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人核因子κB(NF-κB)酶联免疫分析试剂盒使用说明书.doc

人核因子κB(NF-κB)酶联免疫分析试剂盒使用说明书

shen伟深
2019-06-13 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《人核因子κB(NF-κB)酶联免疫分析试剂盒使用说明书doc》,可适用于医药卫生领域

人核因子κB(NFκB)酶联免疫分析试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用产品编号:CSBEh检测范围:ngmLngmL最低检测限:ngmL特异性:本试剂盒可同时检测天然或重组的NFκB且与其他相关蛋白无交叉反应。有效期:个月预期应用:ELISA法定量测定人血清、血浆、细胞培养上清或其它相关生物液体中NFκB含量。说明.试剂盒保存:℃(较长时间不用时)℃(频繁使用时)。.浓洗涤液低温保存会有盐析出稀释时可在水浴中加温助溶。.中、英文说明书可能会有不一致之处请以英文说明书为准。.刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质此为正常现象不会对实验结果造成任何影响。实验原理用纯化的抗体包被微孔板制成固相载体往包被抗NFκB抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗NFκB抗体、HRP标记的亲和素经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的NFκB呈正相关。用酶标仪在nm波长下测定吸光度(OD值)计算样品浓度。试剂盒组成及试剂配制酶联板(Assayplate):一块(孔)。标准品(Standard):瓶(冻干品)。样品稀释液(SampleDiluent):×ml瓶。生物素标记抗体稀释液(BiotinantibodyDiluent):×ml瓶。辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液 (HRPavidinDiluent):×ml瓶。生物素标记抗体(Biotinantibody):×μl瓶(:)辣根过氧化物酶标记亲和素(HRPavidin):×μl瓶(:)底物溶液(TMBSubstrate):×ml瓶。浓洗涤液(WashBuffer):×ml瓶使用时每瓶用蒸馏水稀释倍。终止液(StopSolution):×ml瓶(NHSO)。需要而未提供的试剂和器材标准规格酶标仪高速离心机电热恒温培养箱干净的试管和Eppendof管系列可调节移液器及吸头一次检测样品较多时最好用多通道移液器  蒸馏水容量瓶等标本的采集及保存血清:全血标本请于室温放置小时或℃过夜后于xg离心分钟取上清即可检测或将标本放于℃或℃保存但应避免反复冻融。血浆:可用EDTA或肝素作为抗凝剂标本采集后分钟内于°Cxg离心分钟或将标本放于℃或℃保存但应避免反复冻融。细胞培养物上清或其它生物标本:xg离心分钟取上清即可检测或将标本放于℃或℃保存但应避免反复冻融。注:标本溶血会影响最后检测结果因此溶血标本不宜进行此项检测。标本的稀释原则:首先通过文献检索的方式了解待测样本的大致含量确定适当的稀释倍数。只有稀释至标准曲线的范围内检测的结果才是准确的。稀释的过程中应做好详细的记录。最后计算浓度时稀释了“N”倍标本的浓度应再乘以“N”。标准品的稀释原则:瓶每瓶临用前以样品稀释液稀释至ml盖好后静置分钟以上然后反复颠倒搓动以助溶解其浓度为ngmL做系列倍比稀释后分别稀释ngmLngmLngmLngmLngmLngmLngmL样品稀释液直接作为标准浓度ngmL临用前分钟内配制。如配制ngmL标准品:取ml(不要少于ml)ngmL的上述标准品加入含ml样品稀释液的Eppendorf管中混匀即可其余浓度以此类推。生物素标记抗体的稀释原则:临用前以生物素标记抗体稀释液稀释稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制(每孔μl)实际配制时应多配制ml。如μl生物素标记抗体加μl生物素标记抗体稀释液的比例配制轻轻混匀在使用前一小时内配制。辣根过氧化物酶标记亲和素的稀释原则:临用前以辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液稀释稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制(每孔μl)实际配制时应多配制ml。如μl辣根过氧化物酶标记亲和素加μl辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液 的比例配制轻轻混匀在使用前一小时内配制。操作步骤实验开始前请提前配置好所有试剂试剂或样品稀释时均需混匀混匀时尽量避免起泡。每次检测都应该做标准曲线。如样品浓度过高时用样品稀释液进行稀释以使样品符合试剂盒的检测范围。加样:分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液μl余孔分别加标准品或待测样品μl注意不要有气泡加样将样品加于酶标板孔底部尽量不触及孔壁轻轻晃动混匀酶标板加上盖或覆膜℃反应分钟。为保证实验结果有效性每次实验请使用新的标准品溶液。弃去液体甩干不用洗涤。每孔加生物素标记抗体工作液μl(取μl生物素标记抗体加μl生物素标记抗体稀释液的比例配制轻轻混匀在使用前一小时内配制)℃,分钟。温育分钟后弃去孔内液体甩干洗板次每次浸泡分钟μl每孔甩干。每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液(同生物素标记抗体工作液)μl℃分钟。温育分钟后弃去孔内液体甩干洗板次每次浸泡分钟μl每孔甩干。依序每孔加底物溶液μl℃避光显色(分钟内此时肉眼可见标准品的前孔有明显的梯度蓝色后孔梯度不明显即可终止)。依序每孔加终止溶液μl终止反应(此时蓝色立转黄色)。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性底物反应时间到后应尽快加入终止液。用酶联仪在nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)。在加终止液后分钟以内进行检测。注:用户在初次使用试剂盒时应将各种试剂管离心数分钟以便试剂集中到管底。每次实验留一孔作为空白调零孔该孔不加任何试剂只是最后加底物溶液及NHSO。测量时先用此孔调OD值至零。为防止样品蒸发试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内酶标板加上盖或覆膜。未使用完的酶标板或者试剂请于℃保存。标准品、生物素标记抗体工作液、辣根过氧化物酶标记亲和素工作液请依据所需的量配置使用。请勿重复使用已稀释过的标准品、生物素标记抗体工作液或、辣根过氧化物酶标记亲和素工作液。建议检测样品时均设双孔测定以保证检测结果的准确性。洗板方法手工洗板方法:吸去(不可触及板壁)或甩掉酶标板内的液体在实验台上铺垫几层吸水纸酶标板朝下用力拍几次将推荐的洗涤缓冲液至少ml注入孔内浸泡分钟。根据需要重复此过程数次。自动洗板:如果有自动洗板机应在熟练使用后再用到正式实验过程中。计算以标准物的浓度为横坐标(对数坐标)OD值为纵坐标(普通坐标)在半对数坐标纸上绘出标准曲线根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度再乘以稀释倍数或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式将样品的OD值代入方程式计算出样品浓度再乘以稀释倍数即为样品的实际浓度。注意事项当混合蛋白溶液时应尽量轻缓避免起泡。洗涤过程非常重要不充分的洗涤易造成假阳性。一次加样时间最好控制在分钟内如标本数量多推荐使用排枪加样。请每次测定的同时做标准曲线最好做复孔。如标本中待测物质含量过高请先稀释后再测定计算时请最后乘以稀释倍数。在配制标准品、检测溶液工作液时请以相应的稀释液配制不能混淆。底物请避光保存。不要用其它生产厂家的试剂替换试剂盒中的试剂。

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