[doc] 化学法标记高敏感性生物素化基因探针

[doc] 化学法标记高敏感性生物素化基因探针 化学法标记高敏感性生物素化基因探针 ? l56? 3讨论 生物化学与生物物理进展1993年第2O卷第2期 体内0产生于微粒体井依赖于还原型辅酶II 的酶促反应,线粒体电子传递匣一些物质的自氧化等 过程.o的产生与清除处于动态平衡..动物体内不 同诅织中cuzn—SOD及Mn—SOD的分布及其活性不 同是与晷组织亚细咆结构形成0的量不同有关.它 们属于同工酶,具有组织器官和细胞部位特异性,它 们的这一特性在体内自由基代谢调节方面以及生物学 和医学研究方面均具有重要意义.测定不同组织中这 两种SOD比活性有助于衰老机理研究匣心血管疾病, 肿瘤,肾瘸等病因探讨,Oberley等人”报道,几乎所 有肿瘤组织Mn—SOD话性均降低或缺少,这一现象可 作为判断肿瘤的基本特征之一.不同类型的盱癌组织 T-SOD和Mn-SOD均低于正常肝组织.急性心肌梗 塞患者在发病2内,血浆Mn-SOD活性升高,阳 性率达100~o”.另有文献”报道衰老的大,小鼠肝 脏中T—SOD比活性明显降低. 将肾上腺素自氧化法与KCN抑制法区分两种 SOD的方法相结合,应用于Mn—SOD活性测定尚未 见报道.本实验结果提示:在反应液中KCN终浓度 为0.2mmo1]L时红细咆CuZn—SOD话性被抑制 92%,组织匀浆上精液SOD活性被抑制B5—92%,这 与文献报道”„“基本相符.该方法重复性,稳定性电 好,而且操作简便. 参考文献 1方允中,李文杰主编.目由基与酶——基础理论厦其在 f一f 生物学和医学中构应用.北京:科学出版社,1989:7i一, 8D 2MrkIdSL.CoPper—andzinc—Goo.t=iningsupe? ro1aedi5muta$~-maaganas?coDtlnlngsupcto? xidedismutaEe.Cat3las~andglutathloneper口IJ_xi daseiqoormslIndnGoplastichum4QceI1Line} and?0rmalhuman【ss.Cd,Ref~rch.1982: 42:1955 3T1erDD.p0】atographicassayandiD,race[Inhr distrlbut;010.0fsupetoxidedismtLtaseinrIier. BiothemJ.1975;147:493 4MeanellaMRF.JonesR.Propert8.fIperm/g- tozoalsup~roxldedismut?endIaek0fi州ve. m~D.t0f8peroxidesinmctstic4taIys~dlipid— pefoxidatloQractioninsc?c皿.BlockemJ.1880: lg1.;89. 5魏重琴,艾建芳.超氧佗物歧化酶肾上腺素自氧化测定 珐的研究,生物化学与生物物理进展,1989;l5(2):i14 „BrsdfordMM.Ar4口idandsensitlye皿ethodfor theqqamitatio口ot?icrogrsmqu?ntit~IofPro_ tejnutilizing【}】eprinclpleofProt?in-dyebindl? nz.AdBioe~e.I9;72:24B ,Ober1~LW,Buett?GR.RoleSupe~o,ideDi- ?mut45ti?C?ncer:ARe琏橱贵贞 (蔼墓两免磊?) 关键词生物紊化基因探针,Southern杂交?_???.?.?.?..?-一 非同位素DNA探针由于具有可长期保存,对人 体无害,能缩短检测时间等优点,因而应用潜力很大. 其缺点是检测敏感性较差,故在桅测特定基因,特别是 人基因组单拷贝基因时受到限制.我们曾报道运用化 学方法将生物素标记在DNA上,探针检测敏感性 达到4Pg”】,在此基础上覆们对一系列实验条件进行 了探讨和改进,又用该法制备了生物素化IL一2Ro基 因撂针和!L-6eDNA探针,探针敏感性高达Pg以 R;7上?f 下水平,将它们用于Seuthera杂交和菌落原位杂交, 均获良好结果井可从人基因组DNA中清楚检阋出 单拷贝基因. 1材料和方法 I.1材科 „自求恩医科大学免疫学教研宣, 投稿日期:1991-12—05崔圄一期:1992-01-~ 生物化学与生物物理进展1993年第堂苤期 生物素一e一氨基己酸一N一羟基琥珀酰亚瞳(BAHS), 链霉亲和素(.A),碱性磷酸酶标记生物紊(B—AP), ,一溴一4一氯一3一吲噪磷酸盐(BCIF),硝基蓝四氮唑 (NBT)均为Siflrm~产品,生l物素购自Serva公司,其 余标记用化学试剂均为国产产品( 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 纯). I.2方法 I.2.I生物素一N一羟基琥珀酰亚胺(BHS)的制 备见文献【21. I.2.2探针标记以碱往?提取p~ISB15质柱 (含人IL一2RDA)艮含鼠[L-6eDNA重组质粒 (pJEM+rail一6),并以常规方法将质粒纯化后,先 后用Hind|II和EcoRI限制性内切酶进行消化,用 透析袋法回收673bp的IL一2ReDNA片断和637 bp的IL一6eDNA片断.采用化学方法”对探针进行 标记.所不同的是标记时分别采用了BHS和BAHS~ 乙二胺的修饰对间为3.5h. I.2.3人基因组DNA的提取见文献[{】. I.2.4Sotttherrl杂交膜的准备人基因组DNA 用Hind1II限制性内切酶消化完全,用0-7%琼瞻 糖凝胶分带,将凝胶浸泡于0-5tool/I-NB0H一0.~mol/ LNacl中,轻摇}5min,用双燕水漂洗两遍,再将其 浸泡于tmo1]LTris?HC|(pH7.5)一1.5mol/LNICI 中,轻摇30mla.更换同样液体后再作用15mla?DNA 转移前先将硝酸纤维膜(NC膜)浸入双蒸水中数 mIn,再于6xSSC中浸泡5rain.用15×SSC将凝 胶中DNA转移至NC膜,膜用6xSSC凛洗,凉干 后置80?烤膜2h. I.2.s菌落原位杂交摸的准备取一灭菌NC 膜,覆盖在菌落上,NC膜润湿后将其揭下,菌落面朝 上铺在另一培养基上,37屯2h.将NC膜依次作以 下处理:0.5m.l,LNaoH,5皿?2攻;1too1]I, Tris?HCI(pH7.?),2min2次;0.5toolTfi5? HC1一lmol/LNaCI(pH7.4),4miIa;2xSSC,5min 2次,凉干;1mg1RN~se室温40mln;500/~g./ml 蛋白酶k,室温50min;氯仿,细in2次;2×ssc, lmill3次;室温凉干,80?烤膜2h. 1.2,6预杂交和杂交NC膜在含5×SSC,5x Denh~rdt(1xDenttardt为0.02%Fo1l_0.02%聚 乙烯吡咯烷酮,0.02%BSA),50%甲酰胺,0.2mg/ ml鱼精子DNA,0,1%$DS,20mra.~l/I,PBS(pH 6.5),lmmo1]l~I~DTA的预杂交液中于?2屯预杂交 扯,再置含6xSSC,511%甲酰胺,2xDe~lhatdt,0.2 m~]ml血精子DNA,0.1%SDS,20mmol/l~PBS (pH65),1mmol/LEDTA,0-15/~g/ml探针的杂交 液中于42?杂交约2011. I.2.丁显色捡删洗膜和封闭见文献【1].先作 预实验摸索出sA和B—Ap两者最佳配比i褒度.正式 柱铷前先将sA(1g,m1)和B-Ap(0.5g,m1)溶 157? 于Tris缓冲液(0.1mol/LTris?HC1pH7.5—0.15 tool/LN4cl一5??几1/LMgC1-0.5%小牛血清)中作 用20mln,以形成复台物,再将NC膜浸入其中于室 捣轻摇20min,取出用含o.05%吐温的上述缓冲液 洗膜3遍,每遍t0min,再用STM溶液【0lmo1,L NaC1-0.1m.I/LTris?HClpH9.5—5mtool/LMgCI) 冼2遍,每遍5min,置NBT-BCIP溶液中避光显色 3h . Z结果 2-IBHS和BAILS标记的IL一2ReDNA撵 针的敏感性 分别用BHS和BAHS对IL一2R.eDNA作了 标记,用斑点杂交法对探针作敏感性飒6定.图1中a,b 分别 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 示用BItS和BAHS标记的IL一2R.eDNA探 针作斑点杂交捡测结果,图中待检IL一2R.cDNA的 含量从1至7点分别为Ing,250pg,63l5探针的敏基性 ?l5e?生物化学与生物物理进展1993年第20卷第2期 2.3soutIn杂交控测IL一2R单拷贝基因 分别用BAHS标记的1L-2RcDNA探针和 ~JSBI5质粒探针与经HindII!酶切的人基因组DNA 怍Southern杂交,结果它们均能从人基因组DNA中 检测出IL一2R单拷贝基因(见图2a,h).为了便于 对测出的基因条带进行定位,我们又同时将生物素标 记的DNA探针与电婊时作分子量标记之用的Hi— nd【ll酶切zDNA作了Southet~杂交(图2c). 从图2可见测出的IL-2R基因条带位于阔一位置,均 在约4.2kb处. 圉3生物素标记的lL_2ReDNA撵针和OJSBI5 探针怍SoutherD杂交检测lL2R单拷贝基因 2.4菌落原位杂交检测lL一6cDNA阳性菌落 为探索生物素化DNA探针作基因克隆筛选的效 果,将含不同重组质粒的大肠杆菌培养后,把菌落原 位转移至NC膜,用同样方法标记的生物素化lL一6 eDNA探针作菌落原位杂交,图3中”1为IL一6eDNA 阳性菌落,”2—5”均为阴性曲落,检测结粜表明,除 1L一6eDNA阻性菌落呈明显显色外,阴性菌落l,匀基本 不显色. 田?曹藩原位杂交检测11.-6eDNA鼯惶苗藩 3讨论 基因探针的标记方法以同也素标记往最为常见, 其最大优点是检测敏感性高,但由于词位素半衰期短, 操作不安全.放射自显影时间长,价格较昂贵等弊端, 非同位素基困探针标记方法正日益受到人们重视.在 诸多非周位素标记方法中,生物素标记探针是目前被 认为很有发展搭力的一种方法.基因探针的生物素标 记法目前最多用的是”缺口翻译法”,其次有光敏生物 素法,据报道这两种方法均有较高的检担c敏感性”,但 它们备自也存在一些缺点.”缺口翻译”标记法,由于 它是一种酶促反应,故要求披标记核酸有较高纯度,否 则影响标记效果,另外试剂本身性质也不稳定;光敏生 物素也有试剂性质不够稳定的缺点,遇光和紫外线易 分解,这培保存和运输均带来不便.相比之下,本文的 化学标记法有I下一些优点:a.对于待标记核酸的纯 度要求较低,因而标记效果稳定,重复性好;b.标记用 试剂性质比较稳定,可长期存放;c.生物素可自行活 化,其它标记用化学试剂均为国产试剂,价格低廉;d 由于采取化学标记法,适合于大批量制备探针,因而为 基因探针试蕞盒的生产创造了有利条件. Southern杂交技术广泛用于对特异基因序列的检 测和分析,但这一方法要求探针有较高敏感性,特别是 要从人基因组DNA中检测出单拷贝基因,对探针的 敏感性要求就更高.为此许多非同位素探针在这一方 法的运用上受到了限制.从本文实验结果看,化学法 标记生物素基因探针的方法已能畦任这一要求,由此 它可望取代或部分取代同啦素标记方法而发挥作用. 在标记IL一2R基因探针时,我们对BAHS和 BHS这两种不同的活化生物素进行了比较,结果表 明,前者可获得更高的检测敏感性,这可能由于前者是 一 种”长臂生物素”,以它作标记物,可进一步延长生 物素与探针之间的连接臂,利于生物素同亲和素结合, 从而提高探针检测敏感性.实验结果还表明,无论用 BHS还是用BAHS进行标记,质粒撵针均较eDNA 探针有更高敏感性,其原因可能同探针长度有关.为 此我们认为,如果已证实质粒载体序列biOti? ny1ated.uc[eicacidhybridizati0probe5.Nj ~idi品l9B6;l4(24):9965 Samhr【,1]kJ.Frit5chEF,ManiacisTf4f.0. 1e.Cloni.Secondedition.ColdSpringH|. rborLabOfat0f,p?S.1989I.21—1-52,6.2B 4Pe…MJ,MOr?yCA,HolmMf口f.Prepara. ti0nnthothDNA8ndRNAorhybrid1zation analysisfm】limitigguanrite~oflymphoid ce?s.,0fLelf,.1988;18:219 5WilchekM.BfEA.The~vidiD—bioti~c0mplez inbioanalytleaI4pplic~tihi,fi.natBio~~em,1988? 171:I