基于生物转化的金针菇菌糠饲料的研制

基于生物转化的金针菇菌糠饲料研制 李楠 （淮阴工学院，江苏  淮安） 中图分类号：          文献标识号：          文章编号： 摘要：利用抗杂菌能力强的凝结芽孢杆菌预处理，利用产蛋白能力强的酵母菌菌种来对菌糠进行固态发酵，增加其蛋白含量并制成菌糠饲料。先将凝结芽孢杆菌接种到菌糠中进行预处理以去除霉菌等杂菌。应用响应面设计实验优化，接入酵母菌后进行固态发酵产蛋白，比较发酵前后菌糠中蛋白。调整其适口性和气味。通过响应面设计实验可以得出在温度为28℃，pH为5.0，接种量为30 %，氮源为尿素且接种量为0.4 %时。实验后的菌糠中蛋白质含量是最高的可分别达到21 %左右，发酵后抗性因子草酸为3.02 %，植酸为3.11 %，较适合于制成饲料。由本实验可知，酵母菌发酵可提高菌糠的蛋白质含量，使气味得到改善，而更适合动物食用。 关键词  生物转化；金针菇菌糠；响应面；饲料；固态发酵 Abstract With the pretreatment of Bacillus Condensation with strong anti - bacteria ability, the solid-state fermentation of chaff was made by yeast strain with strong protein production capacity, and the protein content was increased and the substrate feed was made. First, Bacillus Condensation was inoculated into fungus chaff to pretreat to remove the fungus. The solid state fermentation conditions were optimized by response surface design. the protein was produced by solid state fermentation after access to yeast, and the protein of spent substrate was compared before and after fermentation. Adjust palatability and odor. The response surface design experiment can be concluded that when the temperature is 28 ℃, ph is 5.0, inoculum size is 30 %, nitrogen source is urea and inoculation amount is 0. 4 %. The protein content of the spent substrate is up to 21 % after the experiment, the resistance factor after fermentation is 3.02 %, and the phytic acid is 3.11 %, which is suitable for making feed. From this experiment, yeast fermentation can improve the protein content of substrate, make the smell improve, and more suitable for animal food Keywords  Biotransformation ；Spent mushroom substrate；Response surface； Feed；Solid-state fermentation  菌糠中含有粗蛋白、粗纤维、粗脂肪，它们的适口性一般会比较差、这会对动物的吸收和消化产生一定的作用，因而菌糠通常都不会被用来直接制作成家畜的饲料。然而我们可以通过微生物来进行固态发酵，来研制出不同的微生物饲料添加剂，进而使饲料品质得到改善，将饲料中的蛋白质含量提高，以利动物的生长[1-3]。在本实验中应用到的技术主要有固态发酵和响应面的设计。选用新鲜菌糠通过预处理将凝结芽孢杆菌先接种培养以消除部分杂菌后加入酵母菌。运用凝结芽孢杆菌来进行预处理不仅可以避免用高温处理时高温可能会对菌糠中原有营养物质的损伤更能够在工厂处理时节约大量的能耗，因而可以大量节约工厂的生产成本[4]。运用了四因素三水平来设计出响应面的实验，优化菌株的固态发酵条件，以蛋白质含量为基准。以最优条件培养菌后，检验各成分的含量并在一定程度上改变其适口性，最终制成有益动物生长的可口饲料。 1  实验部分 1.1  实验材料与仪器试剂 1.1.1  菌株 凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans） 淮阴工学院生命科学与食品工程实验室保藏菌株 酵母菌酵母菌（Yeast） 淮阴工学院生命科学与食品工程实验室保藏菌株     1.1.2  培养基 LB培养基： 蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化钠10 g，水1 L，pH 7.0 PDA培养基： 200 g土豆、葡萄糖20 g、琼脂粉20 g、pH 7.0     1.1.3  主要设备仪器与耗材 名称 型号 厂家 电热恒温培养箱 DNP-9052 上海精宏实验设备有限公司 电热恒温鼓风干燥箱 DGG-9420A 上海森信实验设备有限公司 生物净化工作台 BCM-1000 苏州净化设备有限公司 紫外分光光度计 Spectru mlab 22PC 上海棱光技术有限公司 分析天平 FA2004 上海恒平科学仪器有限公司 电子天平 YP601N 上海精密科学仪器有限公司 电热恒温水浴锅 DK-98-1型 天津市泰斯特仪器有限公司 不锈钢立式灭菌消毒器 YM 上海三申医疗器械有限公司 冰箱 BCD-228D11SY 海信科龙电器股份有限公司 摇床 KCY 111 上海福马实验设备有限公司 微型旋涡混合仪 W h-3 上海沪西分析仪器厂有限公司 光学显微镜 Nikon YS100 上海长方光学仪器有限公司 pH计 pHSJ-4A 上海精密仪器有限公司 玻璃仪器 1000 mL、500 mL、250 mL锥形瓶，1000 mL、50 mL烧杯，5 mL、2 mL、1 mL、0.5 mL移液管，9cm平板，25 mL具塞比色管，小试管，50 mL量筒，1000μL、200μL、20μL移液枪       1.2  实验方法 1.2.1  活化培养 方法：在斜面上挑取凝结芽孢杆菌之后接种到LB培养基中，250 r/min摇床培养，  培养48 h。 在斜面上挑取酵母菌再接到PDA培养基中，250 r/min进行摇床培养，摇 床24 h。 1.2.2  菌株活性的检验 方法：分别取5g未经处理和经凝结芽孢杆菌处理过的菌糠，加入45 mL的水，分 别取0.2 mL涂布于PDA平板上培养48小时， 记录 混凝土 养护记录下载土方回填监理旁站记录免费下载集备记录下载集备记录下载集备记录下载 并比较霉菌数。 1.2.3  发酵设计 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 图1发酵设计 流程 快递问题件怎么处理流程河南自建厂房流程下载关于规范招聘需求审批流程制作流程表下载邮件下载流程设计 图 Fig. 1 Flow chart of fermentation design 1.2.4  菌糠中营养成分含量的测定 蛋白质含量的测定 方法：取1 g固体培养料置100 mL容量瓶中加20 mL水于60℃水浴锅中加15min 定容过滤，吸取2 mL，加2 mL考马斯亮蓝溶液混匀后测定[5-9]。595nm波长 下比色记录各管测定的吸光度值，并通过 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 曲线测得菌糠中蛋白质含量。  1.2.5  酵母菌固态发酵的优化 （1）  菌糠的预处理：根据吴德景[13]的研究显示在250 mL的三角锥瓶中可放置45g 的菌糠为佳，将凝结芽孢杆菌接种到新鲜菌糠,进行静置培 养。 （2）  接种所需菌株：取菌糠和水以1：1混匀，接种凝结芽杆菌后加入酵母菌，并 在恒温培养箱中进行固态发酵培养。 （3）  优化固态发酵条件：对氮源，pH，温度，酵母菌的接种量进行单因素实验作 为响应面实验中的水平，再采用响应面设计实验，确定 酵母菌固态发酵  产蛋白的最适温度（℃）、初始pH 值、接种量（%）和氮源。                      1.2.6  酵母菌固态发酵的单因素优化实验 本实验选取的氮源为尿素、大豆蛋白胨和硫酸铵。再进行pH，温度和接种量实验，选择较优的三个做响应面的条件。 ①  向菌糠中加入凝结芽孢杆菌，培养48小时后完成对菌糠的预处理。 ②  氮源：根据表1向预处理后的菌糠中加入适当的氮源，加入30 %的酵母菌，调 pH至5.0，放入28℃培养24小时。 表1 氮源的种类及添加量 Table 1  Type and amount of nitrogen source   尿素（%） 大豆蛋白胨（%） 硫酸铵（%） 添加量 0.2 0.75 1.0 0.3 1 1.5 0.4 1.25 2.0 0.5 1.5 2.5         ③  温度：向预处理后的菌糠中加入30 %的酵母菌和适当氮源，pH至5.0，分别24℃，26℃，28℃，30℃下培养，培养24 h。 ④  pH：向预处理后的菌糠中加入30 %的酵母菌和适当氮源，在28℃下，pH分别为4.0，4.5，5.0，5.5培养，培养24 h。 ⑤  接种量：向预处理后的菌糠中加入适当氮源，在28℃下，pH为5.0，分别接种20 %，25 %，30 %，35 %来进行培养，培养24 h。 ⑥  利用考马斯亮蓝法检测蛋白质的多少，比较得最优氮源，最佳接入量，pH，温度。 2.2.7  应用响应面法测定固态发酵的最优条件 表2  响应面分析因素和水平 Table 2  Response surface analysis factors and levels 因素 水平 -1 0 1 生长温度（℃） 26 28 30 初使pH值 4.5 5.0 5.5 接种量（%） 25 30 35 尿素（%） 3 4 5         根据响应面法得到的结果确定固态发酵的最优条件对酵母菌进行固态培养。以蛋白质含量作为响应值，再经回归拟合[10,11]。后各试验因子对响应值的影响可以用下列函数表现： Y=a0+a1X1+a2X2+a3X3+a4X4+a12X1X2+a13X1X3+a14X1X4+a23X2X3+a24X2X4+a34X3X4 +a11X12+a22X22+a33X32+a44X42 然后根据响应面分析结果绘出趋势图，确定最优条件。 1.2.8  抗性因子的消除 菌株的发酵在一定程度上对抗性因子的消除有很大的作用，本实验利用酵母菌在菌糠中的发酵作用减少草酸和植酸的抗性因子的作用。 (1)  草酸 原理:加入氨水后可以产生出草酸铵,而草酸铵又不溶与此，因而会产生出沉淀，之后加水溶解,再加入已经经过中和的甲醛,最后便可以利用氢氧化钠来滴定[15]。 方法：5g鲜样，用25 mL稀盐酸(6N)用研体匀质，转移到50 mL烧杯中，加两滴正辛醇，煮沸15 min。待温度至室温，移入到500 mL的容量瓶，并稀释到刻度处，放置过夜[12]。将内容物混和，滤纸过滤。吸移25 mL的滤液，移入到50 mL的锥形瓶中，加5 mL硝酸盐一磷酸试剂。混和加塞，静置5小时沉淀。 将内容物用定量滤纸过滤，至滤液清澈。吸取20 mL的滤液移取到50 mL的离心管中，逐滴加入氢氧化铵至出现轻微而持久的沉淀。保证pH在4.0-4.5之间，加入5 mL缓冲溶液，用玻棒搅拌，将离心管4℃静置过夜。离心5min后，用吸移管移去清液，再将沉淀物悬浮于20 mL过滤过的洗液中，再离心，尽可能移去上层清液[16]。用5 mL 10 %的硫酸溶液溶解沉淀物，定量地移溶液至50 mL的锥形烧瓶中，于沸水浴上加热5 min,在温度还高时，利用0.02 N高锰酸钾滴定溶液，直到溶液变为粉红色(而且要保持30 s内不褪色)。 样品中草酸（mg/g）=（V×（90/2000）×1000×c×500×30）/（m×20×25） 式中，V表示的是0.02 N的高锰酸钾溶液的体积( mL)，c则表示的是0.02 N的高锰酸钾溶液的精确的浓度，而m则是样品的质量，（90/2000）×1000则为草酸毫克数[14,15]。 (2) 植酸 原理： 植酸能够与Fe3+在低酸性下产生出稳固的配合物，如用标定的三氯化铁来滴定植酸，并以磺基水杨酸作为指示剂，当3价铁稍微有一些过量的时侯，从而会与磺基水杨酸产生出紫红色的化合物，这样就可以表现出此为滴定的终点。