gsh1的克隆及在巴斯德毕赤氏酵母中的表达

gsh1的克隆及在巴斯德毕赤氏酵母中的表达 发酵工程学科的进展 ——第四欢全国发酵工程学术讨论套静文枭 1的克隆及在巴斯德毕赤氏酵母中的表达 gsh 艾丽静“2，饶志明1，沈微1，方慧英1，诸葛健1 (1(江南大学工业 214036 厶齐鲁和药有限微生物中心和工业生物技术教育部重点实验奎，扛苏无锝250100) 公司，山东济南 摘要:利用PCR技术克隆了来源干Sacd(zromyces cerevisiaeALJ036的rL-各氨酰一L-半 胱氨醺合成酶(7-gIutamyl—cysteJnesynthas) 编码基固gsh 1，连接多持贝表达载体pGAPZA， 转化Pichla x-33，构建了重组曹Pichia pastoris pastoris x-33(pGAPZA-gshl)l在高浓度 Zeocin平板上饰选多持贝阳性转化子，并采用PCR的方法进行验证。对阳性转化子的 T— glutamyl—cysteine synthas晦活力进行了测定，结果显示，重组酵母的'(-glutamyl?cysteine synthaa的酶活力是宿主菌的2(99倍，在液体YEPD中重组苗GSH的产量为42(2mg ,L， 是宿主曹的1(6倍。 关键词:gsh 1f巴斯德毕赤氏酵母，酵母表达I PCRI鉴定 谷胱甘肽(GSH)，即rL_谷氨酰一L(半胱氨酰甘氨酸(7-L-glutamyI—Locysteinylg— lycine，glutathione)(可以清除掉人体内的自由基，净化人体内的环境污染，增进人体健 康，在临床医药、食品工业、及有关生物研究领域都有着广泛的应用前景[1]。GSH是由 卜谷氨酸、L(半胱氨酸和甘氨酸在ATP的存在下，经过r谷氨酰半胱氨酸合成酶(GsH I)和谷胱甘肽合成酶(GSH?)催化而合成的o】。 r谷氨酰半胱氨酸合成酶是GSH合成途径中的限速酶o,。国内对编码r谷氨酰 1在大肠杆菌、酿酒酵母中的表达的研究已有报道D“]，但尚 半胱氨酸合成酶的基因gsh 未 1基因在巴斯德毕赤氏酵母表达。毕赤氏酵母Pichia 展起gsh pastgris是近些年发 见报道 来的一个高效表达系统，具有表达量商、糖基化程度及形式更接近于哺乳动物细胞、 易于 ”]。本文克隆了编码rL(谷氨酰一L_半胱氨酸合成酶的基因 gsh 1，实现高密度发酵等优点 x-33 连接多拷贝表达载体pGApZ-A。转化毕赤酵母，构建重组菌Pichia pastoris (pGAPZA—gsh:)，表达载体pGApZ-A含有组成型强启动子PGAP(三磷酸甘油醛 酶启动子)啪。使用PGAP在发酵时不需甲醇诱导，操作工艺简单，编码7一谷氨脱氢 酰半胱 氨酸台成酶的基因gsh 1在巴斯德毕赤氏酵母为利用重组苗生产GSH提供了 新途径。 1 材料与方法 1(1材料 1(1(1菌种与质粒 基金硬目:国家自然科学基金(30570142)资助项目，扛南大学工业生物技术教育部重点实验室开放课 题(KLIB-KF-200507)。 第四次垒国发酵工程学术讨论会 室cerevisiae)ALJ036、E(coli 酿酒酵母(Saccharomyces JMl00,(recAl，endAl)本实验 (Pichia 保藏，毕赤氏酵母pastorls)x-33菌株、pGAPZA表达载体购自Invltrogen公 司。 1(1(2工具酶和试剂 DNA限制性内切酶、T4DNA LigaseTaqPCR Marker、pMDl8一T载体购自、、 TaKa— Ra公司DNA纯化及片段回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒为博大泰克公 司产品;Yeast Oxoid ， Extract、Polypeptone购自England 操LTD;培养基配制参见Invitrogen公司 作手册。其他试剂均为国产分析纯。 1(1(3引物合成 引物Pz，B根据Genbank公布的酿酒酵母gsh l基因序列设计引物，由上海赛百 生物有限公司合成。P1 5?>cGccTCGAGATGGGAcTCTTAGcTTT<3?为 盛 P2 5'>CGCGCGGCCGCTTAACATTTGCTTTCTA<3?为反向正向引物 引物。 引物两端引入X^oI和NotI位点。 PCR验 Invitrogen公司设计提供: 证引物由 pGAP Forward:5?一GTcccTATTTCAATTGAA一3为上游引物 3"AOXl:57,GcAAATGGcATTCTGACATCC--3，为下游引物 1(2方法 1(2(1 以酿酒酵母总DNA为 模板 个人简介word模板免费下载关于员工迟到处罚通告模板康奈尔office模板下载康奈尔 笔记本 模板 下载软件方案模板免费下载 ，进行PCR扩增反gsh 1基因的扩增与鉴定 DNA模板1”L，10×PCR缓冲渡 应; 2止，引物2pL，dNTPs 2,uL，Taq DNA聚合酶0(5uL，总反应体积为209L。94?变性5 rain9445 35890 ，?，?s，72?120 s，35个循环。扩增产物通过1(2,琼脂糖凝胶 电泳检测。 1(2(2表达载体pGAPZA-gsh 1的构建 回收的PCR扩增片段与pMDl8一T载体16"(2连接过夜。转化E(coil JMl09(得E(coli JMl09(pMDl8一T-gsh 1经Xho I和Not 到1)。重组质粒pMDl8一T-gsh I双酶 连接pGAPZA，转化E(coli JMl09，提取重组质粒进行酶切验证。 切， 1(2，3酵母细胞的转化 经AvrII线性化后的pGAPZA-gsh 1电击转化酵母细胞x-33中。利用含Zeoein的 平板进行筛选。 YPD 1(2(4酵母基因组DNA的提取及转化子PCR鉴定 以酵母基因组DNA为模板，DNA的提取参照文献[9]。利用Invitrogen公司提供 的引物PCR扩增g曲1基因验证阳性克 I(2(5酶活测定隆。 5mL培养液于12000rmp离心15min，弃上清。用0，05mol,L pH7(0的磷酸缓冲液 洗涤菌体。将菌体再用上述缓冲液5mL悬浮后超声波90kHz破碎10min，加 体反应物质(谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸浓度均为40mmol,L，MgCl:、GSH前 人 ATP50mmol,L， 37?反映30raint”。用ALLOXAN试剂衍生化法m1测定酶活及谷胱甘肽含量。 l的克隆及在巴斯德毕赤氏酵母中的表达 艾丽静等:gsh 1(2(6重组酵母Pichia pastoris x-33(pGAPZA-gsh 1)发酵实验 发酵:以YEPD为基础 GSH含量。 生物量的测定:取一定体积培养基进行初步发酵试验，测定重组酵母 r,rain离心5 3500 rain(水洗两次(收集菌体，85 发酵液??烘干至恒重，称量。 胞内谷胱甘肚含量分析:GSH为胞内产物，采用冻溶一高温水煮的方法进行细胞 碎，离心得上清液。利用ALLOXAN试剂衍生化法[5”测定胞内GSH的含量。测破 理为:GSH在实验条件下与ALLOXAN试剂(四氧嘧啶)作用，反应生成的物定原 305 itm处紫外区有最高吸收峰。半胱氨酸上的-SH亦与ALLOXAN反应，但质在 峰在275 nm处，不影响测定结果。 其最大吸收 1(2(7重组酵母的遗传稳定性 在重组酵母生长一个周期后，取1 mL菌液作为下一轮生长的种子液继续培养，每次 测定GSH含量及生物量，共进行lo轮。 2结果 2(1 gshlPCR 基因的扩增结果 PCR扩增得到2037 bp的gsh l基因(图1)。连接T载体后测序，结果显示本研究 克隆的基因序列与已公布的酿酒酵母gsh 1基因相似性为98(48蹦;氨基酸序列相似性 为99(41,。 l的构建2(2表达载体pGAPZ-A-gsh 1经Xho I和Not 重组质粒pMDl8一T-gsh I酶切，得到gsh 1基因连接pGAPZ-( 酶切鉴定结果如图2。表达载体命名为pGAPz_A_g也1(图3)。 A 1 2、DL 2000 DNA Markers 1、PCR产物gsh 1、LDNA,Hind?Marker 2、#;APZA ,‰I 凰1 1,Xho IPCR扩增gshl基因片殷 3、pGAPZA-gsh 1,Xho I、Not I 4、pGAPZA-gsh 5、DL2000 DNA Marker 1的酶切验证 图2质粒pGAPZA-gsh 2(3重组酵母Pichia pastoris x-33(pGAPZA-gsh 1)的筛选和鉴定 第四次垒国发酵工程学术讨论会 围3质粒pGAPZA-gsh 1的构建示意 围 Pastorls 经AvrH线性化的pGAPZA-gsh 1电击转化Pichia x-33感受态细胞，获得 重组转化子。转化子点种于含浓度为500 zeocin的YEPD平板上进行抗性筛pg,mL Pastorls 挑选阳性转化子以及Pichia x-33对照进行PCR鉴定，PCR扩增产物凝选， 结果见图4。gsh 1基因片段为2037bp，pGAP Forward引物和3"AOXl引物胶电泳 pPGAP- ZA的间隔距离为275bp，故PCR扩增得到2300 bp左右的产物的转化子在 即为阳性克隆。 2(4酶活的测定 牛血清蛋自标 5。 准曲线如图 { 冬 昌 光吸收值A 1(D12000 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 分子量2(3(毛5(转化子基因组DNA扩 s围牛血清清蛋自标准曲线 增茸五1基因6(宿主菌基因组DnIA扩增g讪1基因 田4 PcR产物的箍胶电涞圈 根据图5蛋白质标准曲线及回归直线方程:Y;56(362X(X:光密度值OD5。Y: BSA 含量pg,mL)得出粗酶液中粗蛋白的浓度-结合酶活力测定t计算出毕赤酵母胞内GSHI的 艾丽静等tgsh 1的克隆及在巴斯德毕赤氏酵母中的表达 酶活力。酶活力以GSH合成能力计算即以单位质量(mg)蛋白于每分钟内所能合成 GSH(mg)来计算。如图6所示重组酵母最高酶活力达到95(78 U,rag蛋白，比宿主菌的 高出 1(99倍。在发酵35,50 h酶活处于稳定期，进入发酵后期，酶活开始有所降低( 1)2(5重组酵母Pichia pastoris 发酵试验 结果显示，在液体YEPDx-33(pGApZA-gsh 发酵液中，重组毕赤酵母胞内GSH产量为42(2 mg,L，约 是宿主菌的1(6倍，如图7所示。 1，jF栅加皇?o 皿嗯胃，?孵镀丑 时问h发酵时间h --e重组酵母--?HI酶活曲线+宿主茵GSH疃活曲线 +重组酵母_。sH音量 +宿主酵母GSH含量 圈6宿主酵母殛重组酵母酶活力曲线 7GSH 围重组酵母及宿主酵母含量积累曲线2(6重组毕赤氏酵母的遗传稳定性 重组毕赤酵母在液体YEPD中连续经10轮培养， GSH含 考察每一轮菌株的生长和 量情况，结果表明，重组酵母在生长密度及GSH含量方面基本保持稳定见表1。 寰1重组毕赤氏酵母的遗传稳定性实验 轮数 生物置(g,L) 轮数 生物量(g,L) GSH最(rag,L)GSH量(rag,L) l 42 ll 6 41 10(B 2 42(2 10(9 7 41 10(73 42 10(9 8 41 10(5 „ 42(1 10(9 9 440 10(7 5 42(2 11 10 39 8 10 7 3讨论 本论文用PCR的方法克隆出7一glutamy|-cysteine synthas编码基因gsh 1。井成功 连接到组成型表达载体pGAPZA上，构建了重组质粒pGAPZA-gsh 1。限制性内 Avr?线性化后电击转化Pichia x-33感受态细胞，在高浓度Zeocin平板上筛pastoris 切酶 多拷贝阳性转化子，利用PCR的方法验证。对阳性转化子的GSH I酶活力进行了测选 结果显示，重组酵母的GSH I的酶活力是宿主菌的2(99倍。在液体YEPD中定， GSH的产量为42(2mg,L，是宿主菌的1(6倍。 重组菌 同时有 资料 新概念英语资料下载李居明饿命改运学pdf成本会计期末资料社会工作导论资料工程结算所需资料清单 报道，在Pichiapastoris中表达外源蛋白大约有50,75,的可能性获 得较好的表达水平，最大的困难就是首先要获得第一步的成功，即可获得一定水平的表 达，取得这一阶段的成功后，通过调整已明确的各种参数来优化表达，常可获得诱人的表 第四次全国发酵工程学术讨论会 达水平“”。因此下一步工作即对重组菌进行发酵条件优化，利用高密度发酵通过提高生 物 GSH总量。 量的方法提高 参考文献 role of aL of glutathione(J(Bio( et A the essential D，Labatre J，ToledanoM genetic invecstigation Chem(，[1]$pector 2001t 279;7011—7019( 1245—1254(ot synthesis glutathioneinisolatedliv,BiolChem，1949?179(3)l [2]BlochK(The H et a1(The of the of Escherleh。Y，Watanabe K(Tezuka expression synthetasegene 7-glutamylcysteine [3]Ohtake ia in boil(Chew(?1988(92:2753--2762( coil eerevisiaeAgric B (Saccharomyees of of the coil inEseherichia B H n Ohtake Y(Watanahe K(Tezuka a1(Expression glutathione synthetase sene [4 3 cerevisiae(J(Ferment(Bioeng(t 198968390—394 [5]沈立新(魏东芝，赵哲峰等答胱甘肚合，:(Saccharomyces Vo]17No198--100 ((，(et aL 2001 x Y，He P，Guo X X N 成酶系的克隆、测序及表达，生物工程学报[8]Fan functinnal of the formation 7-glutamyl— expressing Increasing by glutathlonein Letterst 2004t (26(5)J415--417synthe妇5e ccrevisiae(Biotechnolngy cystdne gene Saccharomyccs Pichia M in the Me7]Cereghlno J L，Cregg J Heterolngous protein expression methylotrpohlc yeast pastoris“FEBS icrobiology Reviews(8000，24，45—96( de-H M E，Koutz PJ et m(Isolation of the Pichia [8]Waterham ，Digan pastorls glyceraldehyde--3。ph03phate R and of its 37--441( u5e hydrogenase gene and promoter(Gene(1997?186 l [9]周小玲(沈regulation 31(4)89--92( 巅，饶志明等((--种快速提取真菌染色体的方法，，微生物学通报(2004 [10]王荣民(曹 6t34—38(新意等(谷肚甘肚测定方法初撵，食品与发酵工业(1992t et at(Recomhinaut in Pichia BLotedmot( Y 【11]Crngg J M ，Cer=ghino J L(蹴J protein唧res如n pastorl,Mot 2000，19，23一S2( of 1 in Pichia and gsh pastorisCloning Expressing Ai Jianl Li-iin91”，Ran Zhi—min91，Shen Weil，Fang Hui—yin91，Zhuge of Industrial Lab (1(Research Centre of Industrial and the Bioteehnology，Microorganisms Key of 214036，ChinaMinistry University，Wuxi Education，Southern Yangtze Pharmaceutical 2(OJh CO(，LTD(Jinan 250100。China) cloned to Abstract:The gene encoding y-glutamyl-eysteine syathase(础1)was the strain vector then was transformated into Pichia x-33 after linearized pOAPZA pastoris by with the resistance to zeocin selected and th?identified Avrll(Recombinants were by highest in selected transformants were cultivated flasks(The analysis(The activity of',-PCR 1)is in the recombinant Pichia ris pasto— synthase x-33(pG^tPZA-gsh glutamyl-cysteine the 98(5 which is 2(99 times of host U,rag protein strairL While in the recombinant Pichia 1)isGSH the pastoris x-33(pGAPZA-gsh is times of the Pichia 42(2 1(60 x-33(mg,L(w11ich pastoris 1 Pichia I Key words:gsh ;PCR analysis pastoris}yeast expression