DNA光复活过程电子转移机理的脉冲辐解研究

DNA光复活过程电子转移机理的脉冲辐解研究 DNA光复活过程电子转移机理的脉冲辐解 研究 第2q卷3期 2006年6月 安徽师范大学(自然科学版) JournalofAnhuiNormalUniversity(NaturalScience) Vf.29No.3 Jun.2006 DNA光复活过程电子转移机理的脉冲辐解研究 晏利琴,高华英,王梅 (安徽师范大学化学与材料科学学院,安徽省功能性分子固体重点实验室,安徽芜湖241000) 摘要:采用脉冲辐解瞬态吸收光谱法研究了水溶液中水合电子引发cis—syn型1,3一二甲基尿嘧啶 环丁烷型二聚体(DMUD)裂解,生成嘧啶单体和嘧啶阴离子自由基,以及在维生素l(3存在下,嘧啶 阴离子自由基和v之间的电子转移反应过程,测定了电子转移反应的速率常数.当没有V作 为电子受体时,嘧啶阴离子自由基能继续和DMUD进行链反应. 关键词:环丁烷型嘧啶二聚体;脉冲辐解;电子转移;维生素l(3;DNA光复活作用 中图分类号:0644.1文献标识码:A文章编号:1001—2443(2()o6)03—0245—04 近年来,随着大气臭氧层的消耗,生物圈受到紫外线(uV)线伤害日益严重.DNA是uV作』l}j于生物体的 主要靶分子,UV导致的DNA损伤的主要光化学产物是环丁烷型嘧啶二聚体CPD…,这些二聚体阻碍丁DNA 的复制和转录.在光复活过程中,DNA光解酶特异性地结合到含CPD的DNA上,在近uV—Vis光下,DNA光 解酶中"天线"辅酶(uQ)吸收光子并将能量传递给催化辅酶(FADH,活性形式为FADH一),被激发的FADH一 向CPD转移一个电子,使其裂解,恢复DNA双螺旋结构(图1). DNA光复活作用机理研究引起了生物学家和 化学家的关注,取得了许多研究成果…...光解酶 在自然界广泛存在,但人类自身不含有这种 酶川.为了弄清光复活的详细过程及多种因素的 影响规律,模型研究从分子水平上解释了诸多的生 O0 ",j『? o/P~.N八H N ^l1 L\ ,l 物学现象J.维生素K(VK)是一类萘醌衍生物,其\nearUV-Vkible/ 主要生理作用是促进血浆凝血因子的合成,在凝血: 酶原的合成过程中VK经历了酶促醌氢醌式氧化 还原过程.vK类化合物中v(化学名:l甲基一图1I)NA【fl一链_}相邻的胸腺嘧啶饮女n觜外光(2()0_300mn) l'4_萘酉昆磺酸钠)是一种人工合成的化合物,它也越反光解耕?"外刈蚍 是生物活性最强的VK类药物.VK3在PH>6的水Fig. 1111ymi.diformati0nbytackedth~finenu【I..the 溶液中会解离生成2一甲基一1,4.萘醌,Vl(3与UQstrandofdoubk~strandI)NAindt?cedbyUVt(2?300m"); 一 样,在生物膜的电子传递系统内都是氧化还原的reonatalysedbyDNAphotolya.~?刊usesL』Vi(300-500nm) 主要成分,是一种很好的电子受体. 本文以纳秒级的脉冲辐解瞬态吸收光谱为手段,研究嘧啶二聚体接收一个电子裂解成单体和单体自由 基及其后与v之间的电子转移反应,以及相关的动力学行为. 1实验部分 1.1实验方法 水辐解产生的水合电子与基质作用可产生短寿命的阴离子自由基R一,而水辐解产生的'OH自由基可 被加入的t-BuOH清除转变为不活泼的'C(CH3):OH_1: H2()_+H','OH,e二,H2()2,H2,(1) 收稿日期;2006—01—19 基金项目:安徽师范大学青年基金(2004XQN13). 作者简介:晏利琴(1974一).女,安徽含山人,副教授,博士 安徽师范大学(自然科学版)2006伍 'OH+(C)3C0H一'CH2(C}{3)20H+H20.(2) 适当选择R与VK3的浓度比,可观察到R,与VK]问的电子转移反应,并从VK;一在340nm处的生成曲 线求得该电子转移反应的速率常数. R'+VK3一V+R.(3) 对一定浓度范围的VK,而言,其阴离子自由基的形成速率均可视为准一级反应.据此可导出反应式(3) 的表观衰减速率常数=k+[V]+k一[R].改变VK3的浓度,测得一系列R一的K山,以VK3的浓度对K山 作为一条直线,从而得到R,与v的反应速率常数. 1.2实验试剂和装置 cs)11型1.3一二甲基尿嘧啶二聚体(DMUD)由本实验室用1.3一二甲基尿嘧啶(DMU)为原料合成; Vit+unin(VK3)为生化试剂,用三次蒸馏水重结品;叔丁醇(t-BuOH)经蒸馏纯化.磷酸盐未经纯化直接使用. N纯度为99.99%.样品辐照前用N2除去氧气,鼓泡时间不少于20min.样品均用三次蒸馏水配制,用 Na.ttl()4和Kl,12I缓冲液调节值为7,0.5M的t-BuOH消除羟基自由基.试验在室温下进行. 术实验在纳秒级脉冲辐解瞬态吸收光谱装置上进行n.所用加速器的能量为8MeV,电子脉冲宽度为 8ns,脉冲电流2—3A,分析光垂直通过2cm的石英池.以空气饱和的1X10.MKSCN溶液进行单脉冲剂量的 标定,辐照产生的(KSCN);的产额c(KscN)1=2.9,它在480rim处的摩尔消光系数为7600L?tool,?cm,.详细 的没备及实验条件参见有关文献?. 2结果与讨论 2.1水台电子与DMUD的反应 2为经N,脱氧的2X10一mol/LDMU,t—BuOH及 pH=7的磷酸缓冲溶液经脉冲辐解后观察到的瞬态吸 收光谱,辐解0.7Izs后,在最大值约710nm处有一强吸 收峰,此为水合电子的特征吸收.随着水合电子峰 的衰减,DMU一在电子脉?q1结束后1.5ffs达到最大吸 收值,且最大吸收峰在290nm附近.在此实验条件下溶 液中,水辅解产生的活性粒子基本只剩下水合电子 e二,DMU与e二反应过程可表示为: 从图2可以看出譬N.2氧2,×1…0~mol/.L.N?2m的ol脉/L DMUD,t—BuoH及pH=7的磷酸缓冲溶液经脉冲辐解形),1.5(三角形.图.含DMu的矗脉冲辐后在2'90和 后观察到的瞬态吸收光谱,与DMU溶液的瞬态吸收光71o处吸收值随时间变化的曲线 谱相比较几乎完全相同,1.5}ls后在290nm处的生成Fig.2Transientabsorptionspectrainthepulseradiolysisof-statttred 轨迹也几乎一致.表明该溶液中有DMU一生成,且由a~[ueou8solution—taining2× lo4mol/LDrY(0?)DMUD(~ 实验数据可以看出此处峰生成的时间也与含DMU的and?)and5×10"mol/Lt—BuOH(PH=7)afrOand?)o-7,(? 溶液中DMU.一生成的时间大致相同.嘧啶二聚体和水and?)_fls_:thetimeepend..the8b砒290蚰d 合1乜子反应导致二聚体裂解为一个单体和,个单体阴……' 离子自由基的过程已经被普遍接受J.因为DMLID与水合电子反应生成的DMUD,裂解过程非常快,在本仪 器上无法观察到,谱图中290rim处的吸收峰为DMUD,裂解生成的DMU,的吸收.推测其机理为: e二+DMUD-~DMUD'一-*-DMU.一+DMU.(5) 改变DMUD的浓度,可观测710nm处e二的衰变,并求出DMUD与水合电子的反应速率常数为7.9X 109M,s,. 2.2DMUD,与VK3之间的电子转移反应 图3为含4X10,mol/LDMU,5X10mol/LVK3,t-BuOH及pH=7的磷酸缓冲溶液经脱氧脉冲辐解 29卷第3期晏利琴,高华荚,王梅:DNA光复活过程电子转移机理的脉冲辐射研究247 后观察到的DMU一瞬态吸收谱图.水辐解产生的H'很少,因此H.与底物反应可以忽略?.此时的吸收主要 来源于e二与DMUD(反应速率常数为7.9×109M,s)或e二与VK3反应(反应速率常数为3.1×10加M .-1)ns生成的阴离子自由基.可以看出,电子脉冲结束0.5kts后的瞬态吸收与DMU,的吸收谱相似,表明e二 首先与DMUD反应生成DMUD,进而裂解成DMU,和DMU.体系中的VK3也可能与e二(反应生成V一,但 根据两者各自与e二反应速率常数及其浓度的大小,可算出有96%以上的e二首 先被DMUD捕获生成 DMUD,进而裂解成DMU,和DMU.而图3中20~ts的瞬态吸收谱中350nm附近的强吸收峰归属于DMU,向 vK1转移一个电子所生成的V一的特征吸收,其电子转移反应为: DMU一十VK3---'DMU+V一.(6) 当溶液中H浓度达一定值时,V一会发生质子化转变为中性自由基: H+v一—'.vK1H'.(7) wavelength,nm 图3N2饱和的含4X10一mol/LDMUD,5×10,mol/lt—BuOH和5X10 mol/I.VK3的中性水溶液的脉冲辐解瞬态吸收谱:1.5(0),5(?), 2OILs(?),内插图:350rim处吸收值随tl~IE的变化曲线 Fig.3Transientab~rptionspectrainthepulseradiolysisofN2一s'tatum.1aqueous solutioncontaining4×10,mol/LDMUD,5×10mol/Lt.BuOHand5×10.mol/l VK3(PH=7)at(o)1,5us,(O)5Vs.(?)2o.Intuit:thetimedependence【m theabsorbancesat35Ohm 以VK]的浓度对上式的K作图,可求出式(6)的电子转移速率常数为5.8X109M,s.... 3结论 嘧啶二聚体与水合电子反应,形成嘧啶二聚体阴离子自由基,接着裂解成,个单体和一个单体阴离子自 由基.tteelis等?提出单体阴离子自由基和二聚体之间发生了一个链反应: DMU'+DMUD-'-DMU+DMUD.,(7) DMU+DMUD'—2DMU+DMU'.(8) 在没有V作为电子受体时,DMUD发生了链反应.而在有V作为电子受体的情况下,链反应根本不 发生.这一过程类似于生物体在DNA光解酶催化下进行的DNA复活作用,只是速度要慢很多】. 致谢:感谢中国科学院上海原子核研究所辐射化学实验室对本项工作的支持. 参考文献: … 1HEEL/SPF,K1MST,OKAMUP~K,eta】.ThephotorepairofpyrlmidinedimmersbyDNAphotolya8eandmcdclsystents[J].JPhotochern1)}I()tobiolB Biol,1993,17:219—228. [2]FRIEDBERCEC,WAIXERGC,SUEDEW.DNAqandmutager,.esis[J].Wa.d~nglonDC:ASMPress,1995:158—161. 248安徽师范大学(自然科学版)2OO6正 [1o] [11] [I2] [13] [14] [19] SANCARA.DNAexcisionrel~r[J].AnuRevBizchem,1996,65:43—81. SANCAHA.StructureandfunctionofDNAphotolyase[J].Biochemistry,1994,33(1):2— 9. SANCARA,MechanismsDNAexcisionrepair[J],Science.1994,266:1954—1956, PARKIfW,KIMS.r,SANCARA,eta1.CrystalstructureofDNAphotolyasefromeschefichi acoli[J].Science,1995,:强8:1866—1872. HEElJSPHAR3'MANRF.ROSESD.Photoenzymierepairofuv-也ma蒯 DNA-Achemistsperspectlve[J].ChemSocRev,1995.24:289—297. AUBEfflC,MArlHISP.EKERAPM,etal,DNAphotolyases:8tlvaelure— functionrelationshlps[J].NailAcadSciUSA,1999,96:5423—5427. 【1HOMAF.1jghtanddat-kinchro]lmfinrq)air:repairofUV— inducedDNAlesonsbyphotolyaseandotidenucleotideexcisionrepair[J].EMBOJ,1999, t8:6585—6598, SANCARGI{,E~zm'atiephotoreactivation:50yearsandeounting[J],Mutatl,2OO0.451:2 5—37. DEGRUIJIFR,ROZAT..DetectionofphotorepairofUV— inducedthyminedimmersinhurmmepidermisbyinnramofluoreseeneemicroscopy[J].JInvest D~rmaml,1991.%(6):903—907. t4AFdER1fA,ROI)WEl,I.VW.MAYESPA,生物化学评论[M]王明运译北京:科学出 版社.1965:186. VIREJC,PArI(I~,RCHEGJ,C[ql(IS'I'IANGD.Electrochemicalstudyofl,4-naphthixluinoneandKvitamins.Part?,vitaminsKlandKj[J]. Analusis,1978.6(9):395—400, BIIX'[ONCV,CREENSI'OCKC 【_,HELMANWP,eta1.CriticalreviewfIfFateconstantsforl'ett~tiotl8ofhydratedelectrons.hydrogenatomsand hydroxylradicalsinaqucx~ussolution[J].JPhysChemItefData.1988,17:513—890. WANGw ?,,LUOJ,YAOSn,et.|nterac.fioupht~lieantkmxidm~lsandhydroxylradit~s{J3.RadiatPhysChem.1993,42(4—6):985—987. YAOSD,SIIENGSS,CA[JH,eta1.Nanosecondpulse-radiolysisstudiesinChina[J].RadiatPhysChem,1995,46(1):105,l1O, JOUFY,FI~EMANGR.Opticalspectraofelectronssolvatedinli(pfidethers:temt~ratureeffects[J].CanJChem.1976,54(23):3693一.3704. HUBIGSM,DIONNEBC,Effectofmicellarn~x/iaOF/theelectron— tran~erre.actionbetweeubet~ylbiologenandquinines[J].jPhysChera.1986,90 (2):5873—5878. IIEI:I.ISf'DEI,:l{IEI)J,KIMSrr,eta1.Splitting(?is—s1eyclobutanethymine— thyminedimersbyr-adiolysisanditsevancetoEnzymatic I)hcm)reacti,},tion[J].JutJI~diatBi0I,1992.62:137—143. PulseRadiolysisStudiesoftheElectronTransferMechanism intheDNAPllotoreactivationProcess YANLi—qin,GAOHua—ying,WANGMei (c"liegelalemistryatldMatch:dsScience.M~huiKey1'..~boratryofFunetil"1aJMolecular Solids,AnhuiNormalUniversity.Wuhu241000.China) Abstract:Utilizingapulseradiolysisequipmentwithtime— resolvedopticaldetector,kineticprocessesofelectron—induced splittingofcis—syn1,3一 dimethyluracilcyclohutanedimer(DMUD)inaqueoussolutionaI1einvestigatedinthepresenceor absenceofVitmnin(VK3).Ithasbeenobservedthatcyclobutanepyrimidinedimerreactingwithhydratedelectron splitsspontaneouslytogiveamonomerandamonomerradicalspeciesandtherateconstantsofelectiontransferfromthe lnonomerradicalaniontoVK3havebeendetermined.OnthebasisofcomparisonoftheinteractionsbetweenDMUDand hydratedelectroninthepresenceandabsenceofVK3,8chainreactionprocessintheabsenceofVK3hasbeen demonstrated. Keywords:cyclobutanepyrimidinedimer;pulseradiolysis;electrontransfer;vitaminK3;DNAphotomactivation b_寸n