微生物的代谢调控与代谢工程

微生物的代谢调控与代谢工程 第二章 微生物的代谢调控与代谢工程 第二章 微生物的代谢调控与代谢工程 第一节 微生物代谢的自我调节微生物代谢是受到高度调节的，如下事实可以说明: 1,微生物生长在含单一有机化合物为能源的合成培养基中～所有大分子单体,如氨基酸,的合成速率同大分子,如蛋白质,的合成速率协调一致～不会浪费能量去合成那些他们用不着的东西。 2,任何一种单体的合成～如能从外源获得并能进入细胞内～单体的合成自动停止～参与这些单体生成的酶的合成也会停止, 3,微生物只有在有某些有机基质,如乳糖,存在时～才会合成异化这些基质的酶, 4,如存在两种有机基质～微生物会先合成那些能异化更易利用的基质的酶～待易利用的基质耗竭才开始诱导分解较难利用的基质的酶, 5,养分影响生长速率～从而相应改变细胞大分子的组成,如RNA含量, 微生物自我调节的部位: 1、养分吸收分泌的通道 大多数亲水分子难于透过细胞膜，需借助一些负责运输的酶系统(如透酶)才得以实现;有些是需能的。 2、限制基质与酶的接近 在真核生物中，各种代谢库的基质分别存在于由胞膜分隔的细胞器内，如在链孢霉中精氨酸存在于细胞质和液泡内，这两处参与精氨酸代谢的酶量有很大的差别。 原核生物的控制方式不同，其中有些酶是以多酶复合物或以细胞膜结合的方式存在，类似于酶的固定化形式，使它不能自由活动。 3、代谢途径通量的控制微生物控制代谢物流的方法有两种: 调节现有酶的量、改变已有酶分子的活性 微生物自我调节的三个部位实际上也就是三个类型，但都涉及到酶促反应调节。 酶促调节的方式包括酶活性调节和酶合成调节两大类 一、酶活性调节酶活性的调节方式: 共价修饰、变(别)构效应、缔合与解离、竞争性抑制 1、共价修饰指蛋白质分子中的一个或多个氨基酸残基与一化学基团共价连接或解开，使其活性改变的作用。 化学基团:磷酸基、腺苷酰基、甲基、乙基等 蛋白质的共价结合部位一般为丝氨酸残基的-CHOH 2 共价修饰分可逆和不可逆两种1)可逆共价修饰有些酶存在活性和非活性两种状态，它们可以通过另一种酶的催化作共价修饰而互相转换。如: 糖原磷酸化酶 通过激酶和磷酸酯酶来调节活性 磷酸化形式有活性 ;去磷酸化形式无活性 又如: 大肠杆菌谷氨酰胺合成酶(GS) 12个完全相同亚基(分子量50 000)，排成两层六角环结构; 每个亚基含有催化部位和结合效应物的变构部位; 每个亚基的酪氨酸残基上还能进行可逆的腺苷酰化，完全腺苷酰化可结合12个AMP; 完全脱腺苷酰形式是活性最高的，完全腺苷酰化的是活性最低的; 腺苷酰转移酶(Adenylyl transferase; AT)催化; AT的特异性是由调节蛋白P所控制的，由P、P两种形AD 22 第二章 微生物的代谢调控与代谢工程 式;P与AT的复合物催化GS的腺苷酰化, P与AT的复合物则催化脱腺苷酰反应; 调节AD 蛋白P本身又受到鸟苷酰化和脱鸟苷酰化的可逆共价修饰; 酶可逆共价修饰的意义:1) 因酶构型的转换是由酶催化的，故可在很短的时间内经信号启动，触发生成大量有活性的酶; 2)这种修饰作用可更易控制酶的活性以响应代谢环境的变化。 这一系统具有能随时响应的特性，因而经常在活化与钝化状态之间来回变换; 需消耗能量，但只占细胞整个能量消耗的一小部分 2)不可逆共价修饰 典型的例子是酶原激活——无活性的酶原被相应的蛋白酶作用，切去一小段肽链而被激活 (胰蛋白酶原的活化靠肠肽酶从其N-端切去一个己肽Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys) 酶原变为酶是不可逆的;信号放大;酶完成使命后便被降解，关闭酶活性。 2、变构控制变构或别构(allosterism)效应是指一种小分子物质与一种蛋白质分子发生可逆的相互作用，导致这种蛋白质的构象发生改变，从而改变这种蛋白质与第三种分子的相互作用。 变构蛋白是 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 现变构效应的蛋白，如阻遏蛋白;具有变构作用的酶称作变构酶 激活 抑制 两个矛盾的过程 普遍存在于微生物代谢中大肠杆菌糖代谢中酶的激活剂与抑制剂 酶 激活剂 抑制剂磷酸果糖激酶 ADP 、GDP PEP 丙酮酸脱氢酶 PEP、AMP、GDP NADH 、乙酰CoA 变构调节机制:1)变构酶具有一个以上的结合位点，除了结合底物的活性中心外，在同一分子内还有一些分立的效应物结合位点(副位点); 2)主位点和副位点可同时被占据; 3)副位点可结合不同的效应物，产生不同的效应; 4)效应物在副位点上的结合可随后引起蛋白质分子构象的变化，从而影响酶活性中心的催化活性; 5)变构效应是反馈控制的理论基础，是调节代谢的有效方法。 3、缔合与解离 能进行这种转变的蛋白质由多个亚基组成; 蛋白质活化与钝化是通过亚基缔合与解离实现的。 +4、竞争性抑制一些蛋白质的生物活性受代谢物的竞争性抑制，如需要氧化性NAD的反应可能被还原型NADH的竞争抑制;需ATP的反应可能受ADP或AMP的竞争型抑制; 有些酶受反应过程产物的竞争性抑制 二、酶合成(酶量)的调节 酶合成的调节是一种通过调节酶的合成量进而调节代谢速率的调节机制，这是一种在基因水平上(在原核生物中主要在转录水平上)的代谢调节。凡是能促进酶合成的调节称为诱导;而能阻碍酶合成的调节称为阻遏。同调节酶的活性的反馈抑制等相比，通过调节酶的合成而实现代谢调节的方式是一类较间接而缓慢的调节方式;其优点是通过阻止酶的过量合成，有利于节约生物合成的原料和能量。 一)酶合成调节的类型诱导、阻遏(末端产物阻遏、分解代谢产物阻遏) 23 第二章 微生物的代谢调控与代谢工程 1、酶合成的诱导(induction) 组成酶: 不依赖于酶底物或类似物的存在而合成;如葡萄糖转化为丙酮酸过程中的各种酶 诱导酶:依赖于某种底物或底物的结构类似物的存在而合成;如大肠杆菌乳糖利用酶?诱导剂可以是诱导酶的底物，也可是底物的结构类似物 如:乳糖是大肠杆菌,-半乳糖苷酶合成的诱导剂，也是此酶的底物 [实际上乳糖不是真正的诱导物，它必须先转化为别乳糖才能起诱导剂的作用] ?诱导剂也可以不是该酶的作用底物 如异丙基- ,-D-硫代半乳糖苷(IPTG)是,-半乳糖苷酶合成的极佳诱导剂，但不是作用底物;?酶的作用底物不一定有诱导作用 如对硝基苯-a-L-阿拉伯糖苷是b-半乳糖苷酶的底物，但不能诱导该酶的合成。酶的诱导可分两种:1)同时诱导当诱导物加入后，同时或几乎同时诱导几种酶的合成;主要存在于短的代谢途径中。 如将乳糖加入到E.coli培养基后，可同时诱导出,-半乳糖苷透性酶、 ,-半乳糖苷酶、半乳糖苷转乙酰基酶;不管诱导强度如何，所以这三种蛋白以同一比例合成。(因为三者的基因组成同一操纵子) 2)顺序诱导 先合成能分解底物的酶，再依次合成分解各中间代谢物的酶，以达到对较复杂代谢途径的分段调节。 2、酶合成的阻遏 (repression) 1)末端产物阻遏 (end-product repression) 指由某代谢途径末端产物过量积累而引起的阻遏。对直线式途径来说，末端产物阻遏的情况较简单，即产物作用于代谢途径中的各种关键酶，使之合成受阻;对于分支代谢途径而言，情况较复杂，每种末端产物仅专一地阻遏合成它的那条分支途径的酶。代谢途径分支点以前的“公共酶”仅受所有分支途径末端产物的阻遏(多价阻遏作用)。末端产物阻遏在代谢调节中有重要作用，保证细胞内各种物质维持适当的浓度;普遍存在于氨基酸核苷酸生物合成途径中。 2)分解代谢物阻遏 (catabolite repression) ——是指两种碳源(或氮源)分解底物同时存在时，细胞利用快的那种分解底物会阻遏利用慢的底物的有关分解酶合成的现象。 Or ——当培养基中同时存在有多种可供利用的底物时，某些酶的合成往往被容易利用的底物所阻遏，这就是分解代谢阻遏。最典型的例子是细胞通过最易利用的碳源(如葡萄糖)的分解产物来抑制一些酶的合成。这个现象最早在青霉素的生产中发现，可快速利用的葡萄糖致使青霉素产量特别低，而缓慢利用的乳糖却能较好地生产青霉素。进一步的研究表明，乳糖并不是青霉素合成的特殊前体，它的价值仅在于缓慢利用。被快速利用的葡萄糖的分解产物阻遏了青霉素合成酶的合成。 把大肠杆菌培养在含有葡萄糖和乳糖的培养基中，可明显看到大肠杆菌经历了两个对数期。葡萄糖在第一个周期中被利用。在葡萄糖代谢初期，,-半乳糖苷酶和半乳糖苷透性酶的合成受阻遏，使乳糖不被利用。葡萄糖被消耗完后，乳糖代谢所需的酶开始合成，于是出现了利用乳糖的第二个生长周期。 这种抑制青霉素合成及乳糖利用的现象，起初认为只有葡萄糖才会产生，故称为葡萄糖效应。所有可以迅速利用或代谢的能源，都能阻遏异化另一种被缓慢利用能源所需酶的合成 阻遏作用并非快速利用的碳源(或氮源)本身作用的结果;而是其分解代谢过程中所产生的中间代谢物引起;分解代谢阻遏涉及到的是一些诱导酶。 二)酶合成调节的分子机制 24 第二章 微生物的代谢调控与代谢工程 目前认为，由Monod和Jacob提出的操纵子假说能较好地解释酶合成的诱导和阻遏 操纵子 (operon)由启动基因(promoter)、操纵基因(operator)、结构基因(structural gene)组成。启动基因为RNA聚合酶结合部位。操纵基因位于启动基因和结构基因之间，能与阻遏物(一种调节蛋白)相结合，以此来决定结构基因的转录能否进行。操纵子分诱导型操纵子(inducible operon)和阻遏型操纵子(repressible operon)两种，只有当存在诱导物时其转 并随之转译出诱导酶;负责基质分解;如 乳糖操纵子 录水平才最高,阻遏型操纵子:只有当缺乏辅阻遏物时其转录频率才最高，即只有通过去阻遏作用才能启动所编码酶的合成;负责某些物质合成;如色氨酸操纵子。 调节基因(regulator gene):一般位于相应操纵子的附近，也可远离操纵子; 编码组成型调节蛋白;调节蛋白(regulatory protein)是一类变构蛋白，有两个特殊位点，其一可与操纵基因结合，另一位点可与效应物结合。 调节蛋白可分两种: 阻遏物(repressor): 能在没有诱导物时与操纵基因结合 阻遏物蛋白(aporepressor): 只能在辅阻遏物存在时才能与操纵基因结合 效应物(effector): ——指一类低分子质量的信号物质(如糖类及其衍生物、氨基酸、核苷酸等)。 辅阻遏物(corepressor) 诱导物(inducer); 1、酶的诱导机制:(以E.coli乳糖操纵子为例) E.coli乳糖操纵子由lac启动基因(lacP)、lac操纵基因(lacO)和三个结构基因(lacZ、Y、A)所组成，三个结构基因分别编码b-半乳糖苷酶、透过酶和转乙酰酶。 乳糖操纵子是负调节的代表，在缺乏乳糖等诱导物时，由调节基因(lacI)编码的调节蛋白(即lac阻遏物)一直结合在操纵基因上，抑制着结构基因转录的进行。 当有诱导物如乳糖存在时，乳糖与lac阻遏物相结合，使后者发生构象变化，结果降低了lac阻遏物与操纵基因间的亲和力，使它不能继续结合在操纵子上，操纵子的“开关”被打开，结构基因的转录、翻译可顺利进行。 当诱导物耗尽后， lac阻遏物可再次与操纵基因结合，这时转录的“开关”又被关闭，酶就无法合成，同时，细胞内已转录好的mRNA也迅速地被限制性内切酶所水解，所以细胞内酶的合成速度急剧下降。 2、末端产物(反馈)阻遏机制: (以色氨酸操纵子为例) 色氨酸操纵子的阻遏是对合成代谢酶类进行正调节的典例 E.coli色氨酸操纵子也由启动基因、操纵基因和结构基因(5个)三部分组成。5个结构基因分别编码色氨酸合成途径中的5种酶。 调节基因(trpR)远离操纵基因，编码阻遏物蛋白;其为由4个亚基组成的四聚体;单独的四聚体不能和操纵基因(trpO)结合，只有先结合了色氨酸分子后改变了四聚体的分子构象才能与trpO结合。 当细胞内色氨酸浓度高时，色氨酸与阻遏物蛋白结合，形成完全阻遏物，与操纵基因结合，阻止结构基因转录(色氨酸为辅阻遏物)。 当细胞内色氨酸缺乏或不足时，则导致阻遏物脱离操纵基因，使操纵基因“开关”打开，结构基因的转录又可正常进行。 3、分解代谢阻遏机制: (以葡萄糖分解代谢物对乳糖分解酶的阻遏为例) E.coli 含有一个代谢产物活化蛋白CAP (catabolite activated protein)，也称cAMP受体蛋白CRP;CAP 和cAMP都是lac mRNA合成所必需的。 25 第二章 微生物的代谢调控与代谢工程 CAP能与cAMP形成复合物， cAMP- CAP复合物结合在lac 操纵子的启动基因上，可促进转录的进行，实现正调节。葡萄糖分解代谢的中间代谢物能抑制腺苷酰环化酶活性并活化磷酸二酯酶，从而降低cAMP浓度，此时CAP不能被活化形成cAMP- CAP复合物，从而抑制了lac的转录。 4、RNA水平的调节机制: 弱化子的弱化调节Yanofsky 1973年研究大肠杆菌色氨酸合成时发现;当细胞内有色氨酸存在时，可使转录过程在未到终点之前，便有80%-90%的转录停止。这种调节方式不是使正在转录的过程全部在中途停止，故称弱化作用(attenuation)。 弱化调节是通过操纵子的引导区内类似于终止子结构的一段DNA序列实现的，这段序列称为弱化子或衰减子(attenuator)。当细胞内某种氨基酰-tRNA缺乏时，该弱化子不表现为终止子功能;当细胞内某种氨基酰-tRNA充足时，弱化子表现为终止子功能，但这种终止作用并不使所有正在转录中的mRNA全部都中途停止，而只是部分中途停止转录。 弱化调节方式是在mRNA水平上起作用的;较为广泛地存在于氨基酸合成操纵子调节中，是细菌辅助阻遏作用的一种精细调控。 mRNA含有一引导区(在第一个结构基因的上游)，显示出一种不平常的氨基酸密码子的堆积。如:色氨酸操纵子两个Trp密码子相邻地位于引导区 色氨酸充足时: 细胞具有大量携带Trp的tRNA，便会迅速形成引导肽。在trp mRNA上工作的核糖体复合物与合成trp mRNA的RNA聚合酶同步运行。由此，第一个可能的mRNA次级结构，干环(stem loop)构型形成一种中止环(1:2)，加上一终止环(3:4)。出现这种情况， 则RNA聚合酶复合物十有八九会停止在终止环上并解离，随后结构基因的转录便被终止。 缺少色氨酸时: trp则因为缺少tRNA，trp引导区的转译被停止，核糖体便停顿在Trp密码子上，并阻止中止环的形成。其结果形成一种抗终止区环(2:3)，从而抑制终止区环的形成。因此RNA聚合酶并未停止，继续转录trp基因。色氨酸合成代谢调节中存在反馈抑制、反馈阻遏、弱化调节等;由此可见微生物代谢调节的复杂性。 5、二元调节系统近年来越来越多的二元调节系统在原核微生物中被发现。 含有两种蛋白: 传感器(或发射器) 跨膜蛋白 调节器(或接受器) 可溶性蛋白传感器起蛋白激酶作用，能催化需ATP的自动磷酸化作用和将磷酸基转移给其他蛋白(如调节蛋白)的作用。若受外界或内部刺激(如渗透压、化学吸引剂、特殊分子的存在或缺乏)，传感器分子便自动磷酸化，从而把刺激转换成生化信号(传感器分子的磷酸化状态)。此信号可通过磷酸基的转移将信号传给可溶性调节蛋白。 磷酸化调节器可作为转录的激活剂或阻遏物，再与DNA序列相互作用。此二元系统是微生物中的信号传导模型，参与硫酸盐和氮代谢的调节。 三、分支生物合成途径的调节1、同工酶调节某一分支途径中的第一步反应可由多种酶催化，但这些酶受不同的终产物的反馈调节如:大肠杆菌的天门冬氨酸族氨基酸的合成途径中，有三个同工酶: 天门冬氨酸激酶?、?、?，分别受赖氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸的反馈调节2、协同反馈调节 需有一种以上终产物的过量存在方有明显的效果 单个终产物过量，不产生或只产生很小的影响 3、累加反馈调节每一种末端产物过量只能部分抑制或阻遏，总的效果是累加的4、增效反馈调节代谢途径中任一末端产物过量时，仅部分抑制共同反应中第一个酶的活性，但两个末 26 第二章 微生物的代谢调控与代谢工程 端产物同时过量时，其抑制作用可超过各末端产物产生的抑制作用的总和5、顺序反馈调节6、联合激活或抑制调节 由一种生物合成的中间产物参与两个完全独立的、不交叉的合成途径的控制。这种中间体物质浓度的变化会影响这两个独立代谢途径的代谢速率。。 如: 肠细菌中精氨酸和嘧啶核苷酸的合成途径是完全独立的，但它们有一共同的中间体——氨甲酰磷酸。 负责合成该中间体的酶——氨甲酰磷酸合成酶可以被嘧啶代谢途径的代谢物UMP，反馈抑制，也可被精氨酸合成途径中的中间体鸟氨酸激活。 7、酶的共价修饰 如:大肠杆菌的谷氨酰胺合成酶通过共价修饰引起活力的改变与变构酶不同，变构酶不同状态间的变化，并不涉及共价化学键的形成 四、能荷调节能荷——指细胞中ATP、ADP、AMP系统中可为代谢反应供能的高能磷酸键的量度。 [ATP]，1/2[ADP] 能荷,，100%[ATP]，[ADP]，[AMP] 能荷调节——指细胞通过改变ATP、ADP、AMP三者比例来调节其代谢活动，也称腺苷酸调节。能荷不仅调节形成ATP的分解代谢酶类(如磷酸果糖激酶、异柠檬酸脱氢酶、柠檬酸合成酶等)的活性，也调节利用ATP的生物合成酶类(如柠檬酸裂解酶、磷酸核糖焦磷酸合成酶等)的活性。第二节 微生物的代谢调控对于生命过程来说，代谢反应的协调是必要的;代谢反应的协调是通过细胞自身的代谢调控系统对细胞机能实行精细控制来达到的。但是，在工业生产中却往往需要单一地积累某种产品，这些产品的量又经常是大大地超出了细胞正常生长和代谢所需的范围。 因此，要达到过量积累某种产品的目的，提高生产效率，就必须使原有的调节系统失去控制，在保证微生物适当生存的条件下，建立起新的代谢方式，使微生物的代谢产物按照人们的意志积累。一、克服反馈抑制和反馈阻遏的调控 反馈调节有:反馈抑制、反馈阻遏 反馈抑制——是途径中的末端产物抑制途径中初期酶作用的现象。一般抑制的是途径中的第一个酶。末端产物与酶的调节位点结合之后，酶分子变形，从而妨碍了底物与酶的结合，使酶的活性受到影响。反馈阻遏 —— 是途径中末端产物阻遏途径中初期酶合成的现象。当末端产物和细胞中无活性的原阻遏物结合后，产生了有活性的阻遏蛋白。 阻遏蛋白与操纵基因O 相结合，就关闭了启动基因P,RNA 聚合酶便无法再与启动基因结合，于是结构基因S即停止转录， 酶的合成受到阻遏。 克服反馈调节，可从以下两方面着手:降低末端产物浓度 应用抗反馈突变株1、降低末端产物浓度 1)营养缺陷型的利用营养缺陷型是指原菌株因基因突变致使合成途径中断，丧失了合成某种必须物质的能力，而必须在培养基中加入相应物质才能正常生长的突变菌株。营养缺陷型突变株的代谢流受阻，末端产物减少，解除了末端产物参与的反馈调节，可使代谢途径中的某一中间产物积累。利用枯草杆菌的精氨酸缺陷型生产瓜氨酸，利用大肠杆菌的赖氨酸缺陷型生产苏氨酸，都是这个道理。※营养缺陷型也可用来生产分枝途径中的中间产物。 ※在分枝途径中，如果减少某一末端产物的浓度，常常可以积累另一末端产物。 工业上应用的重要例子是赖氨酸发酵 27 第二章 微生物的代谢调控与代谢工程 2)渗漏缺陷型的利用一种不完全营养缺陷型，它不会产生过量的末端产物，因而可以避开反馈调节。但它又能合成微量的末端产物，用来进行生物合成;在培养这种突变体时，可不必在培养基中添加相应的物质，就能积累所需的产物。3)提高细胞渗透性 细胞内合成的发酵产物若要分泌到培养基中，必须经过细胞膜和细胞壁。如果产物不易分泌出细胞，而积累在细胞内，则会引起反馈调节。改变细胞膜和细胞壁的通透性，使其有利于产物的分泌，也是降低末端产物浓度的一种途径。 ※谷氨酸生产菌的细胞膜磷脂含量高时，细胞的通透性较差，磷脂含量低时，通透性较好。※通常在培养基中添加一些控制因素，以达到影响细胞膜磷脂含量的目的。如可使用青霉素来使细胞壁的完整合成受阻。※细胞壁和细胞膜的通透性增大后，产物易于泄出，于是就降低了谷氨酸在细胞内的积累。 2、抗反馈突变株的利用在以积累末端产物为目的的发酵生产中，如果代谢途径单一无分枝，往往不能选用营养缺陷型突变株。要提高产量，最好采用抗反馈突变株抗反馈突变株由于基因突变，它们的酶或无活性的原阻遏物不再与末端产物结合，从而不再发生酶的变构及阻遏物的活化，或者活性阻遏物不能再与发生了突变的操纵基因结合，因此反馈调节被打破，即使在末端产物过量的情况下，也同样可以积累高浓度的末端产物。。抗反馈突变株通常可以用添加末端产物类似物的方法来筛选。末端产物类似物和末端产物结构类似，因而能够引起反馈，但是它们不能参与生物合成。在培养基中添加末端产物类似物后，未突变的细胞将由于代谢途径受阻而不能获得生物合成 所需的该种末端产物，从而导致细胞死亡。那些对类似物不敏感的突变体，则由于原来受反馈控制的酶的结构，或是酶的合成系统已经发生了改变，它们不再受抑制或阻遏的影响，在类似物充斥的情况下照常能合成该种末端产物。例如，用类似物D-精氨酸选出的谷氨酸棒杆菌的抗反馈突变株可使L-精氨酸的产量得到提高。 从营养缺陷型的回复突变株也能获得抗反馈的突变菌株。※通过营养缺陷突变，对反馈敏感的酶缺失了。※发生回复突变后，虽然酶的催化活性恢复了，末端产物仍然能生成，但很可能酶的氨基酸序列发生了变化，变得对反馈不敏感了。这样的回复突变株便能过量地积累末端产物。 ※在工业上，生产氨基酸、嘌呤、嘧啶和维生素的生产菌种大都是抗反馈突变株。 二、克服分解代谢阻遏的调控当培养基中同时存在有多种可供利用的底物时，某些酶的合成往往被容易利用的底物所阻遏，这就是分解代谢阻遏。 ※最典型的例子是细胞通过最易利用的碳源(如葡萄糖)的分解产物来抑制一些酶的合成。※这个现象最早在青霉素的生产中发现，可快速利用的葡萄糖致使青霉素产量特别低，而缓慢利用的乳糖却能较好地生产青霉素。※进一步的研究表明，乳糖并不是青霉素合成的特殊前体，它的价值仅在于缓慢利用。被快速利用的葡萄糖的分解产物阻遏了青霉素合成酶的合成。 如把大肠杆菌培养在含有葡萄糖和乳糖的培养基中，可明显看到大肠杆菌经历了两个对数期。※葡萄糖在第一个周期中被利用。 ※在葡萄糖代谢初期，b-半乳糖苷酶和半乳糖苷透性酶的合成受阻遏，使乳糖不被利用。※葡萄糖被消耗完后，乳糖代谢所需的酶开始合成，于是出现了利用乳糖的第二个生长周期。 这种抑制青霉素合成及乳糖利用的现象，起初认为只有葡萄糖才会产生，故称为葡萄糖效应。以后发现其他的碳源和氮源也会产生这样的效应，于是就把这种普遍的现象称为分解代谢阻遏。代谢阻遏涉及到的是一些诱导酶。分解代谢阻遏对细胞本身是合理的。但生产上有时需要克服分解代谢阻遏。 生产中要克服分解代谢阻遏可采取下列 措施 《全国民用建筑工程设计技术措施》规划•建筑•景观全国民用建筑工程设计技术措施》规划•建筑•景观软件质量保证措施下载工地伤害及预防措施下载关于贯彻落实的具体措施 :1、避免使用有阻遏作用的碳源和氮源 可采用相对来说不引起分解代谢阻遏的碳源或氮源，如乳糖、多元醇、有机酸和黄豆饼粉等。 28 第二章 微生物的代谢调控与代谢工程 如:用甘露糖代替半乳糖培养荧光假单胞菌，由于克服了半乳糖的分解代谢阻遏，结果在细胞中所产生的纤维素酶提高了1500倍。2、流加碳源或氮源 在考虑经济效益而必须使用有阻遏作用的碳源或氮源时，缓慢流加碳、氮源可使分解代谢产物维持在较低的水平上，而不至于产生阻遏。3、利用抗分解代谢阻遏的突变体如调节基因发生突变，使产生的阻遏蛋白失活，不能与末端分解代谢产物结合;或操纵基因发生突变使阻遏蛋白不能与其结合，都能获得抗分解代谢阻遏的突变株。 筛选方法: 在以酶受阻遏的底物为唯一氮源的培养基上，选择能正常生长的菌落。 例如: 把鼠伤寒沙门氏菌培养在葡萄糖-脯氨酸琼脂上，因为脯氨酸氧化酶被葡萄糖阻遏，所以采用脯氨酸为唯一氮源。 未突变菌株的脯氨酸氧化酶被阻遏，而无法利用脯氨酸作为氮源，菌株不能生长;抗分解代谢阻遏突变株则能够利用脯氨酸而正常生长。三、对诱导调节的控制诱导调节是细胞中代谢调节的一种重要方式，它保证了诱导酶仅仅在有底物存在而需要的时候才合成，不至于使细胞白白耗费氨基酸和能量而去合成无用的酶。 对诱导作用，研究得比较清楚的是乳糖操纵子。※乳糖作为诱导物，当它与调节基因R所产生的活性阻遏物结合后，就使阻遏物失去活性。 ※无活性的阻遏物不能与操纵基因O结合，于是启动基因P开启，诱导酶合成的RNA的转录开始进行，酶即被诱导合成。 ※ 如果诱导物消失，那么活性阻遏物就能与操纵基因结合，从而阻止邻近的结构基因S的 转录，酶的合成停止。 在生产上为了提高诱导酶的产量，对诱导调节控制的常用手段有:1、添加诱导物类似物在诱导物就是酶的底物的情况下，添加底物类似物来加强诱导作用是最好的。 因为底物类似物不易被所形成的酶分解，而在细胞中始终保持较高的浓度，能够持续地诱导酶的合成，获得较高浓度的酶。例如，用异丙基硫代半乳糖苷可诱导b-半乳糖苷酶的合成2、添加辅酶或辅助因子 在有些情况下，必须在培养基中添加辅酶才会产生诱导作用。例如: 丙酮酸脱羧酶的合成需有硫胺存在3、利用组成型突变株 ※突变可以除去酶合成时对诱导物的依赖。※组成酶突变株在没有诱导底物存在时，也能照常合成诱导酶。※在生产中使用组成酶突变株时，可不必在发酵液中添加诱导物，且产生的诱导酶活性也比原菌株强。选育组成型突变株的方法，其主要原则是创造一种利于组成型菌株生长而不利于诱导型菌株生长的培养条件，造成对组成型的选择优势以及适当的识别两类菌落的方法，从而把组成型突变株选择出来。 例如: 把大肠杆菌半乳糖苷酶的诱导型菌株经诱变处理后，先在含乳糖的培养基中培养，由于组成型突变株半乳糖苷酶的合成不需诱导即能产生，因此可较诱导型的出发菌株较早开始生长，在一定时间内菌数的增加便较快。 如持续进行培养，由于诱导酶形成后，原菌株生长速率亦逐渐增加，这种选择性造成的差别就会减少。可用交替在乳糖、葡萄糖培养基中进行培养的方法。 两者利用葡萄糖时的生长速率是相同的，乳糖为碳源造成的组成型菌株的优势生长会持续下去。在平板上识别组成型突变株的方法，主要是利用在无诱导物存在时进行培养，它能产生酶，加入适当的底物进行反应显示酶活以识别。 通常使用酶解后可以有颜色变化的底物，便于迅速检出组成型菌落。如甘油培养基平板上培养大肠杆菌时，诱导型菌株不产酶，组成型菌株可产生半乳糖苷酶。菌落长出后喷布邻 29 第二章 微生物的代谢调控与代谢工程 硝基苯半乳糖苷，组成型菌株的菌落由于能水解它而呈现硝基苯的黄色，诱导型则无颜色变化。第三节 提高代谢产物产量的方法 一、提高初级代谢产物产量的方法 1、使用诱导物 与糖类和蛋白质降解有关的水解酶类大都属诱导酶类，因此向培养基中加入诱导物就会增加胞外酶的产量。 如加入槐糖(1，2-b-D-葡二糖)诱导木霉菌的纤维素酶的合成; 木糖诱导半纤维素酶和葡萄糖异构酶的生成。※但诱导物的价格往往比较贵，经济上未必合算。 ※如:槐豆荚等某些种子皮中含有槐糖 玉米芯富含木聚糖，培养过程中可陆续被水解产生 槐糖、木糖2、除去诱导物——选育组成型产生菌 在发酵工业中，要选择到一种廉价、高效的诱导物是不容易的;分批限量加入诱导物在工艺上也多有不便。 更为有效的方法是改变菌株的遗传特性，除取对诱导物的需要，即选育组成型突变株。使调节基因发生突变，不产生有活性的阻遏蛋白;或者 操纵基因发生突变不再能与阻遏物相结合，都可达到此目的。3、降低分解代谢产物浓度，减少阻遏的发生 高分子的多糖类、蛋白质等的分解代谢产物(如能被迅速利用的单糖、氨基酸及脂肪酸等)都会阻遏分解其聚合物的水解酶的生成。 采用限量流加这类物质或改用难以被水解的底物的方法，可减少阻遏作用的发生，而获得较高的酶产量。 4、解除分解代谢阻遏——筛选抗分解代谢阻遏突变株5、解除反馈抑制——筛选抗反馈抑制突变株 6、防止回复突变的产生和筛选负变菌株的回复突变株 诱变产生的高产菌菌，在生产过程中易于发生回复突变，使生产不稳定。双重营养缺陷型 产生回复突变的几率很小，易于获得遗传性较稳定的菌株 利用高产突变株对抗生素敏感性的不同，加适量抗生素防止回复株增殖，也是一种方法。 7、改变细胞膜的通透性 8、筛选抗生素抗性突变株抗生素作用机制多样 筛选抗生素抗性突变株，有可能改变代谢调节，获得过量生产的菌株。 例如 枯草杆菌的衣霉素抗性突变株的a-淀粉酶的产量较亲株提高了5倍。 这是由于分泌机制改变的结果(衣霉素可抑制细胞膜糖蛋白的生成) 9、选育条件抗性突变株其中温度敏感突变株常被用于提高代谢产物产量 如; 乳糖发酵短杆菌的温度敏感突变株，在30?生长良好，在37?生长微弱;但能在富含生物素的培养基中积累谷氨酸，而野生型菌株却受生物素的反馈抑制。在富含生物素的天然培养基中进行发酵时，可先在正常温度下进行培养以得到大量菌体，适当时间后提高温度，可获得谷氨酸的过量生产。10、调节生长速率在酶的诱导合成研究中发现，一些物质具有诱导效应及难被利用，与其只能维持较低的生长速率有关;而起阻遏作用的物质则都是易被利用和能维持高生长速率。 估计这是诱导、阻遏的发生都与产能代谢有关而造成的。 30 第二章 微生物的代谢调控与代谢工程 因此，改变培养条件如温度、供氧量等以控制生长速率，也能获得一定效果。11、加入酶的竞争性抑制剂单氟乙酸在微生物细胞内可转变为单氟柠檬酸，对乌头酸酶有竞争抑制作用。因此，向培养基中加入单氟乙酸可导致柠檬酸的积累，减少异柠檬酸的生成。提高次级代谢产物产量的方法 1、补加前提类似物如青霉素G的生产中，苯乙酰-CoA是限速因子 补加苯乙酸或其衍生物都能增加青霉素G的产量。 次级代谢产物形成中并不是所有前体类似物都是限速因子。加入前体提高产量的效果更取决于总体代谢的调节水平。2、加入诱导物把一些对次级代谢产物产生有诱导作用的物质加入发酵培养基中可增加产量。 如加蛋氨酸或硫脲可使顶头孢霉增产头孢霉素C3、防止碳分解代谢阻遏或抑制的发生 青霉素发酵中限量流加葡萄糖或糖蜜以减少碳分解阻遏的发生 ※使用寡糖、多糖等缓慢利用的碳源※加入影响糖代谢的硫氰酸苄酯可使金霉菌对葡萄糖的利用速度减慢，增加金霉素的产量4、防止氮代谢阻遏的发生 避免使用高浓度的铵盐作氮源以防止氮代谢阻遏的发生，是抗生素工业成熟的经验 5、筛选耐前体或前体类似物的突变株 加入前体有提高次级代谢产物产量的效果，但过量对菌体又会有毒害筛选对前体有抗性的突变株，可获得高产6、选育抗抗生素突变株 ※链霉素、氯霉素、金霉素等多种抗生素都具有抑制产生自身菌体蛋白的能力。 ※一株高产抗生素产生菌，必然应具备对自身所分泌的抗生素的抗性。 ※筛选抗抗生素产生菌也就成了菌种选育中常用的方法。7、筛选营养缺陷型的回复突变株 次级代谢产物都来自初级代谢产物，因此其营养缺陷型的产量一般都很低。 但其回复突变型中却有不少获得高产的例子，其机制尚不清楚，估计是次生产物或其前体合成的反馈抑制被解除。 第四节 代谢工程一、代谢工程概述1、代谢工程的基本定义代谢工程(Metabolic Engineering)——利用生物学原理，系统分析细胞代谢网络，并通过DNA重组技术合理设计细胞代谢途径及遗传修饰，进而完成细胞特性改造的应用性学科。 1974年，Chakrabarty在假单胞菌属的两个菌种中分别引入几个稳定的重组质粒，从而提高了对樟脑和萘等复杂有机物的降解活性。这是代谢工程技术应用的第一实例。 1991年 James E. Bailey (California Institute of Technology)首次使用该术语。又称途径工程(Pathway engineering)。 DNA重组等分子生物学技术的发展为代谢途径操作引入了崭新的理念和方法，它允许利用DNA重组技术修饰，甚至引入新的特定生化反应序列，以改善细胞的遗传特性，尤其是活性物质的生物合成过程。代谢工程的实质在于对代谢流量及代谢控制进行定量分析，在此基础上进行代谢改造，最大限度地提高目的代谢产物的产率。 2、代谢工程的基本过程 1)靶点设计正确的靶点设计还必须对现有的代谢途径和网络信息进行更深入的分析。 首先，根据化学动力学和计量学原理定量测定网络中的代谢流分布(即代谢流分析; Metabolic flux analysis, MFA)，其中最重要的是细胞内碳和氮元素的流向比例关系。 其次，在代谢流分析的基础上调查其控制状态、机制和影响因素(即代谢流控制分析;Metabolic flux control analysis, MCA)。 最后，根据代谢流分布和控制的分析结果确定途径操作的合理靶点。 通常包括拟修饰基因的靶点、拟导入途径的靶点或拟阻断途径的靶点等。 31 第二章 微生物的代谢调控与代谢工程 靶点设计对代谢工程的成败起着关键作用，任何精细的靶点选择都必须经得起细胞生理特性以及代谢网络热力学平衡的检验。 2) 基因操作利用代谢工程战略修饰改造细胞代谢网络的核心是在分子水平上对靶基因或基因簇进行遗传操作。 其中最典型的形式包括基因或基因簇的克隆、表达、修饰、敲除、调控以及重组基因在目标细胞染色体DNA上的稳定整合。 3)效果分析一次性的代谢工程设计和操作往往不能达到实际生产所要求的产量、速率和浓度，因为大部分实验涉及的只是单一代谢途径有关的基因、操纵子或基因簇的改变。 通过对新代谢进行全面的效果分析，这种由初步途径操作构建出来的细胞所表现出的限制与缺陷，可以作为新一轮实验的改造目标。 3、代谢工程的基本原理 代谢工程是多学科高度交叉的新型领域，涉及诸多基本原理: 1)涉及细胞物质代谢规律及途径组合的化学原理，它提供了生物体的基本代谢图谱和生化反应机制。 2)涉及细胞代谢流及其控制分析的化学计量学、分子反应动力学、热力学和控制学原理，这是代谢途径修饰的理论依据。 3)涉及途径代谢流推动力的酶学原理，包括酶反应动力学、别构抑制效应、修饰激活效应等。4)涉及基因操作与控制的分子生物学和分子遗传学原理，它们阐明了基因表达的基本规律，同时也提供了基因操作的一整套技术。 5)涉及细胞生理状态平衡的细胞生理学原理，它为细胞代谢机能提供了一个全景式的描述，因此是一个代谢速率和生理状态表征研究的理想平台。 6)涉及发酵或细胞培育的工艺和工程控制的生化工程和化学工程原理，它为速率过程受限制的系统分析提供了独特的工具和经验。 7)涉及生物信息收集、分析与应用的基因组学、蛋白质组学原理，为代谢途径设计提供信息，是代谢工程技术迅猛发展和广泛应用的最大推动力。 二、代谢工程的研究对象 简单地说，代谢工程的研究对象就是代谢网络 细胞分解代谢途径、合成代谢途径和膜传输系统的有序组合构成代谢网络。广义的代谢网络包括物质代谢网络和能量代谢网络。 代谢网络分流处的代谢产物称为节点(Node)。其中对终产物合成起决定作用的少数节点称为 主节点。主节点不是固定不变的。 1、代谢网络结构组成 代谢网络的组成取决于生物细胞的遗传性状及其所处的环境。 代谢网络主要由3部分组成:1)中心代谢途径 2)收敛途径:指向中心代谢途径，并以中心代谢途径中间化合物为接口的途径; 3)发散途径:以中心代谢途径的中间化合物为起点，并由中心代谢途径向周围分散的途径。 在一定环境条件下生长的生物细胞，其参与代谢的物质在代谢网络中遵循一定的规律流动，形成细胞的代谢流。代谢流具备流体流动的一些基本属性，如方向性、连续性、有序性、可控性等。在一定的生理生理条件下，碳架物质在微生物代谢网络中流经的主要途径称为载流途径。以特定的初级代谢产物为目的产物的工业发酵过程要求微生物在合成目的产物期间，尽可能使代谢物质相对集中地流经载流途径流向目的产物，形成代谢主流。代谢网络(途径)的延伸、剪接或重构均可能改变代谢主流，从而实现新基质的利用，新产品的产生及新生物合成路线的搭建。 2、代谢网络结构的基本类型 32 第二章 微生物的代谢调控与代谢工程 载流途径是代谢网络的组成部分，从某种水平上看，可以把载流途径的全部或局部看作一个亚网络。代谢网络和亚网络的结构可以抽象为两种基本类型:独立型和依赖型。 1)相依型网络 (依赖型网络) 如果网络或亚网络中的每一节点都依照化学计量规则将代谢物转化为终端产物的组成部分，那么这样的网络或亚网络就是相依型网络。 各分支途径的代谢流均需达到化学计量平衡，保证除终端产物之外的代谢物不累积不分泌;代谢网络中各主节点集中于产物;网络各主节点的重要性相同。 2)独立型网络 若由主要节点流出的代谢物不能完全合成终端产物，即代谢网络的主节点不集中，就属于独立型网络。 对于独立型网络，只要改变某一节点上的代谢物流量分配，就有可能提高终端产物的产率。 对于独立型网络而言，只要改变在某一节点上的代谢物流量分配，就有可能提高终端产物的产率。如图(参见课本)中节点1或2处的流量分配朝有利于产物P形成的方向改变，能在某种程度上提高其产率。但在相依型网络中，若要提高目标产物的转化率，这两个节点的流量分配则必须同时改变。 3、节点类型 根据网络节点处代谢物流量的调控机制和特性节点分为: 1)柔性节点 (flexible node)流量分配容易改变并满足代谢需求的一类节点.。 催化每一分支反应的酶对节点代谢物有相似的亲和力，所以各分支反应的速度是相近的。大多数情况下，分支途径的代谢流受所对应的末端产物的反馈调控; 节点的流量分割率可以从零变化到满足合成末端产物需求的水平。对于柔性节点，解除一个分支的反馈抑制可提高分支下游产物的产量。 柔性节点的主要特点是经受得起流量分配的改变, 因此许多企图增加产物产率的代谢修饰均建立在主要节点为柔性的基础之上。氨基酸生物合成途径中的许多分支节点均具有这种柔性,这对于利用代谢工程技术改良生产菌的品质是非常重要的.。 2) 刚性节点如果一各或多个途径的流量分割率受严格的控制，那么这类节点就称为刚性节点。 (参见课本图)代谢物P1和P2除了反馈抑制它们自身的合成外，在异构酶的作用下也对反向分支途径产生负调控作用。企图通过P2分支途径流量的减少来增加分支途径P1的流量分割率，其结果却由于丧失了P2的激活作用，P1的合成率也会减少。模拟实验表明,扩增P1途径的酶活性、解除P1 的反馈抑制、或者阻断P2的生成，节点N处流向P1分支途径的流量分割率均无影响。 刚性节点下游分支的比例(流量分配)是很难改变的，除非对其相关分支途径中的各种酶动力学特性进行全方位的修饰。 3) 半柔性节点流量分配由某一分支途径的动力学控制的一类节点。 占主导地位的分支途径称为优势分支途径 (如课本图中N?P); 催化优势分支反应2 的酶通常具有较高的活性，或者对节点代谢物呈现高亲和力，而且流向该分支反应的流量分配不受相应末端产物的反馈抑制调节。因此，即便从属分支途径是去调控的， 其流量分割率也不受相应末端产物的反馈控制，绝大部分的节点流量仍将流入优势分支。 半柔性节点在代谢途径中多见;这类节点的修饰也比较容易。 如在大肠杆菌中,位于乙醛酸支路和TCA循环的异柠檬酸分支点就是一典型的弱刚性节点。当向以乙酸为惟一碳源的培养基中加入葡萄糖时，即使乙醛酸支路有完整的活力，由其第一个酶异柠檬酸裂解酶控制的分支途径的流量也会降到零。在这种培养条件下，TCA循 33 第二章 微生物的代谢调控与代谢工程 环中有类似功能的异柠檬酸脱氢酶相对于异柠檬酸裂解酶表现出较高的活性，并完全控制节点的流量分配。 对于半柔性节点，只解除次要分支的反馈调节，对其下游产物的影响不大，必须降低主分支的酶活力或解除其反馈调节，才可提高次分支下游产物的产量。 三、代谢工程的应用 代谢工程的目的在于构建具有新的代谢途径，能生产特定目的产物或具有过量生产能力的工程菌应用于工业生产。 根据微生物的不同代谢特性，代谢工程的应用主要表现在以下三个方面:改变代谢途径、扩展代谢途径、构建新的代谢途径。1、变代谢途径即改变分支代谢途径的流向，阻断其他代谢产物的合成，达到提高目标产物的目的。可采用下列不同的方法: 1)加速限速反应将编码限速酶的基因通过基因扩增，增加在宿主中表达拷贝数，以提高目的产物的产率。 首先，须确定代谢途径中的限速反应及其关键酶;然后，将编码该酶的基因转入宿主，令其表达。 例如 头孢霉素C代谢工程菌码脱乙酰氧基头孢霉素C合成酶基因，导入顶头孢菌 所得转化子的头孢霉素C产量提高了25% 2)改变分支代谢途径途径流向提高代谢分支点的某一代谢途径酶系的活性，在与另外的分支代谢途径的竞争中占据优势，从而提高目的末端产物的产量。例如: 芳香族氨基酸合成途径中，色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸三条支路上，任一支路的酶活性被加强，其与另两条支路的竞争将占据优势。 从谷氨酸棒杆菌K86中提取质粒pCDtrp157, 该质粒带有DAHP合成酶基因和色氨酸合成酶基因。如将该质粒转化至谷氨酸棒杆菌JY9182 (Phe)，使该菌可产色氨酸1.1g/L。 又如:以解除了反馈抑制的赖氨酸产生菌棒状杆菌为宿主，转入高丝氨酸脱氢酶基因，结果使原来不产生苏氨酸的赖氨酸产生菌的赖氨酸产量由65g/L下降至4g/L，而苏氨酸产量达52g/L，使赖氨酸产生菌转变成苏氨酸产生菌。 3)构建代谢旁路大肠杆菌(工程菌)在以糖为碳源进行高密度培养中易产生乙酸，乙酸达一定浓度时，抑制细胞的生长。除通过工艺控制外，也可通过代谢工程方法控制乙酸的产生。 如:将枯草杆菌的乙酰乳酸合成酶基因克隆到大肠杆菌，明显地改变了代谢流，使乙酸浓度保持在不引起细胞中毒的浓度以下。也可将运动发酵假单胞菌的丙酮酸脱羧酶基因和乙醇脱氢酶基因克隆到大肠杆菌，使转化子 不产生乙酸而产生乙醇。因乙醇对大肠杆菌的毒性远比乙酸小。 4)改变能量代谢途径改变能量代谢途径或电子传递系统，影响或改变细胞的代谢流 如:将血红蛋白基因克隆到酿酒酵母中，由于表达的血红蛋白 存在，活跃了氧化还原过程的电子传递链，间接影响了线粒体的乙醛歧化途径;由于这条途径产生的乙醇占总量的1/3，因此可显著提高乙醇产量2、扩展代谢途径 引入外源基因后，使原来的代谢途径向后延伸，产生新的末端产物，或胡斯原来的代谢途径向前延伸，可以利用新的原料合成代谢产物。 如:啤酒酵母不能直接将淀粉转化为乙醇; 将a-淀粉酶基因转入啤酒酵母， 并使用毕氏酵母的抗乙醇阻遏的醇氧化酶基因启动子来表达该基因，则可生料发酵生产乙醇 3、转移或构建新的代谢途径将催化一系列生物反应的多个酶基因，克隆到不能产生某种新的化学结构的代谢产物的微生物中，使之获得产生新的化合物的能力;或利用基因工程手段， 34 第二章 微生物的代谢调控与代谢工程 克隆少数基因，使细胞中原来无关的两条途径联结起来，形成新的代谢途径，产生新的代谢产物;或将催化某一代谢途径的基因组克隆到另一微生物中，使之发生代谢转移，产生目的产物。 1)转移代谢途径 如将真养产碱菌的PHB 操纵子 (PHB 多聚酶、硫解酶、还原酶)克隆到大肠杆菌 2)构建新的代谢途径 如将碳霉素生物合成基因克隆到螺旋霉素产生菌二素链霉菌中，可以产生杂合抗生素4`-异戊酰螺旋霉素 35 第二章 微生物的代谢调控与代谢工程 36