间内控制害虫。 钻蛀性害虫:防治的难度。传统的防治是利用化学农药防治，如注入、注射、堵塞蛀口及人工刺杀等。基于以上情况，植保工作者一直在探讨其它防治方法，近年来进行了许多利用昆虫病原线虫防治钻蛀性害虫的试验。用斯氏线虫S. carpocapsae 5个品系对蛀杆的小木蠹蛾幼虫进行了防治试验，发现它们有很高的感染力，当剂量大于每条害虫施放25条线虫时，不同龄期的死亡率可达92%以上。小木蠹蛾是我国北方城市林荫树木如白蜡树、国槐和柳树的重要害虫，危害十分严重。该虫幼虫期长达23个月，不同龄期的幼虫重叠发生在同一虫道内，供试线虫又可在小木蠹蛾的尸体内繁殖和继续感染以后发生的害虫，所以，防治效果显著。胡新民等1991报道，天津市用于防治白蜡树虫害，1988-1989年达3万多株，小木蠹蛾危害率从7.30-12.09下降到4.51%。 多纹豹蠹蛾是木麻黄的蛀茎害虫，一树一虫，虫道简单，杨怀文等1990用S.feltiae进行防治试验，主要用吸附有线虫的泡沫塑料赛孔法处理，每孔道施用线虫1000条，林间大区防治效果达88.6-97.0%。此外还进行的下列害虫的防治试验:香蕉扁黑象甲、天牛等。 土栖性害虫:利用线虫在土壤中比较活跃的特点，大量开展对某个虫态生活于土中的害虫的防治试验，取得了防治桃小食心虫的良好效果。 桃小食心虫在我国北方主要危害苹果。成虫在果实表面产卵，卵孵化后蛀入果实危害。幼虫老熟后脱果落地入土越冬。1981-1983年，用小卷蛾线虫作感染试验，在室内试验及基础上，用线虫悬浮液喷洒果园表土，结果是当每公顷线虫施用量为15-30亿时，虫蛹被线虫寄生死亡率达90%以上。 其它害死:危害甘蔗的突背蔗金龟、危害韭菜的尖眼蕈蚊幼虫、黄曲条跳甲、大黑金龟甲和暗黑金龟甲等。如用线虫防治蛀干的小木蠹蛾，在40多天内出现2次死亡高峰，而注入敌敌畏液的对照，效果只有10天左右。这说明了昆虫病原线虫防治害虫的优越性。 前景:用线虫防治钻蛀性害虫前景好。 分析线虫在地下害虫防治中的困难:目前植物病原线虫的防治是一大难题，尤其是保护地栽培中，茬口单一、一年中作物的生长时间长(9月至次年6月)，植物病原线虫严重发生。农民只有通过过量施用杀线虫剂来解决这一问题，即使如此，仍不能控制线虫的危害。在这种情况下，通过昆虫病原线虫来防治地下害虫的难度很大。 4 2.施用时期的选择:在室内获得的线虫对某一害虫的毒力测定结果，不能说明田间的应用效果。其关键在于线虫施入后，能否与目标害虫相遇以及多长时间内有可能相遇。如用线虫防治桑天牛效果可达82%，而防治光肩星天牛的效果只有46%。其原因是桑天牛的虫道是从蛀入孔垂直往下而且无堵塞，而光肩星天牛的虫道是从蛀入孔往上，而且粪便木屑堵塞，增加了线虫与害虫接触的困难。对于土栖性害虫，线虫进入土壤的时间，应正好是害虫在表土层活动的时期，以利于线虫较快找到寄主。对大量的昆虫病原线虫生态研究表明，线虫施入田间土壤中，其种群密度下降速度是较快的。因此线虫施用的时间，应该选择在害虫出现的始中期，当然也要考虑目标害虫的经济阈值。 3.环境条件的影响:土壤湿度对线虫防治效果的影响最大，土壤湿度的保障对线虫侵染、存活都有很大影响。有条件时，采取浇地后施线虫，如没有灌溉条件时，可加大用水量，使线虫不至于在还未进入表土层中，就干死在土表面。土壤质地、温度对防治效果也有一定的影响。 昆虫原生动物及其利用(微孢子虫) 原生动物是许多单细胞真核生物的总称。分类地位:原生动物亚界，下分7 个门，其中5个门有昆虫病原原生动物，即 有毛根足虫门、真孢子虫门、微孢子虫门、奇嵌孢虫门、纤毛虫门。微孢子虫是比较重要的一类,有可能发展成微生物杀虫剂的大多数种类属于微孢子虫门。。 微孢子虫是原生动物中最重要的一类病原物。是细胞内寄生物，微孢子虫也感染家畜等有益动物，而且也有对人感染导致死亡的。 微孢子虫在光学显微镜下可以看到， 从自然感染的寄主中常常可以观察到孢子阶段，这也是微孢子虫发育历期中最长的阶段。对微孢子虫的描述，在很大程度上依赖于孢子的特性。 一( 感染特征 寄主在幼虫期，经口摄入孢子、孢囊或其它发育阶段。在自然情况下，原生动物感染是亚致死的，引起寄主慢性病。患病昆虫极少表现出明显的病症，大多数受感染的种类没有明显的外部症状，或仅仅表现出行动迟钝，食欲缺乏，生长发育不正常，成虫活动能力和生殖力下降，寿命缩短。寄主可能未发育成熟即死亡。原生动物在寄主体内大量繁殖生长发育，对寄主细胞造成机械损伤，消耗寄主营养可能是导致寄主死亡的重要原因。原生动物能否产生毒素还不清楚，有些种类能引起败血症导致寄主快速希望，这类原生动物有希望发展成短时间内控制害虫的制剂。原生动物是专性寄生物，生产困难，长时间保存有活性的可侵染的发育阶段也较困难。 一、孢子的形态结构 孢子大小通常为2-7微米，但固定后有很大程度的收缩。形状多种多样，以卵形和梨形为主，也有杆状和球状的。多数表面光滑，有些种类表面有脊状或线状突出物。孢子壁是很厚的保护层，含有几丁质。具有很强的抗逆性。微孢子虫的孢子有外翻机构，是微孢子虫特有的。 二、生活史及类型 微孢子虫通常以孢子为感染单位，通过不同途径传给新寄主。最常见的途径为经口，此外可经卵、经介体昆虫穿透表皮传播。微孢子虫在寄主体内有两种繁殖系统:裂殖生殖系统或营养繁殖，在这一个阶段中，寄生物的数量迅速增加，感染扩展到细胞、组织和器官中。这个阶段不易看见，只有经染色后才能观 5 察到。孢子形成系统或产生孢子时期。 三、微孢子虫的应用: 用原生动物防治害虫，仍处于研究阶段，用于生物防治的种类还不多，田间应用技术、方法及制剂等均需进一步探讨。 最早利用原生动物防治害虫是在1937年，有人用蝗虫变形虫感染蝗虫，然后收集含有变形虫孢囊的患病蝗虫的粪便，与麦麸等混合，撒在环境中，8周后，蝗虫被变形虫感染。 50年代，进行了微孢子虫防治草地毛虫和欧洲玉米螟的试验。 60年代，将原生动物作为微生物杀虫剂防治害虫较大规模的试验，用棉象甲微孢子虫防治美国南部棉象甲。 美国70-80年代，用蝗虫微孢子虫防治草原蝗虫，并于80年通过了美国环境保护局注册。这是第一个，也可能是目前仅有的商品化生产的原生动物杀虫剂，即蝗虫微孢子虫制剂，用于防治经济阈值较高的草原蝗虫。1987年，5.06万公顷;1988年，80.94万公顷。 北农大于85年从美国天敌工地引入蝗虫微孢子虫，并且在东亚飞蝗上接种成功。然后用东亚飞蝗大量繁殖，用于防治新疆、内蒙古草原蝗虫。田间结果是处理后4周，虫口校正减退率为47-53%。 在自然条件下，经常有微孢子虫流行病发生，玉米螟微孢子虫、云杉卷叶蛾微孢子虫病等。 6