[农林牧渔]兔羊养殖

[农林牧渔]兔羊养殖 (2)新型日粮配方在肉兔养殖中的应用效果 日增重、日采食量、料重比、体长，饲料转化率，皮张面积、胴体重、屠宰率，pH、失水率、熟肉率及嫩度。 (3)机理研究 ?肉兔肠道菌群变化规律研究及 内容 财务内部控制制度的内容财务内部控制制度的内容人员招聘与配置的内容项目成本控制的内容消防安全演练内容 物酸碱度测定 大肠杆菌活菌计数:伊红美兰培养基 成分:蛋白胨20g，乳糖10g，磷酸氢二钾2g，琼脂17g，2%伊红Y溶液20mL，0.65%美兰 溶液10mL，蒸馏水1000mL，pH7.1。 制法:将蛋白胨、磷酸氢二钾和琼脂溶解于蒸馏水中，校正pH，分装于烧瓶内，高压灭菌 121?，15min备用。 临用时，加入乳糖，并加热溶化琼脂，冷至50,55?，加入伊红和美兰溶液，摇匀，倾注平板 乳酸菌活菌计数:MRS培养基 成分:蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母粉5g，KHPO 2g，柠檬酸二铵2g，乙酸钠5g，葡萄24 糖20g，吐温80 1mL，MgSO4 .7HO 0.58g，MnSO 4HO 0.25g，(琼脂15~20g)，蒸242 馏水1000mL。 制法:将以上成分加入到蒸馏水中，加热使完全溶解，调pH至6.2~6.4，分装于三角瓶中， 121?,灭菌15min。 双歧杆菌活菌计数:BBL培养基 成分:蛋白胨15g，葡萄糖20g，酵母浸粉2g，可溶性淀粉0.5g，氯化钠5g，L-半胱氨酸0.5g， 番茄浸粉5g， 肝浸粉2g，琼脂20g，25? pH值7.0?0.1 用法:称取本品 70.0g，再吸取吐温80 1ml，加热溶解于 1000ml蒸馏水中，分装三角瓶，115? 高压灭菌 20 分钟备用。 芽孢杆菌活菌计数:加热处理后NA培养基计数 ，蛋白胨5g，葡萄糖2.5g，琼脂18g，25? pH值 7.0?0.1 成分:牛肉浸膏3g 用法:称取本品 28.5g，加热溶解于1000ml蒸馏水中，分装，121?高压灭菌15分钟，备用。 内容物道酸碱度的测定 将雏鸡肠道内容物约1g置于EP管中加蒸馏水至1mL，离心沉淀并将上清液取出稀释至20mL，用数显笔式pH计分别测定十二指肠、空肠、回肠、盲肠及粪便内容物稀释液的pH值并 记录 混凝土 养护记录下载土方回填监理旁站记录免费下载集备记录下载集备记录下载集备记录下载 结果。 ?肉兔胃及肠道中各种消化酶的变化规律研究 1 对供试肉兔胃及肠道内容物进行淀粉酶、糖化酶、木聚糖酶、蛋白酶、脂肪酶、植酸酶、纤维素酶、木质素酶活力测定，拟采用的方法如下: 1.蛋白酶活力测定方法:福林法 SB/T10317-1999; 1.1 试剂及溶液:以下试剂都为分析纯 ):于2000 mL磨口回流装置内,加入钨酸钠(NaWO?2HO) 100 g，1.1.1 福林试剂(Folin试剂242钼酸钠(NaMoO?2HO)25 g，蒸馏水700 mL，85%磷酸50 mL，浓盐酸100 mL，文火回流242 h。 取去冷凝器，加入硫酸锂(LiSO)50 g，蒸馏水50 mL，混匀，加入几滴液体溴，再1024 煮沸15 min，以驱逐残溴及除去颜色，溶液应呈黄色而非绿色。若溶液仍有绿色，需要再加几滴溴液，,再煮沸除去之。冷却后,定容至1000 mL，用细菌漏斗(No,5)过滤，置于棕4色瓶中保存。此溶液使用时加2倍蒸馏水稀释。即成已稀释的福林试剂。 1.1.2 0.4 mol碳酸钠溶液:称取无水碳酸钠(NaCO)42.4 g，定容至1000 mL。 23 1.1.3 0.4 mol三氯乙酸(TCA)溶液:称取三氯乙酸(CClCOOH)65.4 g，定容至1000 mL。 3 1.1.4 pH7.2磷酸盐缓冲液:称取磷酸二氢钠(NaHPO?2HO)31.2 g，定容至1000 mL，即成0.2 242 mol溶液(A液)。称取磷酸氢二钠(NaHPO?12HO)71.63 g，定容至1000 mL，即成0.2 mol242 溶液(B液)。 取A液28 mL和B液72 mL，再用蒸馏水稀释1倍，即成0.1 mol pH7.2的磷酸盐缓冲液。 1.1.5 2% 酪蛋白溶液:准确称取干酪素2 g，称准至0.002 g，加入0.1N氢氧化钠10 mL，在水浴中加热使溶解(必要时用小火加热煮沸)，然后用pH7.2磷酸盐缓冲液定容至100 mL即成。配制后应及时使用或放入冰箱内保存，否则极易繁殖细菌，引起变质。 1.1.6 100 μg/mL酪氨酸溶液:精确称取在105?烘箱中烘至恒重的酪氨酸0.1000 g，逐步加入6 mL 1N盐酸使溶解，用0.2N盐酸定容至100 mL,其浓度为1000μg/mL，再吸取此液10 mL，0.2N盐酸定容至100 mL，即配成100 μg/mL的酪氨酸溶液。此溶液配成后也应及时使用或放入冰箱内保存，以免繁殖细菌而变质。 1.2 仪器 a. 分析天平:感量0.1mg; b. 581-G型光电比色计或72型分光光度计; c. 水浴锅; d. 1、2、5、10 mL移液管等。 1.3 操作 1.3.1 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 曲线的绘制 2 1.3.1.1 按下表配制各种不同浓度的酪氨酸溶液(表1)。 管号 试剂 1 2 3 4 5 6 蒸馏水，mL 10 8 6 4 2 0 100μg/mL 酪氨酸，mL 0 2 4 6 8 10 酪氨酸最终浓度，μg/mL 0 20 40 60 80 100 1.3.1.2 测定步骤:取6支试管编号按表1分别吸取不同浓度酪氨酸1 mL，各加入0.4mol碳酸钠5 mL。摇匀置于水浴锅中。40?保温发色20 min在581-GmL，再各加入已稀释的福林试剂1 型光电比色计上分别测定光密度(OD) (滤色片用65**#)或用72型分光光度计进行测定(波长660 nm)。一般测三次，取平均值。将1,6号管所测得的光密度(OD)减去1号管(蒸馏水空白试验)所测得的光密度为净OD数。 为了清楚起见。再列出表格如下(表2)。 表 2 试剂 管号 按表1制备的不同 1 2 3 4 5 6 浓度酪氨酸，mL 1 1 1 1 1 1 0.4mol/L NaCO，23 mL 5 5 5 5 5 5 福林试剂，mL 1 1 1 1 1 1 1 2 OD值 3 平均 0 净OD值 以净OD值为横坐标,酪氨酸的浓度为纵坐标,绘制成标准曲线(或可求出每度OD所相当的酪氨酸量K)。 1.3.2 样品稀释液的制备 1.3.2.1 测定酶制剂:称取酶粉0.100g，加入pH7.2磷酸盐缓冲液定容至100mL，吸取此液5mL，再用缓冲液稀释至25mL，即成5000倍的酶粉稀释液。 1.3.2.2 测定成曲酶:称取充分研细的成曲5g，加水至100 mL，在40?水浴内间断搅拌1 h， 3 过滤，滤液用0.1 mol pH 7.2磷酸盐缓冲液稀释到一定倍数(估计酶活力而定)。 1.3.3 样品测定:取15×100 mm试管3支，编号1、2、3(做2只也可)，每管内加入样品稀释液1 mL，置于40?水浴中预热2 min，再各加入经同样预热的酪蛋白1 mL，精确保温10 min，时间到后,立即再各加入0.4 mol三氯乙酸2 mL，以终止反应，继续置于水浴中保温20 min，使残余蛋白质沉淀后离心或过滤，然后另取15×150 mm试管3支，编号1、2、3，每管内加入滤液1 mL，再加0.4 mol碳酸钠5 mL，已稀释的福林试剂1 mL，摇匀，40?保温发色20 min后进行光密度(OD)测定。 空白试验也取试管3支，编号(1)、(2)、(3),测定方法同上，唯在加酪蛋白之前先加0.4 mol三氯乙酸2 mL，使酶失活，再加入酪蛋白。 为了清楚起见，分别列出表格于下(见表3及表4)。 表3 管号 管号 试剂 试剂 (1) (2) (3) 1 2 3 预热酶液，mL 预热酶液，mL 1 1 1 1 1 1 0.4 mol三氯乙 预热2%酪蛋白，mL 1 1 1 2 2 2 酸，mL 作用10 min(精 作用10 min(精确计时) 确计时) 预热2%酪蛋0.4 mol三氯乙酸， 2 2 2 1 1 1 白，mL mL 表4 管号 试剂 (1) (2) (3) 1 2 3 滤液，mL 1 1 1 1 1 1 0.4 mol NaCO，mL 5 5 5 5 5 5 23 福林试剂，mL 1 1 1 1 1 1 OD值 平均OD值 4 净OD值 0 样品的平均光密度(OD)一空白的平均光密度(OD)=净OD值。 1.4 计算 在40?下每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸,定义为1个蛋白酶活力单位 式中:A——由样品测得OD值,查标准曲线得相当的酪氨酸微克数(或OD值×K); 4——4毫升反应液取出1 mL测定(即4倍); N——酶液稀释的倍数; 10——反应10 min; W——样品水分百分含量。 1.5 注意事项 以上介绍的方法用于测定中性蛋白酶(pH7.2)。若要测定酸性蛋白酶或碱性蛋白酶，则把配制酪蛋白溶液和稀释酶液用的pH缓冲液换成相应pH缓冲液即可。现把几种常用pH缓冲液配方提供如下: 1.5.1 pH7.5磷酸盐缓冲液(0.02 mol/L) 称取磷酸氢二钠(NaHPO?12HO)6.02g和磷酸二氢钠 (NaHPO?2HO)0.5 g以蒸馏水溶242242 mL。 解定容至1000 1.5.2 pH 2.5乳酸-乳酸钠缓冲液(0.05 mol) A 液:称取80%—90%乳酸10.6 g，加蒸馏水稀释定容至1000 mL。 B 液:称取70%乳酸钠16 g，加水稀释定容至1000 mL。 取A液16 mL与B液1 mL混合稀释一倍即成。 1.5.3 pH 3.0乳酸-乳酸钠缓冲液 (0.05 mol) A 液:称取80%—90%乳酸10.6 g，以水定容至1000 mL。 B 液:称取70%乳酸钠16 g，蒸馏水溶解定容至1000 mL。 取A液8 mL与B液1 mL，混合稀释一倍即成。 1.5.4 pH10硼砂-氢氧化钠缓冲液 A 液:称取硼砂19.08 g，用蒸馏水溶解定容至1000 mL (0.05 mol)。 B 液:称取氢氧化钠8 g，用蒸馏水溶解定容至1000 mL (0.2N)。 取A 液250 mL，B 液215 mL混合，用蒸馏水稀释定容至1000 mL即成。 5 1.5.5 pH 11.0硼砂-氢氧化钠缓冲液 A 液:称取硼砂19.08 g，用蒸馏水定容至1000 mL。 B 液:称取氢氧化钠4 g，用蒸馏水定容至1000 mL。 取A液与B液等量混合。 1.5.6 2%酪蛋白溶液配成酸性时，须先加数滴浓乳酸，使之湿润以加速其溶解。 2.β-葡聚糖酶活力的测定方法:分光光度法 NY/T911-204; 2.1试剂: 称取:冰乙酸钠23.14 g，加入冰乙酸1.70 mL，再加水溶解，定容至2000 mL，测定溶液的pH，如果pH偏离5.5，再用乙酸溶液或乙酸钠溶液调节至5.5。 2.1.1 葡萄糖溶液，浓度c(CHO)为10.0 mg/ml 6126 称取无水葡萄糖1.000 g，加乙酸—乙酸钠缓冲溶液溶解，定容至100mL。 2.1.2 β-葡聚糖溶液，浓度为8.0 g/L 称取β-葡聚糖0.40 g，加入乙酸5.0 mL润湿β-葡聚糖，再加入40 mL乙酸—乙酸钠缓 冲溶液磁力搅拌，同时缓慢加热，直至β-葡聚糖完全溶解。(注:在搅拌加热的过程中，可以补加适量的缓冲液，但是溶液的总体积不能超过50 mL)然后，停止加热，继续搅拌30 min，用乙酸—乙酸钠缓冲液定容至50 mL，β-葡聚糖溶液能立即使用，使用前适当摇匀。4?避光保存，有效期为3 d。 冷却保存，有效期为2 个月(使用前在4?条件下解冻)。 2.1.3 DNS试剂 称取3,5-二硝基水杨酸3.15 g(化学纯)，加水500 mL，搅拌5 s，水浴至45?。然后，逐步加入100 mL氢氧化钠溶液，同事不断搅拌，直至溶液清澈透明(注意:在加入氢氧化钠过程中，溶液温度不要超过48?)。再逐步加入四水酒石酸钾钠91.0 g、苯酚2.50 g和无水亚硫酸钠2.50 g。继续45?水浴加热，同时补加水300 mL，不断搅拌，直到加入的物质完全溶液。停止加热，冷却至室温后，用水定容至1000 mL。用烧结玻璃过滤器过滤。取滤液，储存在棕色瓶中，避光保存。室温下存放7 d后可以使用，有效期为6个月。 2.2 仪器与设备 ?分子筛 孔径为0.25 mm(60目) ?分析天平 感量0.001 g ?pH计 精确至0.01 ?磁力搅拌器 ?电磁振荡器 6 ?烧结玻璃过滤器 孔径为0.45μm ?离心机 3000 r/min ?恒温水浴锅 温度控制范围在30?—60?之间，精度为0.1? ?秒表 ?分光光度计 能检测350 nm—800 nm的吸光度范围 2.3 标准曲线的绘制 吸取乙酸—乙酸钠缓冲液4.0 mL，加入DNS试剂5.0 mL，沸水浴加热5 min。用自来水冷却至室温，用水定容至25.0 mL，制成标准空白样。 分别吸取葡萄糖溶液1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL、5.00 mL、6.00 mL和7.00 mL，分别用缓冲液定容至100 mL，配制成浓度0.10 mg/mL—0.70 mg/mL葡萄糖标准液。 分别吸取上述浓度系列的葡萄糖标准溶液各2.00 mL(做2个平行)，分别加入到刻度试管中，再分别加入2.0 mL，缓冲液和5.0 mL DNS试剂。电磁震荡3 s，沸水浴加热5 min。然后，用自来水冷却到室温，再用水定容至25 mL。以标准空白样为对照调零，在540 nm处测定吸光度OD值。 以葡萄糖浓度为Y轴、吸光度OD为X轴，绘制标准曲线。每次新配制DNS试剂均需要重新绘制标准曲线。 2.4 试样溶液的制备 固体样品应粉碎或充分碾碎，然后过60目筛(孔径为0.25 mm)，按照附录A中建议的称样量称取试样2份，精确至0.001 g。加入40 mL乙酸—乙酸钠缓冲溶液。磁力搅拌30 min，再用缓冲溶液定容至100 mL，在4?条件下避光保存24 h。上离心机离心3 min，取上清液，再用缓冲溶液做适当稀释(稀释后的待测酶液中β-葡聚糖酶活力最好能控制在0.04 U/mL—0.08 U/mL之间)。 液体样品可以直接用乙酸—乙酸钠缓冲溶液进行稀释、定容(稀释后的酶液中纤维素酶活力最好能控制在0.04 U/mL—0.08 U/mL之间)。如果稀释后酶液的pH偏离5.5，需要用乙酸溶液或乙酸钠溶液调节校正至5.5，然后再用缓冲溶液做适当稀释定容。 2.5 测定步骤 吸取10.0 mL β-葡聚糖溶液，37?平衡20 min。 吸取10.0 mL经过适当稀释的酶液，37?平衡10 min。 吸取2.00 mL经过适当稀释的酶液(已经过37?平衡)，加入到刻度试管中，再加入5 mL DNS试剂，电磁振荡3 s。然后加入2.0 mL β-葡聚糖溶液，37?平衡30 min，沸水浴加热5 min。用自来水冷却至室温，加水定容至25 mL，电磁振荡3 s。以标准空白样为空白对照，在540 nm 7 处测定吸收度A。 B 吸取2.00 mL经过适当稀释的酶液(已经过37?平衡)，加入到刻度试管中，再加入2.0 mL β-葡聚糖(已经过37?平衡)，电磁振荡3 s，37?精确保温30 min。加入5.0 mL DNS试剂，电磁振荡3 s，以终止酶解反应。沸水浴加热5 min，用自来水冷却至室温，加水定容至25 mL，电磁振荡3 s。以标准空白样为空白对照，在540 nm处测定吸光度A。 E 2.6 试样酶活力按式(1)、式(2)计算 式中:X—试样稀释液的β-葡聚糖酶活力，单位为酶活力单位每毫升(U/mL); D A—酶反应液的吸光度; E A—酶空白样的吸光度; B K—标准曲线的斜率; C—标准曲线的截距; O M—葡萄糖的摩尔质量M(CHO)=180.2 g/mol ; 6126 t— 酶解反应时间，单位为分钟(min); 1000—转化因子，1 nmol=1000μmol; X值应在0.04 U/mL—0.08 U/mL之间，如果不在这个范围内，应重新选择酶液的稀D 释度，在进行分析测定。 X—试样中β-葡聚糖酶的活力，单位为酶活力单位每克(U/g); D—试样的稀释倍数。 f 酶活力的计算值保留3位有效数字。 2.7 重复性 每个试样应取2份平行样进行分析测定，相对误差不超过8.0%，二者的平均值为最终的酶活力测定值(保留3位有效数字)。 附录A ( 资料 新概念英语资料下载李居明饿命改运学pdf成本会计期末资料社会工作导论资料工程结算所需资料清单 性附录) 建议称样量 β-葡聚糖酶活力，U/g 称样量，g 2000 0.1—0.2 8 500—2000 0.2—0.5 200—500 0.5—1.0 50—200 1.0—2.0 10—50 1.0—5.0 1—10 5.0—10.0 3.植酸酶活力的测定:分光光度法 GB/T 18634-2009; 3.1 试剂和材料 除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。清洗试验用器皿不要用含磷清洗剂。 ? 磷酸二氢钾:基准物。 ? 乙酸缓冲液(1)，c(CHCOONa)=0.25 mol/L:称取20.52 g无水乙酸钠于1000 mL烧杯3 中，加入900 mL水搅拌溶解，用冰乙酸调节pH至5.50?0.01，在转移至1000 mL容量瓶中，并用蒸馏水定容至刻度。室温下存放2个月内有效。 ?乙酸缓冲液(2)，c(CHCOONa)=0.25 mol/L:称取20.52 g无水乙酸钠，0.5 g曲拉通X—1003 (Trion X—100)，0.5 g牛血清蛋白(BSA)于1000 mL烧杯中，加入900 mL水搅拌溶解，用冰乙酸调节pH至5.50?0.01，在转移至1000 mL容量瓶中，并用蒸馏水定容至刻度。室温下存放2个月内有效。 ? 底物溶液，c(CHOPNa)=7.5 mmol/L:称取0.69 g植物钠(CHOPNa，相对分56246125624612子质量为923.8，纯度为95%)，精确至0.1 mg，置于100 mL烧杯中，用约80 mL乙酸缓冲液(2)溶解，用冰乙酸调节pH至5.50?0.01，转移至100 mL容量瓶中，并用乙酸缓冲液(2)定容至刻度，现在现配(实际反应液中的最终浓度为5.0 mmol/L)。 ? 硝酸溶液:1+2水溶液。 ? 钼酸铵溶液，100 g/L:称取10 g钼酸铵[(NH4)MoO?4HO]于50 mL烧杯中加水溶解，67242 必要时可微加热，再转移至100 mL容量瓶中，加入1.0 mL氨水(25%)用水定容至刻度。 ?偏钒酸铵溶液，2.35 g/L:称取0.235 g偏钒酸铵(NHVO)于50 mL烧杯中，加入2 mL43 硝酸溶液(?)及少量水，并用玻璃棒研磨溶解，在转移至100 mL棕色容量瓶中，用谁定容至刻度。避光条件下保存一周内有效。 ? 酶解反应终止及显色液:移取2份硝酸溶液(?)，1份钼酸铵溶液(?)，1份偏钒酸铵溶液(?)混合后使用，现用现配。 3.2 仪器和设备 9 ? 分析天平:感量0.1 mg ? 恒温水浴:37??0.1? ? 分光光度计:有10 mm比色皿，可在415 nm下测定吸光度 ? 磁力搅拌器 ? 涡流式混合器 ? 酸度计:pH精确至0.01 离心机:转速为4000 r/min ? ? 超声波溶解器 ? 回旋式振荡器 3.3 试样制备 3.3.1 固体样品 按GB/T 14699.1的规定进行采样，选取有代表性样品，用四分法将试样缩分至100 g，植酸酶产品不需粉碎，配合饲料需粉碎通过0.45 mm标准筛，装入密封容器，防止试样成分变化。 3.3.2 液体样品 按GB/T 14699.1的规定进行采样，选取有代表性样品用前摇匀。 3.4 测定步骤 3.4.1 标准曲线 准确称取0.6804 g在105?烘至恒重的基准磷酸二氢钾于100 mL容量瓶中，用乙酸缓冲液溶解，并定容至刻度，浓度为50.0 mmol/L。按表1的比例用乙酸缓冲液稀释成不同浓度，与待测试样一起反应测定。以无机磷的量为横坐标，吸光值为纵坐标，列出直线回归方程(y=a+bx)。 表1 标准稀释比例 标准溶液序号 稀释量/mL 溶液/(μmol/mL) 1 0.5?16 1.5625 2 0.5?8 3.1250 3 0.5?4 6.2500 4 0.5?2 12.500 5 0.5?1 25.000 3.4.2 试样溶液的制备 3.4.2.1 酶制剂样品中酶的提取 10 参照附录A中建议的称样量称取植酸酶试样两份，精确至0.0001 g，置于100 mL容量瓶中，加入乙酸缓冲液(2)摇匀并定容至刻度。放入一个磁力棒，在磁力搅拌器上高速搅拌30 min。或在超声波溶解器上超声溶解15 min，再放入回旋式振荡器中振荡30 min。 3.4.2.2 加酶饲料样品中酶的提取 称取添加植酸酶的饲料试样两份，精确至0.0001 g，置于200 mL刻度锥形瓶中，加入乙酸缓冲液(2)100.0 mL.在超声波溶解器上超声溶解15 min，在放入回旋式振荡器中振荡30 。 min 所有提取后的试样必要时在离心机上以4000 r/min离心10 min。分取不同体积的上清液用乙酸缓冲液(2)稀释，使试样溶液的浓度保持在0.4 U/mL左右，待反应。 建议在测定样品时附加一个已知活性的植酸酶参考样，便于检验整个操作过程是否有偏差。 3.4.3 反应 取10 mL试管按下面的反应顺序进行操作，标准空白加入0.2 mL乙酸缓冲液(2)。在反应过程中，从加入底物溶液开始，向每支试管中加入试剂的时间间隔要一致，在恒温水浴中37?水解30 min。 反应步骤及试剂、溶液用量见表2. 表 2 反应步骤及试剂、溶液用量 反应顺序 样品、标准 样品空白 1.加乙酸缓冲液 1.8 mL 1.8 mL 2.加入待反应液 0.2 mL 0.2 mL 3.混合 ? ? 4.水浴中37?预热5 min ? ? 5.依次加入底物溶液 4 mL 4 mL(第二步) 6.混合 ? ? 7.水浴中37?水解30 min ? ? 8.依次加入终止及显色液 4 mL 4 mL(第一步) 9.混合 ? ? 总体积 10 mL 10 mL 3.4.4 样品测定 反应后的试样在室温下静置10 min，入出现混浊需在离心机上以4000 r/min离心10 min，上清液以标准曲线的空白调零，在分光光度计415 nm波长处测定试样空白(A)和试样溶液0 11 (A)的吸光值，A—A为实测吸光值。用直线回归方程计算植酸酶的活性。 0 3.5 结果计算和表示 3.5.1 结果计算 试样中植酸酶活性以X表示，单位为酶活性单位每克(U/g)或酶活性单位每毫克(U/mL)，按下式计算: y X= ×n m×t 式中:X—试样中植酸酶的活性，单位为酶活性单位每克(U/g)或酶活性单位每毫克 (U/mL); y—根据实际样液的吸光值由直线回归方程计算出的无机磷的量，单位为微摩尔 (μmol); t—酶解反应实际，单位为分钟(min); n—试样的稀释倍数; m—试样的量，单位为克(g)或毫升(mL)。 3.6 结果表示 两个平行试样的测定结果用算式平均值表示，酶制剂样品保留整数，加酶饲料样品保留三位有效数字。 3.7 重复性 同一试样两个平行测定值的相对偏差，植酸酶产品不大于8%，添加植酸酶的各种饲料样品不大于15%。 附录A (资料性附录) 建议称样量 根据样品植酸酶活性的不同，建议称样量见表A.1 植酸酶活性/(U/g) 称样量/g 5000以上 0.1—1 1000—5000 0.2—1 500—1000 1—2 1—500 2—5 0.13—1 5—10 12 4.α-淀粉酶活性的测定:比色法 GB/T 5521-2008; 4.1 试剂和材料 除非另有说明，所有试剂均为分析纯。实验用水符合GB/T 6682中三级水的要求。 ? 碘，碘化钾，氯化钙，无水乙酸钠，硫酸，冰乙酸，浮石粉; ? 可溶性淀粉 注:可采用Lintner淀粉或质量相当的国产可溶性淀粉。 碘贮备液:称取11.0 g碘化钾荣誉少量水中，加5.50 g结晶碘，搅拌至碘完全溶解。再定? 容至250 mL，置于棕色瓶中，在暗处贮存，此溶液可保存一个月。 ? 碘稀释液:称取40.0 g碘化钾于水中，加4.00 mL碘贮备液，并稀释至1 L，用时现配， 不可过夜。 ? 硫酸溶液:c(HSO)=0.05 mol/L. 24 ? 缓冲液:称取164 g无水乙酸溶于水中，加入120 mL冰乙酸，用水定容至1 L.。 ? 氯化钙溶液:c(CaCl)=0.2%。 2 ? β-淀粉酶溶液:称取10 g有酶活性的黄豆粉(粗细度为通过1.5 mm孔筛)，加入85 mL水 和15 mL 0.05 mol/L硫酸充分搅匀，静置15 min，抽滤，该滤液即为β-淀粉酶溶液。 ? β-极限糊精溶液:称取5.00 g(干基)可溶性淀粉于小烧杯中，加入约20 mL水混匀，将 其边搅拌边缓慢倒入盛有100 mL沸水的500 mL高型烧杯中，并用洗瓶将小烧杯中的淀 粉全部转移至高型烧杯中，继续搅拌并加热，缓慢煮沸2 min。加盖表面皿，在自来水中 冷却至30?一下，加入25 mL缓冲溶液及50 mL β-淀粉酶溶液，在室温下放置20 h，加 入1勺浮石粉，将此溶液在10 min之内缓慢煮沸，然后继续沸腾5 min以上。冷却至30? 以下，用水定容至250 mL，摇匀，过滤。滤液中加几滴甲苯，此溶液的pH值应为(4.7?0.1)， 在25?以下可连续使用5天。 4.2 仪器 ? 恒温水浴:30??0.2?与20??0.1?各1台。 ? 分光光度计或比色计。 ? 秒表 ? 筛:孔径为1.0 mm、1.5 mm。 ? pH计。 ? 烧杯及高型烧杯:100 mL、250 mL、500mL。 ? 容量瓶:250 mL、1000 mL ? 锥形瓶:300 mL。 13 ? 移液管:5 mL、20 mL。 ? 分析天平:分度值0.01 g 4.3 操作步骤 4.3.1 分光光度计及其空白调整 将分光光度计连接稳压电源，预热20 min，调整波长为575 nm。将2.0 mL氯化钙溶液加到10.0 mL碘稀释液中，然后以适量的水(V)稀释(加水量一般为20 mL—40 mL，V00详见4.3.1)，混匀后置于20?水浴中，用1 cm比色皿进行测试，调节仪器狭缝宽度，使吸光度为零。 4.3.2 底物溶液的校准 分别吸取5.0 mL β-极限糊精溶液和15.0 mL氯化钙溶液于一个100 mL烧杯中，混匀。取出2.0 mL混合液至另一个100 mL烧杯中，加入10.0 mL碘稀释液和适量的水，混匀后置于20?水浴中，用1 cm比色皿在波长575 nm处，以4.3.1所用溶液为参比，测其吸光度。调整加水量，使测得的吸光度在0.55—0.60之间，如果测得吸光度大于0.60则增大加水量，如果测定值少于0.55则减少加水量。通过反复试配，直至测定的吸光值在0.55—0.60之间，记下此时的加水量(V)，并用它调整空白溶液的加水量，V即为该β-极限糊精测试时的加水00 量。 4.3.3 提取 称取谷物样品约5 g(精确到0.05 g)，倒入300 mL锥形瓶中，加入预热到30?的氯化钙溶液100 mL?0.5 mL，充分摇匀，置于30?的恒温水浴中。在15 min、30 min、45 min时从水浴中取出，上下点到锥形瓶10次，重新置于水浴，共提取60 敏。取出锥形瓶并过滤，滤液即为α-淀粉酶的提取液。 4.4 活性测定 将α-淀粉酶的提取液和β-极限糊精溶液置于30?水浴中预热，10 min后用快速移液管吸移5.0 mLβ-极限糊精溶液至盛有15.0 mL酶提取液的锥形瓶中，加塞后摇匀。在加液的同时，用秒表计时。吸取10.0 mL稀碘溶液于各个50 mL容量瓶中，加入VmL水，混匀加塞后置0 于20?水浴中，每隔5 min或10 min进行下列操作: ? 吸取2.0 mL酶、β-极限糊精混合液到一个盛有稀碘溶液和VmL水的容量瓶中，摇0 匀后置于20?水浴中，使混合溶液温度达到20?; ? 倒入比色皿测其吸光度。 4.5 结果计算 试样的α-淀粉酶活性按式(1)计算: 14 式中:A—α-淀粉酶活性，以U(单位)计; m—100 mL氯化钙提取的试样质量，单位为克(g); h—试样中水分含量(以质量分数计)，%; f—酶提取液的稀释倍数; t、t—不同的反应时间，单位为分(min); 12 D、D—时间t、t时的吸光度; 1212 b—lgD对t曲线的斜率的绝对值; 500—系数。 4.6 精密度 同一样试样，在同一实验室同时或连续两次测定结果之差，不得超过平均值的10%，如果两次测定结果符合要求，则取结果的平均值。按表1修约: 表1 结果表示方式 活性/U(单位) 修约成整数范围/U(单位) ，50 0.1 50—500 1 500—5000 10 5000—50000 100 注1:测定过程中应合理调整酶的浓度，使35%—60%的β-极限糊精在15 min内降解，即最 后测得的吸光度为底物校准时吸光度的40%—65%。如果吸光度降得太快，则酶液可 用0.2%的氯化钙溶液再稀释。如酶的活性太低，为获得正确结果，可将反应时间延长 到60 min以上。 注2:用分光光度计测定吸光度时，溶液温度对结果又影响，必须控温在20?。在4.4的操 作中，从显色到测定吸光度的间隔时间一般对结果没有影响，如测定一系列样品，可 在所以样品均完成显色后再一起测定测定吸光度。但最长间隔时间不得超过1 h。 5.饲用纤维素酶活力的测定:滤纸法 GB/T 23881-2009; 5.1 试剂和材料 本标准使用的试剂均为分析纯，水均为符合GB/T 6682中规定的二级水。 ? 酒石酸钾钠(CHKNaO?4HO). 4462 15 ? 苯酚。 ? 亚硫酸钠。 ? 氢氧化钠溶液(200 g/L):称取氢氧化钠20.0 g，加100 mL水溶解。 ? 柠檬酸溶液(0.1 mol/L):称取柠檬酸(CHO?HO)2.10 g，加水溶解定容至100 mL. 6872 ? 柠檬酸钠溶液(0.1 mol/L):称取柠檬酸钠(NaCHO?2HO)2.94 g，加水溶解定容36572 至100 mL。 ? 柠檬酸盐缓冲液(0.05 mol/L，pH5.5):称取柠檬酸(CHO?HO)10.5 g，加入氢氧6872 化钠5.0 g，再加800 mL水溶解，用柠檬酸溶液或柠檬酸钠溶液调节pH至5.5，再用 水定容至1000 mL。 ? Whatman 1号滤纸条(1.0 cm×6.0 cm)。 ? DNS试剂:称取3,5-二硝基水杨酸3.15 g，加水500 mL搅拌溶解，水溶至45?，然 后逐步加入氢氧化钠溶液100 mL，同时不断搅拌，直至完全溶解，再逐步加入酒石 酸钾钠91.0 g、苯酚2.50 g和亚硫酸钠2.50 g，搅拌至溶解，冷却到室温后，定容至 1000 mL。过滤，取滤液贮存于棕色瓶中，避光保存。室温下存放7 d后可以使用， 有效期为6个月。 警告:处理酸碱和配制DNS试剂时，应在通风橱或通风良好的房间进行，戴上保护 眼镜和乳胶手套，一旦皮肤或眼睛接触了上述物质，及时用大量的水冲洗。 ? 葡萄糖标准溶液(10.0 mg/mL):称取经105?烘至恒量的无水葡萄糖约1 g，精确至 0.0001 g，加柠檬酸盐缓冲溶液溶解，定容至100 mL。 5.2 试样的制备 按GB/T 14699.1采样，按GB/T 20195选取样品至少500 g，四分法缩减至100 g，磨碎，通过0.25 mm孔筛，混合密闭容器中，低温保存。 5.3 测定 5.3.1 试样溶液的准备 称取0.2 g—4 g试样，精确至0.0001 g，加入40 mL柠檬酸盐缓冲液，磁力搅拌30 min，再用柠檬酸盐缓冲液定容至100 mL，在4?条件下避光保存24 h。摇匀，取30 mL—50 mL。以3000r/min离心3 min。取5.00mL上清液，用柠檬酸盐缓冲液做二次稀释(稀释后的待测酶液中纤维素酶活性应控制在0.04 U/mL—0.18 U/mL之间)。 液体样品可以直接用柠檬酸盐缓冲液进行稀释，定容(稀释后的酶液中纤维素酶活性应控制在0.04 U/mL—0.18 U/mL之间)。如果稀释后的酶液pH偏离5.5，需重新调节pH为5.5，用柠檬酸盐缓冲液稀释定容。 16 5.3.2 标准曲线 5.3.2.1 分别量取葡萄糖标准溶液0.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL、6.00 mL、8.00 mL、10.00 mL，分别用柠檬酸盐缓冲液定容至50 mL，配成浓度为0.00 mg/mL—2.00 mg/mL的葡萄糖标准系列。 5.3.2.2 分别吸取葡萄糖标准溶液各1.00 mL于25 mL容量瓶中，各加2.00 mL和2.00 mL DNS试剂，沸水浴5 min。冷却至室温，用水定容至25 mL，在540 nm波长下比色，以吸光度作横坐标，对应标准葡萄糖溶液含糖的毫克数为纵坐标，列出直线回归方程。 5.3.3 酶活性的测定 5.3.3.1 吸取10.0 mL经过适当稀释的酶液，37?平衡10 min。 5.3.3.2 在25 mL具塞比色管中加入滤纸条——滤纸条须对称剪成32片并全部放入，加1.0 mL柠檬酸盐缓冲液浸润滤纸片，37?水浴平衡10 min，再依次加入2.00 mL DNS试剂，0.50 mL酶液，5 mL水，电磁振荡3 s—5 s，37?水浴中保温60 min(用秒表控制)，然后在沸水浴中煮沸5 min，冷却至室温，用水定容至25 mL，在540 nm波长处测定校准值A。 05.3.3.3在25 mL具塞比色管中加入滤纸条——滤纸条须对称剪成32片并全部放入，加1.0 mL柠檬酸盐缓冲液浸润滤纸片，37?水浴平衡10 min，再依次加入0.50 mL酶液，5 mL水，电磁振荡3 s—5 s。37?水浴中保温60 min(用秒表控制)，加2.00 mL DNS试剂，然后在沸水浴中煮沸5 min，冷却至室温，用水定容至25 mL。在540 nm波长处测定吸光度A。 15.4 结果计算 5.4.1 试样中滤纸纤维素酶活性以X表示，单位为酶活力单位每克(U/g)，按下式计算: m X= ×1000×n M×t 式中:X—试样纤维素酶的活性，单位为酶活性单位每克(U/g); m—根据标准曲线方程上计算得的(AA)值相对的葡萄糖的质量，单位为毫克,10 (mg); M—葡萄糖的摩尔质量，180.2 g/mol; t—酶解反应时间，单位为分钟(min); 1000—转化因子，1 mmol=1000 μmol; n—试样的总稀释倍数。 5.4.2 每个试样取两份试料进行平行试验，测定结果用其算术平均值表示，保留3位有效数字。 5.5 重复性 17 再重复性条件下的两次测定，所得结果的相对偏差不超过20%。 木聚糖酶活力测定方法 [29]木聚糖酶活性采用DNS法进行测定。 DNS试剂(3，5-二硝基水杨酸):精确称取3，5-二硝基水杨酸1g，溶于20mL 12mol/L NaOH溶液中，加入50mL蒸馏水，再加入30g酒石酸钾钠，待溶解后用蒸馏水定容至100mL。盖紧瓶塞，勿使CO进入。放置一周后使用，若溶液混浊，可过滤后使用。 2 pH4.6醋酸-醋酸钠缓冲液:称取醋酸钠6.7g和冰醋酸2.60mL，用蒸馏水溶解定容至2000mL。 DNS显色液:取10g重结晶的DNS，溶于蒸馏水中，加入20g氢氧化钠，200g酒石酸钾钠，加水500mL，加热溶解后，加入重蒸酚2g，无水亚硫酸钠0.5g，加热搅拌全部溶解后，冷却，定容至1000mL，放置一周过滤备用。 3，5二硝基水杨酸试剂(DNS):甲液:取酒石酸钠182g，溶于500mL水中，再称取重蒸苯酚5g、无水亚硫酸钠5g溶于其中。乙液:取氢氧化钠20.8g溶于260mL水中，再加入3，5二硝基水杨酸6g。将甲液和乙液倒入棕色试剂瓶混合，再加入240mL水暗处放一周后使用。 1%(W/V)木聚糖溶液:准确称取木聚糖1.0000g，溶于10mL 0.5M氢氧化钠溶液中，以磁力搅拌器搅拌30分钟，用醋酸,醋酸钠缓冲液调至pH5.0，并用pH5.0的醋酸-醋酸钠缓冲液定溶到100mL的容量瓶中，置4?的冰箱中备用。 1%(W/V)木糖标准储备液:木糖在80??2?烘箱中烘至恒重，准确称取1.0000g溶解并定溶于100mL容量瓶中，置于4?冰箱内备用，备用期为三天，必要时加叠氮化钠防腐。 木糖应用液:分别吸取木糖标准储备液，0.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00mL于50mL容量瓶中，用水定溶于刻度。 ?肉兔胃、肠道及粪便中物质变化规律研究 测定供试肉兔胃及肠道、粪便中蛋白质、脂肪、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维的含量变化，并测定肉兔蛋白饲料中氨基酸和能量的消耗率，并评定全价饲料蛋白的代谢能和净能。 拟采用的方法如下: 1. 饲料中粗蛋白测定 凯氏法 GB/T6432-94; 1.1 试剂: 1.1.1 硫酸(GB 625):化学纯，含量为98%，无氮。 1.1.2 混合催化剂:0.4g 硫酸铜，5个结晶水(GB6 65)，6g 硫酸钾(HG3-920)或硫酸钠(HG3-908)，均为化学纯，磨碎混匀。 1.1.3 氢氧化钠(GB 629):化学纯，40%水溶液(M/V)。 1.1.4 硼酸(GB 628):化学纯，2%水溶液(M/V)。 1.1.5 混合指示剂:甲基红(HG3-958)0.1%乙醇溶液，澳甲酚绿(HG 3-1220)0.5%乙醇溶液，两溶液等体积混合，在阴凉处保存期为三个月。 18 1.1.6 盐酸标准溶液:邻苯二甲酸氢钾法标定，按GB 601制备。 1.1.6.1 0.1 mol/L盐酸(HCl)标准溶液:8.3 mL盐酸(GB 622)，分析纯，注入1000 mL蒸馏水中。 1.1.6.2 0.02 mol/L盐酸(HCl)标准溶液:1.67 mL盐酸(GB 622)，分析纯，注入1000 mL蒸馏水中。 1.1.7 蔗搪(HG 3-1001):分析纯。 1.1.8 硫酸钱(GB 1396):分析纯，千燥。 %硼酸水溶液1000mL，加入1%溴甲酚绿乙醇溶液10 mL，0.1%甲基红1.1.9 硼酸吸收液:1 乙醇溶液7 mL，4%氢氧化钠水溶液0.5mL混合，置阴凉处保存期为一个月(全自动程序用)。 1.2 仪器:粉粹机，分样筛(孔径 0.45mm(40目))，分析天平，消煮炉，滴定管(酸式 10,25mL)，凯氏定N仪，锥形瓶，容量瓶，消煮管 1.3 方法: 1.3.1 仲裁法 1.3.1.1 试样的消煮 称取试样0.5-1g (含氮量5-80mg)准确至0.0002g，放入凯氏烧瓶中，加入6.4 g混合催化剂，与试样混合均匀，再加入12 mL硫酸和2粒玻璃珠，将凯氏烧瓶置于电炉上加热，开始小火，待样品焦化，泡沫消失后，再加强火力(360-410?)直至呈透明的蓝绿色，然后再继续加热，至少2 h。 1.3.1.2 氨的蒸馏(蒸馏步骤的检验见附录A) ? 常量蒸馏法 将试样消煮液(3.1.1.1)冷却，加入60-100 mL蒸馏水，摇匀，冷却。将蒸馏装置的冷凝管末端浸入装有25 mL硼酸吸收液和2滴混合指示剂的锥形瓶内。然后小心地向凯氏烧瓶中加入50 mL氢氧化钠溶液，轻轻摇动凯氏烧瓶，使溶液混匀后再加热蒸馏，直至流出液体积为100 mL。降下锥形瓶，使冷凝管末端离开液面，继续蒸馏1-2 min，并用蒸馏水冲洗冷凝管末端，洗液均需流入锥形瓶内，然后停止蒸馏。 ? 半微量蒸馏法 将试样消煮液(3.1.1.1)冷却，加入20 mL蒸馏水，转入100 mL容量瓶中，冷却后用水稀释至刻度，摇匀，做为试样分解液。将半微量蒸馏装置的冷凝管末端浸人装有20 mL硼酸吸收液和2滴混合指示剂的锥形瓶内。蒸汽发生器的水中应加入甲基红指示剂数滴，硫酸数滴，在蒸馏过程中保持此液为橙红色，否则需补加硫酸。准确移取试样分解液10-20 mL注入蒸馏装置的反应室中，用少量蒸馏水冲洗进样入口，塞好入口玻璃塞，再加10 mL氢氧化钠溶液，小心提起玻璃塞使之流入反应室，将玻璃塞塞好，且在入口处加水密封，防止漏气。蒸馏4 min降下 19 锥形瓶使冷凝管末端离开吸收液面，再蒸馏1min，用蒸馏水冲洗冷凝管末端，洗液均流人锥形瓶内，然后停止蒸馏。 注:? 和?蒸馏法测定结果相近，可任选一种。 ? 蒸馏步骤的检验 精确称取0.2g硫酸铵，代替试样，按7.1.2或7.2. 2 步骤进行操作，测得硫酸铵含氮量为21.19士0.2%，否则应检查加碱、蒸馏和滴定各步骤是否正确。 1.3.1.3 滴定 用?或?法蒸馏后的吸收液立即用0.1 mol/L。或0.02 mol/L盐酸标准溶液滴定，溶液由蓝绿色变成灰红色为终点。 1.3.2 推荐法 ?试样的消煮 称取0.5-l g试样(含氮量5-80 mg)准确至0.0002 g，放入消化管中，加2片消化片(仪器自备)或6.4 g混合催化剂，12 mL硫酸，于420?下在消煮炉上消化1 h。取出放凉后加入30 mL蒸馏水。 ?氨的蒸馏 采用全自动定氮仪时，按仪器本身常量程序进行测定。 采用半自动定氮仪时，将带消化液的管子插在蒸馏装置上，以25 mL硼酸为吸收液，加入2滴混合指示剂，蒸馏装置的冷凝管末端要浸入装有吸收液的锥形瓶内，然后向消煮管中加入50 mL氢氧化钠溶液进行蒸馏。蒸馏时间以吸收液体积达到100 mL时为宜。降下锥形瓶，用蒸馏水冲洗冷凝管末端，洗液均需流入锥形瓶内。 ?滴定 用0.1 mol/L的标准盐酸溶液滴定吸收液，溶液由蓝绿色变成灰红色为终点。 1.4 空白测定 称取蔗糖0.5 g，代替试样，按第七章进行空白测定，消耗0.1 mol/L盐酸标准溶液的体积不得超过0.2 mL，消耗0.02 mol/L盐酸标准溶液体积不得超过0.3 mL。 1.5 分析结果的表述 ?计算见下式: 式中:V—滴定试样时所需标准酸溶液体积，mL; 2 20 V—滴定空白时所需标准酸溶液体积，mL; 1 C一盐酸标准溶液浓度，mol/L; m—试样质量，g; V—试 样 分 解液总体积，mI; V'—试样分解液蒸馏用体积，mL; 0.0140—每毫克当量氮的克数; 6.25—氮换算成蛋白质的平均系数。 ?重复性 每个试样取两个平行样进行测定，以其算术平均值为结果。 当粗蛋白质含量在25%以上时，允许相对偏差为1%。 当粗蛋白质含量在10%—25%之间时，允许相对偏差为2%。 当粗蛋白质含量在10%以下时，允许相对偏差为3%。 4.饲料中粗纤维的含量测定 过滤法 GB/T 6434-2006; 4.1 试剂和材料 除非另有规定，只用分析纯试剂。 ? 水至少应为GB/T 6682规定的三级水。 ? 盐酸溶液:c(HCl)=0.5 mol/L。 ? 硫酸溶液:c(HSO)=(0.13?0.005)mol/L。 24 ? 氢氧化钾溶液:c(KOH)=(0.23?0.005)mol/L。 ? 丙酮。 ? 滤器辅料:海沙，或硅藻土，或质量相当的其他材料。使用前，海沙用沸腾盐酸[c(HCl) =4 mol/L]处理，用水洗至中性，在500??25?下至少加热1h。 ?防泡剂:如正辛醇。 使用前，海沙用沸腾盐酸[(:(^:^-^ "处 ?石油醚:沸点范围40?-60?。 4.2仪器设备 ? 粉碎设备:能将样品粉碎，使其能完全通过筛孔为1 mm筛。 ? 分折天平:感量0.1 mg。 ? 滤埚:石英的、陶瓷的或硬质玻璃的，带有烧结的滤板，滤板孔径40 μm—100 μm (按 ISO7493)。 在初次使用前，将新滤埚小心地逐步加温，温度不超过525?，并在500??25?下保持数 分钟。也可使用具有同样性能特性的不锈钢坩埚，其不锈钢筛板的孔径为90μm。 21 ? 陶瓷筛板。 ? 灰化皿。 ? 烧杯或锥形瓶:容量500 mL，带有一个适当的冷却装置，如冷凝器或一个盘。 ?干燥箱:用电加热，能通风，能保持温度130??2?。 ?干燥器:盛有蓝色硅胶干燥剂，内有厚度为2 mm—3 mm的多孔板，最好由铝或不锈钢 制成。 ?马福炉:用电加热，可以通风，温度可调控，在475?—525?条件下，保持滤埚周围 温度准至?25?。马福炉的高温表读数不总是可信的，可能发生误差，因此对高温炉中 的温度要定期检查。 因高温炉的大小及类型不同，炉内不同位置的温度可能不同。当炉门关闭时，必须有充足的空气供应。空气体积流速不宜过大，以免带走滤埚中的物质。 ?冷提取装置，附有: —— 一个滤埚支架; —— 一个装有至真空和液体排出孔旋塞的排放管; ——连接滤埚的连接环。 11加热装置(手工操作方法):带有一个适当的冷却装置，在沸腾时能保持体积恒定。 ? 12加热装置(半自动操作方法):用于酸和碱消煮，附有: ? —— 一个滤埚支架; —— 一个装有至真空和液体排出孔旋塞的排放管; —— 一个容积至少270 mL的圆筒，供消煮用，带有回流冷凝器; ——将加热装置与滤埚及消煮圆筒连接的连接环; ——可选择性地提供压缩空气; ——使用前，设备用沸水预热5 min。 4.3采样 采样按GB/T 14699.1(ISO 6497:2002,IDT)进行。 重要的是实验室收到一份真正有代表性的样品并在运输及保存过程中不受到破坏或不发生变化。 22 4.4试样制备 试样按GB/T 20195制备。 用粉碎装置将实验室风干样粉碎，使其能完全通过筛孔为1 mm的筛，充分混合。 如用手工操作方法，按第9章处理。 如用半自动操作方法，则按第10章处理。 4.5手工操作法分析步骤 4.5.1 试料 称取约1 g制备的试样(第8章)，准确至0.mg(m)。 1 如果试样脂肪含量超过100 g/kg，或试样中脂肪不能用石油醚直接提取，则将试样装移至一滤埚，并按4.5.2处理。 如果试样脂肪含量不超过100 g/kg，则将试样装移至一烧杯。如果其碳酸盐〔碳酸钙形式)超过50 g/kg，按4.5.3处理;如果碳酸盐不超过50 g/kg，则按4.5.4处理。 4.5.2预先脱脂 在冷提取装置中，在真空条件下，试样用石油醚脱脂3次，每次用石油醚30 mL，每次洗涤后抽吸干燥残渣，将残渣装移至一烧杯。 4.5.3除去碳酸盐 将100 mL盐酸倾注在试样上，连续振摇5 min，小心将此混合物倾人一滤埚，滤埚底部覆盖一薄层滤器辅料。 用水洗涤两次，每次用水100 mL，细心操作最终使尽可能少的物质留在滤器上。 将滤埚内容物转移至原来的烧杯中按4.5.4处理。 4.5.4酸消煮 将150 mL硫酸倾注在试样上。尽快使其沸腾，并保持沸腾状态30 min?1 min。 在沸腾开始时，转动烧杯一段时间。如果产生泡沫，则加数滴防泡剂。在沸腾期间使用一个适当的冷却装置保持体积恒定。 4.5.5第一次过滤 在滤埚中铺一层滤器辅料，其厚度约为滤埚高度的五分之一，滤器辅料上面可盖一筛板以防溅起。 当消煮结束时，将液体通过一个搅拌棒滤至滤埚中，用弱真空抽滤，使150 mL几乎全部通过。如果滤器堵塞，则用一个搅拌棒小心地移去覆盖在滤器辅料上的粗纤维。 残猹用热水洗涤5次，每次约用10 mL水，要注意使滤埚的过滤板始终有滤器辅料覆盖，使粗纤维不接触滤板。 23 停止抽真空，加一定体积的丙酮，刚好能覆盖残渣，静置数分钟后，慢慢抽滤排出丙酮，继续抽真空，使空气通过残渣，使之干燥。 4.5.6 脱脂 在冷提取装置中，在真空条件下，试样用石油醚脱脂3次，每次用石油醚30 mL，每次洗涤后抽吸干燥。 4.5.7 碱消煮 将残渣定量转移至酸消煮用的同一烧杯中。 加150 mL氢氧化钾溶液，尽快使其沸腾，保持沸腾状态30 min?1min，在沸腾期间用一适当的冷却装置使溶液体积保持恒定。 4.5.8 第二次过滤 烧杯内容物通过滤埚过滤，滤埚内铺有一层滤器辅料，其厚度约为滤埚高度的五分之一，上盖一筛板以防溅起。 残渣用热水洗至中性。 残渣在真空条件下用丙酮洗涤3次，每次用丙酮30 mL，每次洗涤后抽吸干燥残渣。 4.5.9干燥 将滤祸置于灰化皿中，灰化孤及其内容物在130?干燥箱中至少干燥2 h。 在灰化或冷却过程中，滤埚的烧结滤板可能有些部分变得松散，从而可能导致分析结果错误，因此将滤埚置于灰化皿中。 滤埚和灰化皿在干燥器中冷却，从干燥器中取出后，立即对滤埚和灰化皿进行称量(m)，2准确至0.1 mg。 4.5.10灰化 将滤埚和灰化皿置于马福炉中，其内容物在500??25?下灰化，直至冷却后连续两次称量的差值不超过2 mg。 每次灰化后，让滤埚和灰化皿初步冷却，在尚温热时置于干燥器中，使其完全冷却，然后称量(m)，准确至0.1 mg。 3 4.5.11空白测定 用大约相同数量的滤器辅料，按4.5. 4至4.5.10进行空白测定，但不加试样。 灰化(4.5.10)引起的质量损失不应超过2 mg。 按第11章处理。 4.6 半自动操作方法的分析步骤 24 4.6.1 试料 称取约1 g制备的试样(第8章)(m)准确至0.1 mg，转移至一带有约2 g滤器辅料的1 滤埚中。 如果样品脂肪含量超过100 g/kg，或样品所含脂肪不能用石油醚直接提取，则按4.6.2进行。 如果样品脂肪含量不超过100 g/kg，其碳酸盐(碳酸钙形式)含量超过50 g/kg，按4.6.3进行，如果碳酸盐不超过50 g/kg，则按4.6.4进行。 4.6.2预先脱脂 将滤埚与冷提取装置连接，试样在真空条件下用石油醚洗涤3次，每次用石油醚30 mL，每次洗涤后抽吸干燥残渣。 4.6.3 除去碳酸盐 将滤埚与加热装置连接，试样用盐酸洗涤3次，每次用盐酸30 mL，在每次加盐酸后在过滤之前停留约1 min。 约用30 mL水洗涤一次，按4.6.4进行。 4.6.4 酸消煮 将消煮圆筒与滤埚连接，将150 mL沸硫酸转移至带有滤埚的圆筒中，如果出现泡沫，则加数滴防泡剂，使硫酸尽快沸腾，并保持剧烈沸腾30 min?1 min。 4.6.5 第一次过滤 停止加热，打开排放管旋塞，在真空条件下通过滤埚将硫酸滤出，残渣用热水至少洗涤3次，每次用水30 mL洗涤至中性，每次洗涤后抽吸干燥残渣。 如果过滤发生问题，建议小心吹气排出滤器堵塞。 如果样品所含脂肪不能直接用石油醚提取，按4.6.6进行;否则，按4.6.7进行。 4.6.6 脱脂 将滤埚与冷提取装置连接，残渣在真空条件下用丙酮洗涤3次，每次用丙酮30 mL。然后，残渣在真空条件下用石油醚洗涤3次，每次用石油醚30 mL。^每次洗涤后抽吸干燥残渣。 4.6.7碱消煮 25 关闭排出孔旋塞，将150 mL沸腾的氢氧化钾溶液转移至带有滤埚的圆筒，加数滴防泡剂，使溶液尽快沸腾，并保持剧烈沸腾30 min?1 min。 4.6.8第二次过滤 停止加热，打开排放管旋塞，在真空条件下通过滤埚将氢氧化钾溶液滤去，用热水至少洗涤3次，每次用水约30 mL，洗至中性，每次洗涤后抽吸干燥残渣。 如果过滤发生问题，建议小心吹气排出滤器堵塞。 将滤埚与冷提取装置连接，残渣在真空条件下用丙酮洗涤3次，每次用丙酮30 mL。每次洗涤后抽吸干燥残渣。 4.6.9 干燥 将滤埚置于灰化皿中，灰化皿及其内容物在130?干燥箱中至少干燥2 h。 将灰化或冷却过程中，滤埚的烧结滤板可能有些部分变得松散，从而可能导致分析结果错误，因此需将滤埚置于灰化皿中。 滤埚和灰化皿在干燥器中冷却，从干燥器中取出后，立即对滤埚和灰化皿进行称量(m)，2准确至0.1 mg。 4.6.10 灰化 将滤埚和灰化盘置于马福炉中，其内容物在500??25?下灰化，直至冷却后连续两次称量的差值不超过2 mg。 每次灰化后，让滤埚和灰化皿初步冷却，在尚温热时置于干燥箱中，使其完全冷却，然后称量(m)，准确至0.1mg。 3 4.6.11 空白测定 用大约相同数量的滤器辅料，按4.6.4至4.6.10进行空白测定，但不加试样。 灰化(4.6.10)引起的质量损失不应超过2 mg。 4.7 计算 试样中粗纤维的含量(X)以克每千克(g/kg)表示，按式(1)计算: 式中:m——试料(4.5.1或4.6.1)的质量，单位为克(g); 1 m——灰化盘、滤埚以及在130?干燥后获得的残渣(4.5.9或4.6.9)的质量，单位为2 毫克(mg)。 m——灰化盘。滤埚以及在500??25?灰化后获得的残渣(4.5.10或4.6.10)的质量，3 26 单位为毫克(mg)。 结果四舍五入，准确至1g/kg。 注:结果亦可用质量分数(%)表示。 4.8精密度 4.8.1实验室间试验 附录A详细列出了本方法精密度的实验室间的试验结果，从该试验得出的数值可能不适用于附录中列出以外的浓度范围及基质的样本。 4.8.2重复性 用同一方法，对相同的试验材料，在同一实验室内，由同一操作人员使用同一设备，在短时间内获得的两个独立试验结果之间的绝对差值超过表1中列出的或由表1得出重复性限r的情况不大于5%。 表1 重复性限(r)和再现性限(R) 重复性限(r)再现性限(R)样品 粗纤维含量(g/kg) /(g/kg) /(g/kg) 向日葵饼粨粉 223.3 8.4 16.1 棕榈仁饼粨 190.3 19.4 42.5 牛颗粒饲料 115.8 5.3 13.8 玉米谷蛋白饲料 73.3 5.8 9.1 木薯 60.2 5.6 8.8 狗粮 30.0 3.2 8.9 猫粮 22.8 2.7 6.4 4.8.3 再现性 使用同一方法，对相同的实验材料，在不同实验室，由不同操作人员使用不同设备获得的两个独立试验结果之间的绝对差值超过表1中列出的或从表去得出的再现性限R的情况不大于5%。 5. 饲料中淀粉含量的测定 旋光法 GB/T 20194-2006; 5.1试剂 除非另有规定仅使用分析纯试剂 ?水:为GB/T 6682-1992中规定的三级用水。 ?乙醇(CHOH)，40%(体积分数)。 25 ?甲基红，96%乙醇溶液(体积分数):ρ(甲基红)=1 g/L。 27 ?盐酸，c(HCI)=0.31 mol/L:以甲基红为指示剂，用0.100 mol/L氢氧化钠溶液滴定盐酸 溶液，10 mL盐酸溶液应中和31.0 mL?0.1 mL氢氧化钠。 警告:盐酸溶液浓度过高或过低，将导致不正确的淀粉测定值。 如果水浴不能保持沸腾，则淀粉含t测定值可能偏高。 ?盐酸，c(HCl)=7.73 mol/L。 ?澄清溶液，Carrez澄清溶液配制方法如下: ? 亚铁氰化钾(?)溶液，c[KFe(CN)]=0.25 mol/L:在1 L容量瓶中，将106 g三水亚铁氰46 化钾[KFe(CN)?3H0]溶于水，定容至刻度。 462 ? 乙酸锌，0.5 mol/L 乙酸溶液，c[Zn(CHCOO)]=1 mol/L:在1 L容量瓶中将219.5 g乙32 酸锌[(ZnCHCOO)?3HO]和30 g冰乙酸溶于水，并用水定容到刻度。 322 ? 蔗糖溶液(CHO)，ρ=100.0 g/L。 122211 5.2仪器设备 ?分析天平:感量为1 mg。 ?pH计:准确至0.1 pH单位。 ?沸水浴:当锥形瓶浸人时，水浴能保持沸腾。 警告:如果水浴不能保持沸腾，则淀粉含t测定值可能偏高。 ?旋光仪;准确至0.01?，适合使用200 mm长旋光管。 在波长589.3 nm处(钠D线)测定旋光度，如果用长度偏离规定的旋光管测定，则需用一个相应的准确度表示。 如果糖度计的测定准确度相当于旋光仪的准确度，也可用糖度计，此时，应将读数转化为度。 旋光仪可用蔗糖溶液校准，当在20??10?，用200 mm旋光仪测定时，该蔗糖溶液的旋光度为13.30%。 ?滴定管。 ?冷凝器。 ?容量瓶100 mL:如果容量瓶需要与回流冷凝器连接则建议使用广口科尔劳施锥形瓶。 注:科尔劳施锥形瓶是专用于测定糖的容量瓶。 5.3方法 5.3.1 耗酸量的测定 ? 称取约2.5 g制备好的试样(精确到1 mg)，定量转移到50 mL锥形瓶中，加入25 mL水，振 摇至形成均匀的悬浊液。 28 ? 将pH计的电极置于悬浊液中，用滴定管滴加盐酸至pH为3.0?0.1，剧烈振摇悬浊液，并 静置2 min，检查试料所消耗盐酸是否平衡，如果在此过程中，pH升高超过3.1，再用滴 定管滴加盐酸，必要时可多次滴加盐酸，直到不需要更多的盐酸为止。 ? 根据所用盐酸体积计算出试料的耗酸量。 5.3.2 总旋光度测定 ? 称取约2.5 g制备好的试样(m)，精确到1 mg，定量转移到于燥的100 mL容量瓶中中，1 加25 mL盐酸，振摇至形成均匀的悬浊液，再加人25 mL盐酸。 ? 加人适量浓度的盐酸，补偿试样的耗酸量，使容量瓶中内容物的体积变化不超过1 mL。 示例:如为补偿富含白奎的样品用去0.1 mol/L盐酸5.0 mL，试料的耗酸量是0.5 mmol(5.3.1中?)，此时在?中需加1.0 mol/L盐酸0.5 mL。 警告:如悬浊液中盐酸浓度偏离0.31 mol/L，将会得到错误的淀粉含量，盐酸浓度过高或过低，将分别导致淀粉含量测定值过低或过高。 ? 将锥形瓶浸人沸水浴中，在前3 min，用力振摇锥形瓶，以避免结块并使悬浊液受热均匀，振摇时锥形瓶不能离开水浴。 如果同时测定多个试样，锥形瓶不要同时放人水浴，每个样品要间隔一定时间，以保持水浴沸腾。 15 min?5s后，取出锥形瓶，立即加人温度不超过10?的水30 mL，转动锥形瓶，在流水中冷却至20?左右。 警告:如果锥形瓶在沸水浴中加热时间过长或降温过慢，则淀粉含量测定值过低。 加入5 mL亚铁氰化钾溶液(?)，振摇1 min，加人5 mL乙酸锌溶液，振摇1 min，用水稀释至刻度，混匀，过滤，弃去初始的数毫升溶液 用旋光仪或糖量计测定滤液的旋光度(α)。 1 5.3.3 乙醇溶解物的旋光度测定 ? 称取5 g制备好的试样(m)，精确至1 mg定量转移到100 mL干燥的容量瓶中，加40 mL2 乙醇，振摇至形成均匀的悬浊液，然后再加40 mL乙醇。 ? 加入适当浓度的盐酸以补充试样的耗酸量，使瓶中内容物的体积变化不超过1mL，加 入盐酸的量通常是(见5.3.1)加入量的两倍。 ? 用力振摇，在室温下静置1 h，在此期间至少每隔10 min振摇一次。 如果试样(如乳清粉及精制奶粉)中乳糖含量超50 g/kg，将容量瓶中试样加热溶解，并与冷凝器相连，置于50??2?水浴中加热30 min。 用乙醇稀释至刻度，混匀，过滤，弃去最初数毫升溶液。 29 吸取50 mL滤液于100 mL容量瓶，加人2.0 mL盐酸用力振摇，将容量瓶与冷凝器相连，并将其浸人沸水浴中中。 15 min?5s后，从水浴中取出容量瓶，立即加人温度不超过10?的水30 min，转动容量瓶 并在冷水中冷至20?左右 加5 mL亚铁氰化钾(?)溶液，振摇1 min，加5 mL乙酸锌溶液，振摇1 min，用水稀释至 刻度，摇匀，过滤，弃去最初数毫升滤液。用旋光度或糖量计测定滤液的旋光度(α)。 25.4 计算及结果表示 试样的淀粉含量由下式计算: 式中:W—试样中淀粉含量，单位为克每千克(g/kg); α—总旋光度的数值，在(2)中测得的度数; l α—在(3)中测定的乙醇溶解物的旋光度值，以度表示; 2 m—测定总旋光度(2)时试料的质量，单位为克(g); l m—测定乙醇溶解物旋光度(3)时试料的质量，单位为克(g); 2 20α—在波长为589.3 nm(钠D线)处测定纯淀粉比旋度的数值。 D 其中: 20α=185.9? 稻米淀粉 D 20α=185.7? 马铃薯淀粉(参见附录A) D 20α =184.6? 玉米淀粉 D 20α一184.0? 黑麦淀粉 D 20α=183.6? 木薯淀粉(参见附录A) D 20α=182.7? 小麦淀粉 D 20α=181.3? 燕麦淀粉 D 20α一184.0? 其他淀粉及动物饲料中的棍合淀粉 D 结果四舍五入，准确至1 g/kg。 附 录 A (资料性附录) 关于马铃薯淀粉和木薯淀粉比旋度的说明 A.1 马铃薯淀粉 在实际测定中，马铃薯淀粉使用了三个不同的比旋度数值。 30 由Ewers发表的原始出版物中，提出了马铃薯淀粉的两个比旋度。 20α=185.7? 在沸水浴中用0.31 mol/L盐酸处理淀粉样品。 D 20α=195.4? 在沸水浴中用0.10 mol/I盐酸处理淀粉样品。 D 用0.10 mol/L盐酸处理得到淀粉旋光度，不是标准值，通常是用0.31 mol/L盐酸处理，得到淀粉含量，其相应的比旋光度值为185.7?。 遗憾的是过去由原始出版物导出的关于马铃薯淀粉的两个比旋光度数值被欧洲委员会(EC)混淆了，因而引起了混乱。 1967年欧洲委员会发表的官方刊物中提出了正确数值为185.7?。在1972年修订了EC议定 书 关于书的成语关于读书的排比句社区图书漂流公约怎么写关于读书的小报汉书pdf 之后，又在官方刊物中提出195.4?的错误数值。 1980年，在官方刊物中对马铃薯淀粉的比旋度进行了错误的修订，即由195.4? 修订为185.4?，但后者应为185.7?。 1987年，由EC提出的错误值195.4? 被欧洲淀粉协会(ESA)的淀粉专家(STEX)的分析工作组采用。 以后，该错误值为EC修订为185.4? 为ISO/CD 10520，随后ISO/DIS 10520(1994)中提出了185.7? 这一正确数值，虽然在再版的ISO/DIS 10520.2(1995)再次提出185.4? 这一错误值，但是ISO 10520:1997的文本中包含了正确数值185.7?。 A.2 木薯淀粉 根据参考文献，木薯淀粉的比旋度为183.6?。 6(饲料中中性洗涤纤维(NDF)的测定 GB/T 20806-2006; 7.饲料中粗脂肪的测定 GB/T6433-2006; 以下步骤参照粗脂肪GB/T 6433-2006 预先提取:称取至少20g制备的试样，准确至1mg。与10g无水硫酸钠混合，转移至一提取套管并用一小块脱脂棉覆盖。将一些金刚砂转移至一干燥烧瓶，如果随后将对脂肪定性，则使用玻璃细珠替代金刚砂，将烧瓶与提取器连接，收集石油醚提取物。将套管置于提取器中，用石油醚提取2h，使用索氏提取器则调节加热装置使每小时至少循环10次。用500mL石油醚稀释烧瓶中的石油醚提取物，充分混合，对一个盛有金刚砂的干燥烧瓶进行称量，准确至1mg。吸取50mL石油醚溶液移入此烧瓶中。蒸馏除去溶剂直至烧瓶中无溶剂，加2mL丙酮于烧瓶中，转动烧瓶并在加热装置上缓慢加温以除去丙酮，吹去痕量丙酮，残渣在103?干燥箱中干燥10min，在干燥器中冷却，称量，准确至0.1mg。取出套管中提取的残渣在空气中 31 干燥，除去残余的溶剂，干燥残渣称量，准确至0.1mg。 提取:将一些金刚砂转移至一干燥烧瓶，称量，准确至1mg。如果随后要对脂肪定性，则使用玻璃细珠取代金刚砂。将烧瓶与提取器连接，收集石油醚提取物，将套管置于提取器中，用石油醚提取6h，用索氏提取器，则调节加热装置使每小时至少循环10次。蒸馏除去溶剂，直至烧瓶中几乎无溶剂，加2mL丙酮至烧瓶中，转动烧瓶并在加热装置上缓慢加温以除去丙酮，吹去痕量丙酮。残渣在103?干燥箱中干燥10min，在干燥器中冷却，称量，准确至0.1mg。 2.6.6 粗蛋白含量测定 以下步骤参照粗蛋白质GB/T 6432-1994 试样的消煮 称取试样0.5-1g准确至0.0002g，放入凯氏烧瓶中，加入6.4g混合。催化剂，与试样混合均匀，再加入12mL硫酸和2粒玻璃珠，将凯氏烧瓶置于电炉上加热，开始小火，待样品焦化，泡沫消失后，再加强火力(360~410?)直至呈透明的蓝绿色，然后再继续加热，至少2h。 氨的蒸馏(半微量蒸馏法): 将试样消煮液冷却，加入20mL蒸馏水，转入100mL容量瓶中，冷却后用水稀释至刻度，摇匀，作为试样分解液。将半微量蒸馏装置的冷凝管末端浸人装有20mL硼酸吸收液和2滴混合指示剂的锥形瓶内。蒸汽发生器的水中应加入甲基红指示剂数滴，硫酸数滴，在蒸馏过程中保持此液为橙红色，否则需补加硫酸。准确移取试样分解液10-20mL注入蒸馏装置的反应室中，用少量蒸馏水冲洗进样入口，塞好入口玻璃塞，再加10mL氢氧化钠溶液，小心提起玻璃塞使之流入反应室，将玻璃塞塞好，且在入口处加水密封，防止漏气。蒸馏4min降下锥形瓶使冷凝管末端离开吸收液面，再蒸馏1min，用蒸馏水冲洗冷凝管末端，洗液均流人锥形瓶内，然后停止蒸馏。 蒸馏步骤的检验 精确称取0.2g硫酸铵代替试样，按(2)步骤进行操作，测得硫酸胺含氮量为21.19?0.2%，否则应检查加碱、蒸馏和滴定各步骤是否正确。 滴定 用(2)法蒸馏后的吸收液立即用0.1mol/L盐酸标准溶液滴定，溶液由蓝绿色变成灰红色为终点。 8.饲料中水分和其他挥发性物质含量的测定 GB/T 6435-2006; 以下步骤参照水分测定方法GB/T 6435-2006。 试样:称量瓶内放一薄层砂和一根玻璃棒，将称量瓶及内容物和盖一并放入103?的干燥箱内干燥30min，盖好称量瓶，从干燥箱中取出，放在干燥器中冷却至室温，称量其质量，准确至1mg。称取10g试样于称量瓶中，准确至1mg，用玻璃棒将试样与砂充分混合。 32 测定:将称量瓶盖放在下面与称量瓶一同放入到103?干燥箱中，建议平均每升干燥箱空间最多放一个称量瓶。当干燥箱温度达到103?后，干燥4h，将盖盖上，从干燥箱中取出，在干燥器中冷却至室温，称量，准确至1mg。 检查试验:为了检查在干燥过程中是否有因化学反应而造成的不可接受的质量变化，作如下检查:放入干燥箱于103?再次干燥称量瓶和试样，时间为2h。在干燥器中冷却至室温，称量，准确至1mg。如果经第二次干燥后质量变化大于试样质量的0.2%，就可能发生了化学反应，这种情况下要按照(4)步骤进行操作。 发生不可接受质量变化的样品:按(1)取试样，将称量瓶盖放在下面与称量瓶一同放入到80?的真空干燥箱中，减压至13kpa，通入干燥空气干燥试样，在放置干燥剂的情况下，当达到设定的压力后断开真空泵。在干燥过程中保持所设定的压力。当干燥箱的温度达到80?时，加热4h，小心地将干燥箱恢复至常压打开干燥箱，立即将称量瓶盖盖上，从干燥箱中取出，放入干燥器中冷却至室温称量，准确至1mg。将试样再次放入到真空干燥箱中干燥30min直至两次干燥质量变化之差小于其质量的0.2%。 测定次数:同一试样进行三个平行测定。 9.饲料中粗灰分的测定 GB/T6438-2007; 9.1 仪器设备 除常用实验室设备外，其他仪器设备如下: ? 分析天平:感量为0.001 g。 ? 马弗炉:电加热，可控制温度，带高温计。马弗炉中摆放煅烧盘的地方，在550?时温差 不超过20?。 ? 干燥箱:温度控制在(103?2)?。 ? 电热板或煤气喷灯。 ? 煅烧盘:铂或铂金(如10,铂，90,金)或在实验条件下不受影响的其他物质(如瓷质 2材料 )，最好是表面积约为20 cm、高约为2.5 cm的长方形容器，对易于膨胀的碳水化 2合物样品，灰化盘的表面积约为30 cm、高约为3.0 cm的容器。 ? 干燥器:盛有有效的干燥剂。 9.2 采样 重要的是实验室收到一份真正具有代表性的样品，并且在运输及保存过程中不受到破坏或不发生变化。 样品应以不破坏或不改变其组分的方式贮存。 采样按GB/T 14699.1执行。 33 9.3 分析步骤 9.3.1 试样制备 试样制备按GB/T 20195执行。 9.3.2 实验步骤 将煅烧盘放入马弗炉中，于550?，灼烧至少30 min，移入干燥箱中冷却至室温，称量，准确至0.001 g。称取约5 g试样(精确至0.001 g)于煅烧盘中。 9.3.2 测定 将盛有试样的煅烧盘放在电热板或煤气喷灯上小心加热至试样炭化，转入预先加热到550?的马弗炉中灼烧3 h，观察是否有炭粒，如无炭粒，继续于马弗炉中灼烧1 h，如果有炭粒或怀疑有炭粒，将煅烧盘冷却并用蒸馏水润湿，在(103?2)?的干燥箱中仔细蒸发至干，再将煅烧盘置于马弗炉在灼烧1 h，取出于干燥箱中。冷却至室温迅速称量，准确至0.001 g。 注:由上述步骤得到的粗灰分可用于测定盐酸不溶性灰分(参见ISO 5985)。 同一试样取两份试料进行平行测定。 9.4 结果表示 粗灰分W，用质量分数(%)表示，按式(1)计算: 式中:m—灰化后粗灰分加煅烧盘的质量，单位为克(g); 2 m—为空煅烧盘的质量，单位为克(g); 0 m—装有试样的煅烧盘质量，单位为克(g); 1 取两次测定的算术平均值作为测定结果，重复性限(9.5.2)满足要求，结果表示至0.1%(质量分数)。 9.5 精密度 9.5.1 实验室间试验 附录A中详细列出了本方法精密度的试验间实验结果，从该试验得出的结果可能不适用附录A中列出以外的物质和浓度范围。 9.5.2 重复性 用同一方法，对相同试验材料，在同一实验室内，由同一操作人员使用同一设备获得的两个独立试验结果之间的绝对差值超过表1中列出的或由表1得出的重复性限r的情况不大于5%。 34 表1 重复性限(r)和再现性限(R) 样品 粗灰分 r R 鱼粉 179.8 2.7 4.4 木薯 59.1 2.4 3.6 肉粉 175.6 2.4 5.6 仔猪饲料 50.2 2.1 3.3 仔鸡饲料 42.7 0.9 2.2 大麦 20.0 1.0 1.9 糖浆 119.9 3.6 9.1 挤压棕榈粕 35.8 0.7 1.6 9.5.3 再现性 用相同的方法，对同一试样，在不同的实验室内，由不同的操作人员，用不同的设备得到的两个独立的试验结果之差的绝对值超过表1列出的或由表1导出的再现性限R的情况不大于5%。 附录A (资料性附录) 实验室间试验结果 根据ISO 5725-1、ISO 5725-2进行实验室间试验，以确定本方法的精确度，其中用Grubbs试验代替Dixon试验确定高峰值。本试验有40个—52个试验室参加，样品有鱼粉等，实验室间试验结果见表A.1. 表A.1 实验室间试验统计结果 参数 样品 1 2 3 4 5 6 7 8 实验室数 52 48 47 50 48 48 40 49 可接受的结果 50 47 43 49 44 45 39 46 灰分平均值/(g/kg) 179.8 59.1 175.6 50.2 42.7 20.0 119.9 35.8 重复性标准差(S)/(g/kg) 1.0 0.9 0.9 0.8 0.3 0.4 1.3 0.2 r 重复性变异系数/% 1.5 4.1 1.4 4.2 2.1 5.0 3.0 2.0 重复性限(r)/(g/kg) 2.7 2.4 2.4 2.1 0.9 1.0 3.6 0.7 再现性标准差(S)/(g/kg) 1.4 1.1 1.9 1.1 0.7 0.6 3.1 0.5 R 再现性变异系数/% 2.5 6.0 3.2 6.6 5.1 9.6 7.6 4.4 再现性限(R)/(g/kg) 4.4 3.6 5.6 3.3 2.2 1.9 3.1 1.6 35 a 1:鱼粉; 5:仔鸡饲料; 2:木薯; 6:大麦; 3:肉粉; 7:糖蜜; 4:仔猪饲料 8:挤压棕榈粕 10.饲料中钙含量的测定 高锰酸钾法 GB/T 6436-2002; 10.1 试剂和溶液 实验用水应符合GB/T 6682中三级用水规格，使用试剂除特殊规定外均为分析纯。 ?硝酸 ?高氯酸:70%—72% 盐酸溶液:1+3 ? ?硫酸溶液:1+3 ?氨水溶液:1+1 ?草酸铵水溶液(42 g/L):称取4.2 g草酸馁溶于100 mL水中 ?高锰酸钾标准溶液:[c〔1/5KMnO〕=0.05 mol/L]的配制按GB/T 601规定。 4 ?甲基红指示剂(1 g/L):称取0.1 g甲基红溶于100 mL 95%乙醇中。 10.2 仪器和设备 ?实验室用样品粉碎机或研钵 ?分析筛:孔径0.42 mm(40目) ?分析天平:感量0.0001 g ?高温炉:电加热，可控温度在(550?20)? ?柑祸:瓷质 ?容量瓶:100 mL ?滴定管:酸式，25 mL或50 mL ?玻璃漏斗:直径6 cm ?定量滤纸:中速，7 cm-9 cm ?凯氏烧瓶:250 mL或500 mL 10.3 试样制备 取具有代表性试样至少2 kg，用四分法缩分至250g，粉碎过0.42 mm孔筛，混匀，装人样 品瓶中，密闭，保存备用。 10.4 测定步骤 10.4.1 试样的分解 36 ?门干法 称取试样2 g—5 g于钳祸中，精确至0.0002 g，在电炉上小心炭化，再放人高温沪于550?下灼烧3 h(或测定粗灰分后连续进行)，在盛灰柑塌中加人盐酸溶液10 mL和浓硝酸数滴，小心煮沸，将此溶液转人100 mL容量瓶中，冷却至室温，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，为试样分解液。 ?湿法 称取试样2g—5g于250 mL凯氏烧瓶中，精确至0.0002 g，加人硝酸10 mL，加热煮沸，至二氧化氮黄烟逸尽，冷却后加人高氯酸10 mL，小心煮沸至溶液无色，不得蒸干(危险)冷却后加蒸馏水50 mL，且煮沸驱逐二氧化氮，冷却后移入100 mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，为试样分解液。 10.4.2 试样的测定 准确移取试样液10 mL—20 mL(含钙量20 mg左右)于200 mL烧杯中，加蒸馏水100 mL，甲基红指示剂2滴，滴加氨水溶液至溶液呈橙色，若滴加过量，可加盐酸溶液调至橙色，再多加2滴使其呈粉红色(pH为2.5-3.0)，小心煮沸，慢慢滴加热草酸钱溶液10 mL，且不断搅拌，如溶液变橙色，则应补加盐酸溶液使其呈红色，煮沸数分钟，放置过夜使沉淀陈化(或在水浴上加热2 h)。 用定量滤纸过滤，用1+50的氨水溶液洗沉淀6-8次，至无草酸根离子[接滤液数毫升加硫酸溶液数滴，加热至80 C，再加高锰酸钾溶液(4.7)1滴.呈微红色，且半分钟不褪色〕。 将沉淀和滤纸转人原烧杯中，加硫酸溶液10 mL，蒸馏水50 mL，加热至75-80?，用高锰酸钾标准溶液滴定，溶液呈粉红色且半分钟不褪色为终点。 同时进行空白溶液的测定。 10.5测定结果的计算与表述 ? 结果计算 式中:X一以质量分数表示的钙含量，%; V—试样消耗高锰酸钾标准溶液的体积，mL; V一空白消耗高锰酸钾标准溶液的体积，mL; 0 c 一高锰酸钾标准溶液的浓度，mol/L; V'—滴定时移取试样分解液体积，mL; m—试样质量，g; 37 0.02一与1.00 mL高锰酸钾标准溶液[c〔1/5KMnO〕=1.000 mol/L]相当的以克表示4 的钙的质量。 ?结果表示 每个试样取两个平行样进行测定，以其算术平均值为结果，所得结果应表示至小数点后两位。 ?允许差 含钙量10%以上，允许相对偏差2%;含钙量在5%-10%时，允许相对偏差3%;含钙量1%—5%时，允许相对偏差5%;含钙量1%以下，允许相对偏差10%。 11.饲料中总磷的测定 分光光度法 GB/T6437-2002; 11.1试剂 实验室用水应符合GB/T 6682中三级水的规格，本标准中所用试剂，除特殊说明外，均为分析纯。 ?盐酸溶液:1+1 ?硝酸 ?高氯酸 ?钒钥酸按显色剂:称取偏钒酸钱1.25 g，加水200 mL加热溶解，冷却后再加人250 mL硝酸，另称取钥酸按25 g，加水400 mL加热溶解，在冷却的条件下，将两种溶液混合，用水定容至1000 mL，避光保存，若生成沉淀，则不能继续使用。 ?磷标准液:将磷酸二氢钾在105?干燥1 h，在干操器中冷却后称取0.2195 g溶解于水，定量转入1000 mL容量瓶中，加硝酸3 mL，用水稀释至刻度，摇匀，即为50 μg/mL的磷标准液。 试样制备 取有代表性试样2 kg，用四分法将试样缩分至250 g，粉碎过0.42 mm(40目)孔筛，装人样品瓶中，密封保存备用。 11.2 测定步骤 11.2.1 试样的分解 ?干法{不适用于含磷酸氢钙[Ca(HPO)]的饲料} 242 称取试样2 g—5 g(精确至0.0002g)于柑涡中，在电炉上小心炭化，再放人高温炉，在550?灼烧3 h(或测粗灰分后继续进行)，取出冷却，加人10 mL盐酸和硝酸数滴，小心煮沸约10 min，冷却后转人100 mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，为试样分解液。 ?湿法 38 称取试样0.5 g—5 g(精确至0.0002 g)于凯氏烧瓶中，加人硝酸30 mL，小心加热煮沸至黄烟逸尽，稍冷，加人高氯酸10 mL，继续加热至高抓酸冒白烟(不得蒸干)，溶液基本无色，冷却，加水30 mL，加热煮沸，冷却后，用水转移人100 mL容量瓶中并稀释至刻度，摇匀，为试样分解液。 ?盐酸溶解法(适用于微量元素预混料) 称取试样0.2g—1 g(精确至0.0002 g)于100 mL烧杯中，缓缓加入盐酸10 mL，使其全部溶解，冷却后转人100 mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，为试样分解液。 11.2.2 工作曲线的绘制 准确移取磷标准液0.0、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0 mL于50 mL容量瓶中，各加钒铝酸钱显色剂10 mL， 用水稀释到刻度，摇匀，常温下放置10 min以上，以0.0 mL溶液为参比，用1 cm比色皿，在400 nm波长下用分光光度计测各溶液的吸光度。以磷含量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制工作曲线。 11.2.3 试样的测定 准确移取试样分解液1.0 mL—10.0 mL(含磷量50μg-750μg)于50 mL容量瓶中，加人钒钥酸铵显色剂10 mL，用水稀释到刻度，摇匀，常温下放置10 min以上，用1 cm比色皿在400 nm波长下测定试样分解液的吸光度，在工作曲线上查得试样分解液的磷含量。 11.3 测定结果的计算及表述 11.3.1 结果计算 式中:X一以质量分数表示的磷含量，%; m一由工作曲线查得试样分解液磷含量，μg; 1 V—试样分解液的总体积，mL; m一试样的质量，g; V一试样测定时移取试样分解液体积，mL。 1 11.3.2 结果表示 每个试样称取两个平行样进行测定，以其算术平均值为测定结果，所得到的结果应表示至小数点后两位。 11.3.3 允许差 含磷量0.5%以下，允许相对偏差10%;含磷量0.5%以上，允许相对偏差3%。 39