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引物合成相关问题.doc

引物合成相关问题

Brady内利
2019-06-19 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《引物合成相关问题doc》,可适用于医药卫生领域

Q引物是如何合成的?目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。DNA合成仪有很多种,无论采用什么机器合成合成的原理都相同主要差别在于合成产率的高低试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。()    去保护:加入Deblocking脱去碱基上'OH的保护基团DMT获得游离的'OH()    耦合:同时加入活化剂和新的碱基新的碱基'OH仍然被DMT保护'端被活化与溶液中游离的'OH发生耦合反应()    封闭:耦合反应中极少数'OH没有参加反应用封闭试剂终止其后继续发生反应()    氧化:加入氧化剂使其由核苷亚磷酸酯形成更稳定的核苷磷酸酯。合成后处理:切割与脱保护基:将合成好的寡核苷酸链从支持物上化学切割下来。常用新鲜的浓氨水来裂解CPG与初始核苷之间的酯键。断裂下来的寡核苷酸带有自由的’羟基。纯化:根据所合成寡核苷酸的组成和应用来选定纯化的方法。常用的纯化方法有:C、OPC、PAGE和HPLC。定量:根据寡核苷酸在nm处的紫外吸收来定量。储存:分装抽干。Q引物纯化方式有哪些如何选择?◆ C柱脱盐:又称简易反相柱它对DNA有特异性的吸附可以被有机溶剂溶解洗脱但不会被水洗脱所以能有效地去除盐分。它不能有效去除比目的片段短的小片段。实际上它是一种脱盐的作用。这种方法一般不会对普通PCR反应产生影响。对于需要用于测序、克隆的引物不能使用这个级别。    ◆ OPC纯化:通过反相净化滤芯(ReversePhaseCartridge)对引物进行纯化纯化原理与反相HPLC纯化一样。与反相HPLC比较OPC是一种有效且更加经济的纯化方式。反相净化滤芯通常包含一种疏水基质如C的硅胶能够很好的吸附DNA并且可以用水轻松地将切割下来的保护基团和短的引物片段从反相柱上洗掉。OPC纯化的引物可以应用于DNA测序、PCR及基因合成等。◆ PAGE纯: PAGE纯化法是使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对DNA片段进行分离然后从凝胶中回收目的DNA的方法。PAGE纯化法也是一种非常有效的DNA纯化方法纯化后的DNA纯度大于对长链OligoDNA(大于mer)的纯化特别有效。 ◆ HPLC纯化:使用高效液相色谱的原理对引物DNA进行纯化。该方法用于分离纯化或分析时能达到很高的纯度和灵敏度。在引物DNA的分析和纯化中常用的有离子交换(ionexchange)HPLC和反相(reversephase)HPLC。reversephaseHPLC:纯度大于ionexchangeHPLC:纯度大于可以有效的去除N短片段。HPLC纯化主要用于短链和修饰引物的纯化。该法的缺点是成本较高批量生产效率不高。Q合成的引物’端是否有磷酸化?合成的引物’为羟基没有磷酸基团。如果需要您可以用多核苷酸激酶进行’端磷酸化或者要求我们合成时直接在’或’端进行磷酸化需要另外收费。Q需要什么级别的引物?根据实验需要确定订购引物的纯度级别。应用引物长度要求纯度级别要求一般PCR扩增<baseOPC>basePAGE诊断PCR扩增<baseOPC,PAGEDNA测序base左右OPC亚克隆点突变等根据实验要求定OPC,PAGEHPLC基因构建(全基因合成)根据实验要求定PAGE反义核酸根据实验要求定PAGE修饰引物根据实验要求定PAGE,HPLC   Q需要合成多少OD数?根据实验目的确定。一般PCR扩增OD引物可以做次ul标准PCR反应。如果是做基因拼接或退火后做连接OD就足够了。Q如何计算引物的浓度?引物保存在高浓度的状况下比较稳定。一般情况下我们建议将引物的浓度配制成pmolul称为保存浓度而引物的工作浓度一般配制成pmolul。加水的体积(微升)可直接参照合成报告单上推荐的体积也可按下列方式计算:V(微升)=OD数xx引物的分子量引物的分子量可以从合成报告单上获得。注意:OD=ugml。溶解前您需要核对合成报告单和引物标签上的引物OD数是否一致。如果不一致请和我们联系。我们可以根据生产记录查到实际产量是多少。Q如何计算引物的Tm值?引物设计软件都可以给出Tm与引物长度、碱基组成及所使用缓冲夜的离子强度有关。长度为base以下的引物Tm计算公式为:Tm=℃(GC)℃(AT)对于更长的寡聚核苷酸Tm计算公式为:Tm=xLogNa(GC)–size**公式中Size=引物长度。Q引物(含修饰)的分子量是如何确定的?非修饰的引物的分子量(MW)在随引物提供的报告单上可以找到。如果需要估计一个引物的分子量按每个碱基的平均分子量为引物的分子量=碱基数x碱基的平均分子量或按下列公式计算MW=(NA*WA)(NC*WC)(NG*WG)(NT*WT)(Nmod*Wmod)+(Nx*Wx)(NI*WI)*Ns–NA,NG,NC,NT,NI分别为引物中碱基A或G或C或T或I的数量WA,WG,WC,WT,WI分别为引物中碱基A或G或C或T或I的分子量NmodWmod分别为修饰基团的数目和分子量。对于混合碱基的分子量为混合碱基的分子量总合除以混合数例如GA混合的分子量为()=。Ns为硫代数目硫代每个位置增加分子量。常规碱基分子量BaseMolecularWeightACGTIU  常规修饰基团分子量’Biotin’TAMARA’(FAM)’Dabsyl’HEX’(FAM)’TET’AminoModifierC’Cy’AminoModifierC’Cy’ThiolModifierC    Q如何溶解引物?干燥后的引物质地非常疏松开盖前最好瞬时离心一下或管垂直向上在桌面上敲敲将引物粉末收集到管底。根据计算出的体积加入去离子无菌水或TE(pH)缓冲液室温放置几分钟振荡助溶离心将溶液收集到管底。溶解引物用的水一般不要用蒸馏水因为有些蒸馏水的pH值比较低(pH),引物在这种条件下不稳定。Q如何保存引物?引物合成后经过一系列处理和纯化步骤旋转干燥而成无色或白色絮状干粉。干 粉:运输时常温运输℃可以保存一年。储存液:配好后分装成几管避免反复冻融℃可以保存半年。工作液:常规使用℃保存也可℃保存但应避免反复冻融。修饰荧光引物:需要避光保存尽快使用为宜。Q引物定量不准是怎么回事儿?我们偶尔收到用户投诉定量不准的报告出现这种情况的可能性有:()定量错误、分装错误、引物抽干或收样过程中意外丢失。这种可能性有但是很少因为作为专业的引物合成公司我们的生产人员都是经过严格的专业培训这种错误是要求谨慎避免甚至杜绝的。一般情况下引物都有留样备份接到用户投诉后我们都会找出留样重新定量一般都没有问题如确实存在问题则可安排重新准备一份。()系统误差我们认为左右为允许误差。使用过程中引物工作浓度范围很宽定量上的少许偏差不影响实验。()用户收到引物干粉时打开引物管盖前没有离心或其他误操作导致引物干粉部分丢失。()用户没有能够正确理解引物OD数的含义没有能够正确使用分光光度计特别是使用微量测定用户没有将OD读数正确地转换成母液中OD数。这种情况比较常见。例如验证标OD引物量是否准确简单的做法是:加入ml水彻底溶解混匀后取ul,加入ul水用光径为cm的石英比色杯波长nm,此时光吸收的读数为。Q最长可以合成多长的引物?我们合成过base的引物但是产率很低。除非需要建议合成片段长度不要超过base。引物越长出现问题的概率就越大按照目前的引物合成效率大于base的粗产品全长引物的百分比不高后续处理还有丢失很多最后的产量是很低。Q为什么修饰引物的产量要比一般引物低价格要高主要因为是修饰单体稳定性较差偶连时间长效率低最后得到的产量自然低于一般的引物。修饰引物通常需要PAGE或HPLC纯化纯化过程损失大。修饰引物使用的原料是一般引物原料的几百倍所以产品的价格也高。Q引物片段退火后不能连接到载体上是什么问题?连接反应需要引物的’磷酸基团。如果需要将合成的引物退火直接连接相应的载体上引物需要磷酸化。磷酸化的产物如果还不能连接载体上需要检查载体的酶切效果需要改善引物退火的条件。SiRNA分子具有特殊的对称结构退火的难度较大退火时需要提高退火温度。Q如果测序发现引物突变是否有补偿?该如何处理?如果出现测序发现引物位置碱基错误的情况我们可以免费重合一次没有其他任何补偿或赔偿不承担其他连带责任这是国际行规。原因我们在前面已提到化学合成效率不可能达到。如果遇到这种情况首先和我们联系我们会检查合成序列是否和原始订单一致如果确认引物合成序列没有输错我们建议重新挑取克隆测序您可能会找到正确克隆的。根据我们经验个碱基以下的引物测个克隆就可以了个以上的特别是用于全片段拼接合成的就需要多测一些了。一般情况下每个克隆突变的位点都不一样正确的总是有的就是如何找到它。您也可以要求我们将引物免费重合一次不过重合的引物和第一次的引物一样都可能含突变不会因为重合的引物就减少您的遇到问题的几率。基因拼接过程中如果发现一段区域突变点不多就多测几个否则就重合一下引物。Q引物是经过PAGE纯化的为什么还有碱基缺失或插入?理论上分析型PAGE变性电泳可以区分引物之间一个碱基的差别。但是如果客户对长引物的量要求比较高为保证引物的量制备PAGE电泳上样量都是非常大电泳时的条带非常宽带与带之间有重叠分辨率已下降电泳后割带回收目的引物时很难说不割到差别仅几个碱基的引物。建议:减少OD数引物遇到的问题可能就会少一些。Q为什么引物的ODOD小于?需要指出的是ODOD的比值不能用来衡量引物的纯度。ODOD的比值过低一般是由于引物中CT的含量比较高所致。下表是一个base同聚体引物的ODOD的比值清楚表明ODOD的比值与引物的碱基组成密切相关。AratiosofCrudemerOligosofDifferingBaseCompositionsBaseCompositionAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAAAAGGGGGTTTTTCCCCC  Q同样的OD用PAGE检测EB染色为什么深浅不一?通常可以用EB染色的方法来判断双链DNA的量(如质粒DNA)因为EB可以嵌合到双链DNA中。而合成的单链DNA由于碱基组成不同形成二级结构的可能性不同EB的染色程度也会有差异比如Oligo(dT)等不形成二级结构EB染色效果就非常差。所以不要用EB染色的方法来定量而用紫外分光光度计检测。Q如何检测引物的纯度?实验室方便的做法是用PAGE方法。使用加有M尿素的的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。取OD的引物用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和上样前加热变性(℃,mins)。加入尿素的目的一是变性二是增加样品比重容易加样。V电压进行电泳一定时间后(约小时)剥胶用荧光TLC板在紫外灯下检测带型在主带之下没有杂带说明纯度是好的。如果条件许可也可以用银染方式染色。Q已经溶解的引物为什么原先使用正常而过一段时间再使用就不好了?如果您溶解引物的水pH过低或污染了菌或核酸酶会使引物降解。使用时没有充分解冻混合液体不均匀也可能会造成引物加入量不准确。建议分装引物避免反复冻溶。建议使用mMTrispH缓冲液溶解引物因为有些蒸馏水的pH值比较低(pH),引物在这种条件下不稳定。还有一种可能性是引物没有问题而是PCR使用材料特别是模板的质量与先前使用的不完全一致。Q引物是我们设计的现在您扩不出来我们要负责吗?不承担相关责任。我们为一些实验经验不足的客户免费设计引物提供一定的便利。我们遵循一般的引物设计原则设计好引物之后都会发给您确认而后再安排合成并保证引物质量。但是设计的引物是否能够满足您的实验要求一定扩增出您需要的基因片段谁也不能保证。QPCR扩增无目的片段是引物质量有问题吗?PCR扩增无目的条带或者非特异性扩增影响因素是多方面的需要耐心地分析如模板结构与质量、反应条件、引物设计等等。当今发展出各色各样的PCR扩增技术各色各样的高温聚合酶就是来解决PCR扩增中遇到的扩不出扩增效率低的问题。如巢式PCR就是扩增拷贝数很低的基因片段。通过提高模板质量、优化反应条件等方面找到对策或者有必要时重新设计引物最好在实验时设置对照来判定原因。如果您怀疑引物的问题请您首先测定您溶解的引物的OD值看实验时加入的引物量是否正确。如果量是正常的请您告诉我司您的引物编号我们会复查留存样品。如不明原因我们免费为您重新合成一次。如果仍然不能扩增请您查找其它原因。多数情况下我们复检引物质量都没有问题因为我们在引物出售前已经严格把好质量关。Q常用荧光染料参数染料Excitation(激发波长nm)Emission(发射波长nm)颜色FAMYellowgreenFluoresceinTETJOEYellowHEXCYYelloworangeTAMRAROXOrangeCyRed    注:关于猝灭基团的选择一般是报告基团的发射光在猝灭基团的吸收波长内。

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