【doc】 L-谷氨酰胺

【doc】 L-谷氨酰胺 L-谷氨酰胺 第22卷第l2期 2005年l2月 精细化工 FINECHEMICALS Vo1.22.No.I2 Dec.2005 糍婚毗工鄙-- 10t/a中试规模制备二肽L-丙氨酰?L?谷氨酰胺 陈然,钱绍松,吴晓燕,贾晓娟,焦庆才 (南京大学生命科学学院,江坊:南京210093) 摘要:以邻苯二甲酰基为保护基,采用混合酸酐法接肽,中试规模制备了L一丙氨酰一L一谷氨酰胺(力肽).结果表 明,制备L一丙氨酰一L.谷氨酰胺的最佳条件为:N—Pht—I一丙氨 Pht— 酸接肽的最佳溶剂是乙酸乙酯,温度为0cC,n(N— L一丙氨酸):n(L-谷氨酰胺)=1:1.以L一丙氨酸计,总摩尔收率为34.4%.目标产物质量分数达98.6%. 关键词:L丙氨酰.L一谷氨酰胺;混合酸酐法;邻苯二甲酰基 中图分类号:TQ464.7文献标识码:A文章编号:1003—5214(2005)12—0958—03 10t/aPilot-plant-scaleProductionofL-alanyl-L-glutamine CHENRan,QIANShao—song,WUXiao—yan,JIAXiao-juan,JIAOQing —cai (SchoolofLScience,NanjingUniversity,Nanjing210093,Jiangsu,China) Abstract~L—Alanyl—L—glutamine(Dipeptiven)waspreparedin10t/apilot—plant—scalebyusing phthalylmethodandmixedanhydridemethod.Theresultshowedthattheoptimalsolventusedto dissolveN—Pht.Lalaninewasethylacetatetheoptimaltemperaturewas0andthemolarratioofN— Pht—L.alaninetoL—glutaminewas1:1.Theoverallmolaryieldwas34.4%basedonLalanine.W[L_ alanyl—L—glutamine(Dipeptiven)]=98.6%. Keywords:L—alanyl—L—glutamine;mixedanhydridemethod;phthalylgroup Foundationitem:Grantedbystatetechniqueinnovationfoundation(02CJ—l 3—0l一16) I,谷氨酰胺是人体血液中含量最多的氨基酸,约占人体血 液中全部游离氨基酸的61%,具有重要的生理作用.I一谷氨酰 胺是生物合成核酸的必需前体物质,是蛋白质合成与代谢的调 节物,在维持肠道机能,促进免疫和维持体内酸碱平衡及提高机 体对应激的适应等方面都发挥着极其重要的作用….由于L一 谷氨酰胺水溶性小,热稳定性差,在水溶液中易分解为焦谷氨酸 和氨,对机体有害,因此,限制了L,谷氨酰胺在临床上的使 用.而L,丙氨酰一L_谷氨酰胺(力肽)在水溶液中溶解度高,能耐 受高温消毒,常温下放置两年仍保持稳定,在人体内能迅速分解 成L一谷氨酰胺和L一丙氨酸,弥补了L一谷氨酰胺的不足,因此在 临床上被广泛用作L.谷氨酰胺的替代品. 目前已知的制备L一丙氨酰一L一谷氨酰胺的方法有如F3 种:(1)用D-2一卤一丙酰氯与L,谷氨酰胺反应生成中间产物 D一2一卤一丙酰,L谷氨酰胺,该中间产物氨解产生L一丙氨酰一L一 谷氨酰胺.该法的缺陷是所合成的L一丙氨酰,L一谷氨酰胺 旋光低.(2)?一羰基一L一丙氨酸酐法.该法易产生三肽等 副产物,导致目的产物收率低.(3)使用Cbz(苄氧甲酰基) 保护法.这种方法包括(a)用Cbz保护的L一丙氨酸与位 N被保护的L一谷氨酰胺在缩合剂DCC(一环已基碳?l哑胺) 作用下生成被保护的L一丙氨酰一L.谷氨酰胺中间产物,随后 脱除保护基生成产物J,丙氨酰一L,谷氨酰胺;(b)用A乙 Cbz,L一丙氨酸与L一谷氨酸一一甲酯在DCC作用下缩合成一中 间产物,该中间产物脱除保护基后进行氨解得到目的产物 L广内氨酰一L一谷氨酰胺;(C)N-Cbz—L,丙氨酸的活化酯与L一 谷氨酰胺直接作用生成Cbz基保护的L一丙氨酰一L一谷氨酰 胺,该化合物脱除保护基生成L一丙氨酰一L,谷氨酰胺”J. 本文采用廉价的邻苯二甲酰基作为L一丙氨酸的保护基 制备N-Pht—L一丙氩酸;采用混合酸酐法将N-Pht—L一丙氨酸与 L一谷氨酰胺缩合成N—Pht—L一丙氨酰一L一谷氨酰胺;采用水合肼 脱除邻苯二甲酰基,得到L一丙氨酰一L?谷氨酰胺,本方法具有 工业化价值.工艺 流程 快递问题件怎么处理流程河南自建厂房流程下载关于规范招聘需求审批流程制作流程表下载邮件下载流程设计 如图1所示. 1实验 1.1仪器与材料 HPLC系统由岛津LC一10ATvp溶剂输送泵,SPD一10Avp 紫外检测器,岛津shim—packvp—ODS柱(C18,150mm×4.6 啪),浙大智达N20~0色谱工作站组成.Nexus870FHR红外 光谱仪,BRUKERDRX一500氢核磁共振仪,MarinerApplied 收稿日期:2005—06—28;定用日期:2005,06—30 基金项目:国家技术创新基金资助项目(02CJ一13—01—16) 作者简介:陈然(1981一),男,湖北荆州人,硕卜研究生,师从焦庆才教授,主要从事氨肇酸及多肽合成,电话:025—83594377,传真 025—83594376,E—mail:crhust@126.corn 第l2期陈然,等:l0t/a中试规模制备二肽L-丙氨酰.L.谷氨酰胺?959? Biosystems(T)高分辨率电喷雾质谱仪,WRS一1型数字熔点仪 (上海物理光学仪器厂),10oL电加热不锈钢反应釜(无锡市伟 杰环化设备制造有限公司),100L冰盐水冷却不锈钢反应釜 (无锡太湖石化装备厂),真空玻璃浓缩器(北京玻璃仪器厂), WZZ一2B型全自动旋光仪(上海物理光学仪器厂).L.丙氨酰. L-谷氨酰胺对照品(上海旭新化工科技有限公司,质量分数> 99.0%),其余所用试剂均为市售工业级产品. NH, CH3CHCOOH+C1COOC2H5 (CH3CH2)3N I NH2 l OOCOOC2H5+H2NCOCH2Clq【2CHCOONa一 0NHCHCH2CH2CONH2 C00H NH『_NH2 NH2 ? CH3CHC0NHGHCH2CH2CONH2 COOH ? 图lL一丙氨酰?L一谷氨酰胺的制备途径 Fig.1FlowchartforpreparationofL-alanyl?L—glutamine 1.2L-丙氨酰-L-谷氨酰胺制备 1.2.1NPht.L丙氨酸(I) 在100L反应釜内,分别加入22.3kgL.丙氨酸与37.0 邻苯二甲酸酐,油浴加热至135—140oC,在此温度下反应 30min,趁热倾入热水中,冷却结晶,所得晶体用体积分数 30%的乙醇重结晶,得到I的白色晶体52.0kg,收率95%. 熔点150一l51?;[]2I10=一21.4.(c=2,无水乙醇); IR(KBr),v/cm,:3253(OH),1777,1759[N(c0)2Ar], 1698(COOH),1610,1498(Ar);HNMR(500MHz,DMS0一 d6),:1.66(d,3H,J=7.2Hz,CH,),4.98(q,1H,J:7.2 Hz,NCH),7.74(dd,2H,J.=5.4Hz,J2=3.1Hz,HAr),7.88 (dd,2H,J=5.4Hz,=3.1Hz,HAr),12.18(s,1H, COOH);MS,m/Z:220.1(M+H),242.0(M+Na). 1.2.2N.Pht.L一丙氨酰.L一谷氨酰胺(II) 10.96化合物I溶于40L乙酸乙酯中,加入5.05kg三 乙胺,混合液冷却至0oC,荐加入5.42kg氯甲酸乙酯,反应25 min后加入预冷至一5?的7.3kgL-谷氨酰胺碳酸氢钠溶液 32L,搅拌反应2h后撤走冰盐浴,室温继续搅拌12h,静置分 层.水相用浓度为6moL/I的盐酸酸化,析出化合物?用水一 乙醇重结晶,得白色固体?8.02kg,收率46.2%. 熔点192,193oC;[ot]2D0=一34.5.(c=2,0.5mol/I Na2CO3水溶液);IR(KBr),p/cm,:3454(OH),3280 (CONH),1775,1759[N(CO)2Ar],1713(COOH),1665 (CONH),1634(CONH2),1556,1470(Ar);HNMR(500 MHz,DMSO—d6),6:1.47(d,3H,J=7.2Hz,CH3),1.80— 2.00(nl,2H,CH2CH2CONH2),2.14(t,2H,J:7.1Hz, CH2c2CONH2),4.32(Ill,1H,CHNH),4.95(q,1H,J:7.2 Hz,NCH),6.80(s,H,CONH),7.37(s,H,CONH),7.75(dd, 2H,Jl=5.4Hz,=3.1Hz,HAr),7.89(dd,2H,J.=5.4Hz, J2=3.1Hz,HAr),8.58(d,1H,J=7.7Hz,一NH一),11.78(s. 1H,COOH);MS,m/Z:348.1(M+H),370.1(M+Na) 1.2.3L一丙氨酰.L.谷氨酰胺(?,力肽) 5.0kg化合物1I,0.9kg质量分数为80%水合肼和0.76 无水碳酸钠溶于50L水中,室温放置48h.肼解液用浓度 为6mol/L的盐酸酸化,过滤除去邻苯二甲酰肼,滤液减压浓 缩,加入体积分数为95%的乙醇析出L.丙氨酰.L.谷氨酰胺粗 品,用水一乙醇重结晶得化合物11I2.45kg,收率78.4%. 熔点215—216?;[o/]2D0=+10.6.(c=2,水);IR (KBr),?cm,:3397,3333(NH,),3263(OH),1645 (COOH),1602(CONH);HNMR(500MHz,D,O),6:1.29 (d,3H,J=7.2Hz,CH),1.70,2.10(Ill,2H,CH, CH2CONH2),2.16(t,2H,J=7.1Hz,CH2CH2CONH2),2.88 (Ill,1H,CH2),.(,,),.(,,)_ NH430Ill1HCHNH727sHCONH MS,re~Z:218.1(M+H),240.1(M+Na),435.0(2M+ H),456.9(2M+Na). 1.3L一丙氨酰-L-谷氨酰胺纯度的测定 分别取1mL质量分数为0.02%的L.丙氨酰.L.谷氨酰 胺对照样水溶液和中试合成L一丙氨酰一L一谷氨酰胺水溶液, 加入1mL质量分数为1%的2,4-二硝基氟苯(DNFB)甲醇 溶液,在60?水浴中衍生2h,取20L进样检测.检测波 长为240nm,流动相为(甲醇):(水)=50:50.以保留时 间定性,峰面积定量,中试合成L-丙氨酰.L.谷氨酰胺的质量 分数为98.6%,达到预期要求.HPLC谱图如图2所示,L. 丙氨酰.L?谷氨酰胺保留时间为6.478min. 旨 图2L.丙氨酰.L.谷氨酰胺的HPLC色谱图 Fig.2HPLCehromatogramofI,-alanyl?L—glutamine 2结果与讨论 在L.丙氨酰.L.谷氨酰胺合成中收率最低的步骤是制备 N-Pht.L.丙氨酰.L一谷氨酰胺,因此,重点考察了该步反应的 工艺条件. 2.1溶剂对反应收率的影响 采用了DMF,THF和乙酸乙酯作为N-Pht—L.丙氨酸的溶 剂,结果发现,采用乙酸乙酯作溶剂时N—Pht?L?丙氨酰-L一谷 氨酰胺收率最高为46.2%,而DMF为38.2%,THF为 32.6%.且DMF和THF与水互溶,后处理过程需蒸去溶剂 回收困难,增加了成本,故采用乙酸乙酯效果较好. 2.2温度对反应收率的影响 加入氯甲酸乙酯时的活化温度是非常重要的,但在中试中 ? 960?精细化工FINECHEMICALS第22卷 发现,活化温度在0oC与活化温度在l5,20?的收率分别为 46.2%和44.5%,目的产物力肽比旋光均为[o/]20=+10.6.(c= 2.水),说明活化温度对产物收率和质量没有显着影响. 2.3N.Pht-L-丙氨酸与L-谷氨酰胺摩尔比对反应 收率的影响 由于L_谷氨酰胺价格昂贵且不易回收,因此,减少L一谷 氨酰胺用量,而使廉价且易回收的N—Pht—L一丙氨酸过量,可 以降低成本.结果发现,当n(N-Pht.L一丙氨酸):n(L一谷氨酰 胺)=1:0.8时,N—Pht-L一丙氨酰一L一谷氨酰胺收率显着降低至 36.2%;而当n(N—Pht—L一丙氨酸):n(L一谷氨酰胺)=1:0.6 时,N?Pht-L-丙氨酰.L-谷氨酰胺收率降低至25.4%.表明降 低L?谷氨酰胺用量,收率下降得很快.因此,n(?一Pht—L一丙 氨酸):n(L一谷氨酰胺)=1:1为最佳配比. 2.4副反应对收率的影响 在合成N—Pht—L一丙氨酰一L.谷氨酰胺这步反应中,存在的 副反应如图3所示. desired) O/B(““did)H 2/ — C0C2H5+H2NCOCH2CH2CHCOONa CHCH2CH2C0NH2 COONa \B? ““ ~CH 3CH2OCONHCHCH2CH2CONH2 00Na ? 图3制备N.Pht—L.丙氨酰-L-谷氨酰胺的副反应 Fig.3SidereactioninpreparingN-Pht—L-alanyl—L?glutamine 由于L?谷氨酰胺的氨基进攻的位置不同,而导致副产 物(VI)的生成,同时活化的混合酸酐回到原料N-Pht—L.丙 氨酸,从而使该反应收率降低.可能由于使用L.谷氨酰胺 钠盐的水溶液,该副反应无法避免. 3结论 制备L-丙氨酰?L一谷氨酰胺的最佳条件为:N-Pht.L一丙氨 酸接肽的最佳溶剂是乙酸乙酯,温度为0?,n(N—Pht—L一丙 氨酸):n(L一谷氨酰胺)=1:1.以L一丙氨酸计,总摩尔收率为 34.4%.经过中试验证,本制备方法具有成本低,原料回收 容易,收率高等优点.中试合成的L一丙氨酰一L一谷氨酰胺质 量分数达98.6%,其各项指标均达到出口质量 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 ,为工业 化大规模生产L一丙氨酰一L-谷氨酰胺提供了可靠数据.另 外,如何避免接肽过程中的副反应,仍值得进一步探讨. 致谢:感谢湖北新生源生物工程股份有限公司提供中试场 所,以及在人力,物力上给予的大力支持. 参考文献: [1]杨海军.L-谷氨酰胺的生理特性及其应用[J].中国食品添加 剂,2003,(1):79—82. 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