抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)检测试剂盒(PNP比色法)
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抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)检测试剂盒(PNP微板法) 简介:
酸酸性磷酸酶(acid phosphatase,ACP)分布极广泛,遍布各种组织,主要存在于细胞的溶酶体内,所以常作为溶酶体标志酶。溶酶体外的酸性磷酸酶存在于内质网和胞质内,各种动物中的酸性磷酸酶各有不同,酸性磷酸酶的适宜pH为4.5~5.5。存在于正常人肺泡巨噬细胞和白血病人脾脏的抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate-resistnt acid phosphatase,TRAP)均在细胞滤泡中,并不是释放入血液,血液中的TRAP绝大多数来源于破骨细胞,因此可以通过测量血液中的TRAP了解破骨细胞的功能状态,几乎被认为是是机体破骨活性的唯一血液指标。TRAP一种糖基化的含金属蛋白酶,在破骨细胞(osteoclast)和破软骨细胞(chondroclast)中高
表
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达,在活化的巨噬细胞和神经元中也有表达。
Leagene抗酒石酸酸性磷酸酶检测试剂盒(Tartrate Resistnt Acid Phosphatase
Colorimetric Assay Kit)检测原理是利用Para-nitrophenyl phosphate(pNPP)为一种常用的磷酸酶显色底物,在酸性条件下,可在酸性磷酸酶的作用下生成p-nitrophenol。在碱性条件下p-nitrophenol呈黄色,产物黄色越深,说明酸性磷酸酶活性越高,反之则酶活性越低,通过分光光度比色法(酶标仪)测定吸光度,据此通过比色分析就可以计算出酸性磷酸酶活性水平。在适量的酒石酸存在的情况下进行酸性磷酸酶的活性检测,检测得到的酸性磷酸酶的活性就是抗酒石酸酸性磷酸酶的活性。该试剂盒可用于检测细胞或组织的裂解液或匀浆液、血浆、血清、尿液等样品中内源性的抗酒石酸酸性磷酸酯酶活性。该试剂盒仅用于科研领域,不宜用于临床诊断或其他用途。
组成:
编号 TE0043 Storage 名称 120T
试剂(A): ACP Assay buffer 15ml 4?
试剂(B): pNPP 2支 -20? 避光
试剂(C): Tartrate Solution 1ml 4?
试剂(D): p-nitrophenol(10mM) 0.1ml -20? 避光
使用说明书 1份
自备材料:
1、 96孔板
2、 水浴锅或恒温箱
3、 酶标仪
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操作步骤(仅供参考):
1、 配制检测工作液:
?配制显色工作液: 取出pNPP,恢复至室温后溶解于ACP Assay buffer,混匀,冰上预冷备用。新配制的显色工作液应在6h内用完。
?配制标准品工作液:取出-nitrophenol(10mM) 恢复至室温后,取溶解于ACP Assay p
buffer,使浓度达到。
2、 准备样品:
?血浆、血清和尿液样品:血浆、血清按照常规方法制备后可以直接用于本试剂盒的测定,尿液通常也可以直接用于测定,-20?冻存,用于抗酒石酸酸性磷酸酶的检测。 ?细胞或组织样品:取恰当细胞或组织裂解液,如果有必要可用PBS或生理盐水进行适当
6匀浆,一般细胞数量在10以上,组织应在100mg以上,离心取上清,-20?冻存,用于抗酒石酸酸性磷酸酶的检测。
?植物样品:取适量的植物组织加入少量生理盐水或PBS,充分捣碎或研磨,静置,用纱布或滤纸过滤,离心,留取上清液并测量体积,-20?冻存,用于抗酒石酸酸性磷酸酶的检测。
?高活性样品:如果样品中含有较高活性的抗酒石酸酸性磷酸酶,可以使用ACP Assay buffe、PBS或生理盐水稀释后再行检测。
3、 加样:按照下表设置96孔板空白对照、标准品、待测样品,溶液应按照顺序依次加入,
并注意避免产生气泡。标准品的用量分别为4、8、16、24、32、40μl,待测样品直接
加40μl。如果样品中的抗酒石酸酸性磷酸酯酶活性过高,可以减少样品用量或适当稀
释后再进行测定。样品的检测最好能设置平行孔。
空白对照孔 标准品孔 待测样品孔
ACP Assay buffer 40μl (40-x)μl (40-y)μl
显色工作液 40μl 40μl 40μl
Tartrate Solution 5μl 5μl 5μl
待测样品 — — yμl
标准品工作液 — xμl — 1、 轻轻混匀,37?孵育25~30min。
2、 每孔加入Stopping Solution终止反应。
3、 酶标仪检测吸光值,如果无法检测410nm,亦可检测400~415nm范围内吸光值,一
般应数小时内检测完毕。
计算:
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酸性磷酸酶活性单位的定义:pH4.8 37?条件下,每分钟水解para-nitrophenyl
phosphate显色底物产生1微摩尔p-nitrophenol所需的酸性磷酸酶的量定义为一个酶活力单位。根据酶活性定义,计算出样品中的抗酒石酸酸性磷酸酶活性。
注意事项:
1、 待测样品中不能含有磷酸酶抑制剂,同时需避免反复冻融。
2、 建议每次测定时都做标准曲线,以使标准更准确,另外标准品需避免反复冻融。 3、 如果没有酶标仪,也可以使用普通的分光光度计测定,但应考虑根据比色杯的最小检
测体积,尽量采用小体积的比色杯。
4、 所测样本的值高于标准曲线的上限,应用ACP Assay buffer稀释样品后重新测定。 5、 一支显色工作液配制后需当日使用完毕,因此请注意适当多准备一些样品一起检测。 6、 p-nitrophenol溶液对人体有害,反应终止液有腐蚀性,请小心操作。 7、 如果希望进行酶活性的绝对定量,进行酶反应时应精确计时,此时推荐采用孵育30min
或更长时间,以减小操作过程中的时间误差。
8、 待测样品中抗酒石酸酸性磷酸酶活性较低时,可适当延长孵育时间至30min。 9、 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
有效期:12个月有效。
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