3株噬菌蛭弧菌裂解特性及在水体中的应用研究

3株噬菌蛭弧菌裂解特性及在水体中的应用研究 3株噬菌蛭弧菌裂解特性及在水体中的应用 研究 第29卷第1期 2010年1月 球 FISHERIES 科学 SCIENCE Vo1.Z9No.1 Jan.2010 3株噬菌蛭弧菌裂解特性及在水体中的应用研究 郭洪新,贾朋辉.,王兴华,李光 (1_山东宝来利来生物工程研究院,山东泰安271000;2.江南大学,江苏无锡214122) 摘要:对从海水中分离的3株噬菌蛭弧菌Blb-1,Blb-2,Blb-3在不同条件下的裂解特性进行了初步 研究,并进行了Blb-2裂解水体哈维氏弧菌的应用试验.结果 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明,3株菌在盐度为0,3O时均能良好 生长,具有广盐性;3株菌对灭活后的宿主菌具有更强的裂解作用,形成噬菌斑的时间普遍提前,且噬 菌斑较大;3株蛭弧菌的裂菌谱试验以及不同蛭弧菌菌龄的裂解效果试验表明,3株菌对气单胞菌属和 弧菌属细菌均有很好的裂解能力,而对水产益生菌芽孢杆菌,乳酸菌等裂解能力很弱;应用试验表明, 噬菌蛭弧菌对水体中的哈维氏弧菌具有较强的的清除能力. 关键词:噬菌蛭弧菌;裂解;噬菌斑 中图分类号:S917.1文献标识码:A文章编号:1003-11l1(2010)01-0011-04 2O世纪以来我国的水产养殖业得到了长足发 展,随着养殖规模的进一步扩大,养殖环境日益恶 化,病害日益严重,给水产养殖业造成了严重的经 济损失,细菌性疾病是影响水产业发展的一个重要 因素,据报道,水产养殖病害中细菌性疾病占49, 每年造成巨大的经济损失.水产动物细菌性疾病 已成为制约我国水产养殖业持续发展的瓶颈,细菌 性疾病以气单胞菌属(Aeromonas),弧菌属(Vibri- 0)等为主要病原菌,大部分为革兰氏阴性菌,广泛 存在于养殖水体中[1]. 抗生素类药物在疾病防治方面起到了积极作 用,但也带来了很严重的负面影响,耐药性,药残, 食品安全等问题日益突出.迫使人们寻找解决防 病治病的新途径,采用生物防治已成为人们的关注 热点. 1962年Stolp首次发现寄生型细菌一噬菌蛭 弧菌(Bdellovibriobacteriovorus),该菌属于革兰 氏阴性细菌(G一),其主要通过黏附,侵染,裂解宿 主菌方式使其自身得以生长繁殖[3],蛭弧菌广泛存 在于自然界,捕食细菌以抑制细菌过度生长,以维 持微生态平衡[4].研究表明,蛭弧菌在水体净化, 疾病预防等方面发挥极其重要的作用[s-TJ.笔者对 从海水中分离的3株蛭弧菌不同条件下的裂解特 性进行了初步研究,并进行了Blb一2裂解水体中哈 维氏弧菌(.harveyi)的应用研究.目前,国内外 关于噬菌蛭弧菌对弧菌病防治研究的报道很少,本 试验测定了噬菌蛭弧菌对哈维氏弧菌的清除能力, 为开发噬菌蛭弧菌微生态制剂在水产养殖领域的 实际应用提供理论依据. 1材料与方法 1.1试验材料 试验用菌株一噬菌蛭弧菌Blb-1,Blb一2,Blb-3 均为宝来利来公司保存菌种;宿主菌株大肠杆菌 (Escherichiacoli)7341,猪大肠杆菌2l16,大肠杆 菌K..,鸡大肠杆菌O,O,o.,枯草芽孢杆菌(Ba- cillussubtilis),地衣芽孢杆菌(Bnfilluslicheni— formis),植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum), 嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)均为宝来 利来公司保存菌种;副溶血弧菌(V.parahaemo— lyticus)购自中国海洋大学;哈维氏弧菌购自大连水 产学院;弧菌HH一1,HH-2,HD-1均由发病鱼体内 分离得到. 1.2培养基的制备 自来水双层琼脂培养基:蛭弧菌分离和纯化用 培养基为双层琼脂上,下层分别为0.6,1.2%琼 脂的自来水培养基,用于蛭弧菌的培养和计数引. 营养肉汤培养基(Nutrientbroth,NB):牛肉膏 3g,蛋白胨10g,氯化钠25g,蒸馏水i000ml,121 ?灭菌15min. 1.3菌悬液的制备 蛭弧菌液的制备:将Blb一1,Bib一2,Blb一3活化 培养18h,分别接种到营养肉汤培养基中,于3O? 恒温摇床振荡培养24h,冰箱4?保存备用. 收稿日期:2008-12—29;修回日期:2009—03—25. 基金项目:海洋公益性行业科研专项(200805069). 作者简介:郭洪新(1974一),女,助理工程师,研究方向:动物微生态;E— mail:sdtaghx@126.Corn.通讯作者:李光(198o一),男,工程 师,研究方向:水产动物病害和水产微生态;E—mail:liguangguang20O0@163.corn. 水产科学第29卷 宿主菌浓菌悬液制备:将大肠杆菌7341,猪大 肠杆菌2116,大肠杆菌K鸡大肠杆菌0,O., O.,枯草芽孢杆菌,植物乳杆菌,嗜热链球菌,副溶 血弧菌,哈维氏弧菌,HD-1,HH一1,HH,2活化培养 18h,接种到NB液体培养基中,200r/rain,30?振 荡培养24h,3000r/rain离心10min,加入灭菌生 理盐水,制备成2.0×10"cfu/ml的菌悬液,冰箱4 ?保存备用. 1.4不同盐度下蛭弧菌的裂解效果与生长试验 将培养基上层,下层盐度均调节为0,10,20, 3O,35,4O,45,50共8个梯度.于无菌培养皿中加 1.2琼脂制成下层平板,取稀释好的蛭弧菌液0.5 ml与宿主菌悬液1ml于灭菌试管中,并加入5ml 已灭菌并冷却至55?的0.6上层琼脂,混匀倾注 到下层平板上,30口C培养连续观察3d,记录备平板 上噬菌斑生长情况.每个梯度3个平行,出斑数目 取平均数. 1.5不同宿主菌状态对裂解效果的影响 将大肠杆菌K副溶血弧菌,哈维氏弧菌, H1,HH一1,HH一2制备液于121?灭活15min, 制备成灭活宿主菌液备用.将稀释好的蛭弧菌液 分别对灭活宿主菌和未灭活宿主菌进行裂解,采用 双层琼脂平板法,每个梯度3个平行,30?培养,观 察并比较各平板上噬菌斑形成情况. 1.63株蛭弧菌裂菌谱试验 分别以大肠杆菌7341,猪大肠杆菌2116,大肠 杆菌K鸡大肠杆菌O,,o.,枯草芽孢杆菌, 地衣芽孢杆菌,植物乳杆菌,嗜热链球菌,副溶血弧 菌,哈维氏弧菌,HD-1,HH一1,HH一2的浓菌悬液为 宿主菌,用Bib一1,Blb一2,Blb一3进行裂解,观察并记 录噬菌斑形成时间与大小. 1.7不同蛭弧菌菌龄对形成噬菌斑的影响 将Bib一1,Blb一2,Blb一3以相同接种量接种于营 养肉汤培养基中,分别培养12,18,24,3O,36,42, 48,60h,以灭活大肠杆菌K..为宿主菌,用双层琼 脂平板计数法测定噬菌效果. 1.8蛭弧菌Bib一2对水体中的哈维氏弧菌的裂解 效果试验 将1ml蛭弧菌Blb一2(1.0×10.pfu/m1)与1O ml哈维氏弧菌(1.0×10.cfu/m1)接种于装有100 m1无菌水的三角瓶中,3O?,200r/min振荡培养, 每间隔24h取样一次,利用自来水琼脂双层平板法 和TCBS培养基分别测定蛭弧菌Blb一2和哈维氏弧 菌的数量,连续检测8d,同时以相同浓度的空白哈 维氏菌菌和Bib一2作为对照. 2结果与讨论 2.1不同盐度下噬菌蛭弧菌的生长情况 蛭弧菌Bib一1,Blb一2,Bib一3在盐度为O,3O时, 生长情况受影响程度不大,而盐度为35,4O时,蛭 弧菌Bib一1,Bib一2生长受到抑制,盐度超过45时3 株蛭弧菌停止生长.结果表明,蛭弧菌Bib一1,Bib一 2,Bib一3在盐度为O,3O时均能很好的生长. 2.2噬菌蛭弧菌对不同宿主菌状态的裂解效果 结果表明,3株蛭弧菌对灭活后的宿主菌具有 更强的裂解作用,形成噬菌斑的时问普遍提前4,6 h,且噬菌斑较大.例外的是,哈维氏弧菌灭活前后 噬菌斑的形成时间和大小变化不大(表1). 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 原 因可能是蛭弧菌在攻击期进攻活的宿主菌膜时,由 于宿主菌自身特有的防御功能而使得双方有一个 "对峙"阶段;宿主菌经灭活后,细胞膜通透性增加, 它就变成了蛭弧菌的培养基,可以直入细胞的周质 空间,释放遗传物质提早进入裂解繁殖生长期. 表1宿主菌状态对Bl1,Blb-2,Blb一3噬菌斑的影晌 第1期郭洪新等:3株噬茵蛭弧茵裂解特性及在水体中的应用研究 2.33株噬菌蛭弧菌的裂菌谱试验强的裂解能力,但对水产益生菌芽孢杆菌,乳酸 菌, 3种噬菌蛭弧菌对弧菌属等G致病菌具有很光合细菌等并无裂解作用(表2). 表2蛭弧菌对各宿主菌的裂解效果 注;"+"表示蛭弧菌对宿主茵有裂解能力,"一"表示蛭弧茵对宿主茵无裂解能力. 2.4不同蛭弧菌菌龄的裂解效果 在培养过程中,Bib一1生长较快,在18h时已 清晰可见噬菌斑,24,28h时噬菌斑为2,3mm, 且噬菌斑大小圆整,32h后噬菌斑边缘逐渐模糊; Bib一2和Bib一3则生长较缓慢,在18h时无明显噬 斑,24h时有细小噬菌斑形成,在42h噬菌斑扩大 到3,5mm,边缘整齐,继续培养噬斑边缘逐渐模 糊.3株菌中,Bib一1形成噬菌斑早,且噬菌斑整齐, 边缘清晰;从噬菌斑大小看,Bib一2好于Bib一1和 Bib一3(图1). l7 \5 耋4, 馨 O 1U2U3040,U09,UU 蛭弧菌菌龄/h 图1不同蛭弧菌菌龄对形成噬菌斑的影响 2.5蛭弧菌Bib一2对水体中的哈维氏弧菌的裂解 效果 试验组同对照组比较,对照组Blb-2的数量在 8d中变化不大,而试验组经过3d的培养,菌体数 有明显的增加;哈维氏弧菌对照组中活菌数下降缓 慢,试验组在第2,3,4d下降迅速,第5d时数量少 于1000cfu/ml.通过监测蛭弧菌Bib一2与哈维氏 弧菌在三角瓶中的消长情况表明,Bib一2对哈维氏 弧菌有显着的裂解作用(图2). 8 9 萋 0 — ?一Blb-2对照组—..Blb-2试验组 t/d 图2蛭弧菌Blb-2与水体中的哈维氏弧菌消长关系 3结论 通过设定8个盐度梯度试验,表明蛭弧菌在盐 度为O,3O时,生长受盐度影响不大,证明蛭弧菌 Bib一1,Bib一2,Bib一3具有广盐性;通过蛭弧菌对灭活 及非灭活的宿主菌的裂解能力比较发现,3株蛭弧 菌对灭活后的宿主菌具有更强的裂解作用,形成噬 菌斑的时间普遍提前,且噬菌斑较大,研究表明,细 胞壁在决定蛭弧菌能否作用于某菌体时起重要作 用Lg].据Schelling等[10]报道,去掉宿主细胞壁的 外层结构,有利于蛭弧茵的吸附.由此可见,宿主 细胞壁有防御蛭弧菌入侵的某种物质,而死亡宿主 细胞壁外层结构被破坏,有利于蛭弧菌裂解增殖. 裂菌试验表明,3种噬菌蛭弧菌对弧菌属等G致病 菌具有很强的裂解能力,但对芽孢杆菌,乳酸菌等 水产益生菌并没有裂解作用,而水产动物病原菌大 多为G,故可将其制成微生物制剂来净化水体中的 病原菌,改良水产动物养殖水质L1妇;3株蛭弧菌菌 龄对于噬菌斑形成时间与噬菌斑大小有一定影响, 14水产科学第29卷 Bib一1生长较快,24,28h达到2,3mm;Blb一2, Bib一3生长则较缓慢,24h时均有细小噬菌斑形成, 在36~42h噬菌斑扩大到3,5mm,蛭弧菌Blb一2 的应用试验表明,Blb-2对水体中的哈维氏弧菌有 显着的裂解作用. 参考文献: [1]孙志明,栾会妮,姚维志.微生态制剂在水产养殖中的 作用口].水利渔业,2004,24(1):1-3. [2]谢群英,房文红,乔振国,等.蛭弧菌海水菌株Bdh5221 裂解特性及生长影响因子研究[J].海洋渔业,2007,2 (29):97-100. [3]StolpH,PetzoldH.Undersuchungenubereigenobli— gatparasitischenMikroorganismusmitlytischerAk- tivitatfurPseudomonasbacterien[J].PhytopatholZ, 1962,45(4):364-390. [4]MazalV,ShiloM.InteractionofBdellovibrobacteri— O~OgUS[J].JBacteriol,1968,95(1):744—753. [5]司稚东,秦生巨,秋频.细菌的寄生菌一噬菌蛭弧菌的 研究[J].中华微生物学和免疫学杂志,1982,2(1):12一 ?. [6]MarkelovaNY.EffectoftoxicDollutantsonBdell0一 ibrio[J].ProcessBiochemistry,2002,37(10):1177 1181. [7]StaplesDG,FryJC.Theoccurrenceandroleof Bdellovibriobacteriovrusinapollutedriver[J].Water Research,1974,8(12):1029—1035. [8]谢群英,房文红,乔振国.海水蛭弧菌分离纯化方法初 步研究[J].海洋渔业,2006,28(3):211-216. [9]赵孝先,白毓谦.蛭弧菌在细胞匀浆中增殖的初步研 究[J].山东大学:自然科学版,1990,25(2):270— 274. [1O]SchellIngm,ContiS.Hostreceptorsitesinvolvedin theattachmentofBdellovibriobacteriovorusand Bdellovibriostolpii[J].FEMSMicrobiologyLetter, 1986,36(3):319—323. [11]林茂,杨先乐,薛晖,等.蛭弧菌BDH21202对鱼类细 胞及病原菌的作用[J].微生物学通报,2006,33(1):7— 11. CharacteristicsinLysisandApplicationofThree StrainsofBdellovibrio口cerZODr GUOHong—xin,JIAPeng—hui,WANGXing—hua,LIGuang (1.AcademyofBaolai-leelaiBioengineeringCo.,Ltd,Tai'an271000,China;2.JiangnanUni versity, Wu214122,China) Abstract:Thecharacteristicsinlysisandapplicationofthreebacterialstrains,Blb,1,Blb一 2(tobreak Harveyivibrio),andBlb一 3,ofBdellovibriobacteriovorusisolatedfromseawaterwerestudiedunderdif— ferentconditions.ItWasfoundthattheeuryhalinestrainsgrewinthesalinityfrom0to30andha din- creaseinthelysisofthehostinactivated,anddelayedformationofplaque,biggerthantheother s.There werestronglyticcapacitiesofAeromonasandVibrioandweaklyricactivitiesofBacillustoyo i,andLacto— bacillus.TheapplicationshowedthatB.bacteriovoruseliminatedH.vibrioinwater.Ourresultsprovid— edthetheoreticalbasisfortheuseofB.bacteriovorusasprobioticsinaquaculture. Keywords:Bdellovibriobacteriovorus;lysis;plaque