关于pEASY T载体
摘自<小木虫>科学卫士论坛
发言
中层任职表态发言幼儿园年会园长发言稿在政协会议上的发言在区委务虚会上的发言内部审计座谈会发言稿
pEASY-T1、T3从Invitrogen的pCRII而来,pEASY-T5 zero来自Invitrogen 的pCR4topo zero,Invitrogen已经换了抗生素,不用Amp + Kan,新一代载体用Kan + Zeocin (博来霉素)。根据我们院校使用pEASY-T or B 的结果,发现两个问题: 1) 白斑常常只能在一种抗生素中生长,而另一种抗生素中不长,这些克隆是M13不能测序的污染质粒;如果Kan里生长,你可以试一试用T7去测序,然后将序列拿到NCBI 网上Blast 或者与Transgen的网页上的所有载体进行比对(Alignment,可以下载Genecode的Sequencher 4 或5 demo版本来做比对,非常好用,100个序列一眨眼就完成),你可能会发现他们的污染是怎么来的、什么载体污染。
Transgen (全式金)的pEASY-T5 克隆区两侧测出来的序列与他们网上提供的序列是完全不一样的,实际测出来的序列是pCR4blunt zero (美国英骏公司)的克隆区序列,不知为什么要隐瞒,可其余序列100%与之相同啊?!另外, pEASY-T5 zero中,用了ccdB基因,可ccdB本身在载体的UV5 Promoter 下不能抑制空载体生长(蓝斑),Invitrogen只是炒了个ccdB自杀基因的概念,买了专利使用权限,有苦说不出,不好向股民交待。不信你拿Invitrogen的pCR4topo zero, 或pCRblunt zero, 用她的载体1ul, 用T4 DNA连接酶连接(Vector 1 ul,10XT4 buffer 1 ul, H2O 7 ul, T4 DNA ligase 1 ul, 22度,2小时),然后转化感受态,IPTG + X-gal 显示蓝白斑。你会发现大量蓝斑,因为载体自连,LacZa 表达了,与LacZa 融合的ccdB也应该表达了,但不能压制
空载体(蓝斑菌落)。这种情况下,Invitrogen还在打什么“Zero Background’ 岂不是有些欺骗科学界的意味?Transgen的快速克隆试剂盒用的是英骏的第一代拓扑异构酶技术,里面会有不少于10%的空载体,Invitrogen用Hind3酶切后加识别接头,全式金只是改成EcoR1酶切后加接头。所以,我们用全式金的载体试用装,用T4 连接酶自连过,居然有很多白斑,知道为什么吗?要想零背景,您可以:
1)不用IPTG和X-Gal, 自然就全是白斑,--零背景了;
2)Not in-frame with LacZa, 让T载体自连也不会与LacZa的读码框一致;
3)Delete LacZa ORF ( did as Tiangen Biotech VT204,there is no LacZa open reading frame, but UV5 promoter and Lac I binding site are still there. So, if Tiangen’s VT204 user instruction is conducted, it’s Eco47 IR gene could not be expressed, How does Tiangen call it zero back ground vector? Fraud?).
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