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【doc】腺相关病毒末端反向重复顺序折叠结构在真核细胞染色体基因…

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【doc】腺相关病毒末端反向重复顺序折叠结构在真核细胞染色体基因…【doc】腺相关病毒末端反向重复顺序折叠结构在真核细胞染色体基因… 腺相关病毒末端反向重复顺序折叠结构在 真核细胞染色体基因… 第一军人学 A.adJs氍MI]M卅un】 l994(0.t):l'(5j423,427 423 4一4.,7' 腺相关病毒末端反向重复顺序折叠结构在真核细胞染色 体基因组上的整合作用? 郭葆玉胡宗林徐惠敏孔完:陆德如足7;-尸R,:q- ^提要腺相关病毒(Adeno-associatedvirug.AAv)是一类线状单股DNA(SS—DNA)的微小病毒. 依据Cava...

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【doc】腺相关病毒末端反向重复顺序折叠结构在真核细胞染色体基因… 腺相关病毒末端反向重复顺序折叠结构在 真核细胞染色体基因… 第一军人学 A.adJs氍MI]M卅un】 l994(0.t):l'(5j423,427 423 4一4.,7' 腺相关病毒末端反向重复顺序折叠结构在真核细胞染色 体基因组上的整合作用? 郭葆玉胡宗林徐惠敏孔完:陆德如足7;-尸R,:q- ^提要腺相关病毒(Adeno-associatedvirug.AAv)是一类线状单股DNA(SS—DNA)的微小病毒. 依据Cavalier—Smith的ssDNA病毒复制模型原理,将其末端反向重复顺序(ITRs)分离,变为折叠 十字架结构,再以其发夹中的3'_OH为引物台成另一股姊妹染色体DNA.然后搀价连接到亲代分子 上,与辅助病毒Ad2和PAAV/Ad共转染真核牛物细胞Southern印迹分于杂交结果 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明:插八这一 折叠结构中由SV40早期启动子控制的 报告 软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载 基因一新霉素抗胜基因拷』Jj已整合到细胞基因组染色体 上,这种以尤细菌DNA分子为支架的折叠结构不仅证明Cavalier—Smith的理论,而且可望为外源基 因导^真棱细胞提供新的又一系统. 新霉素抗性基因:基因转导 中国图书资料分类法分类号R374I:Q343 StudyontheIntegrationoftheAdeno—associatedVirusInvertedTerminalRepeat FoldStructureinEukaryoticCellChromosomeVitro GuoBaoyu.HuZonglin,XuHuimin.K.HgXiantao,LuDerulInstituteofMedical BiotechnologyandMolecularGeneticsSecondMilitar3'MedicalUniversity,Shanghai, 200433) AbstractAdeno—associatedvirusisasingle— strandedlinearDNAparvovirusDependingon Cavalier—SmithSmodeltheo~forthereplicationofSS— DNAvirus.theinvertedterminalrepeat ~ructurefI1s)fromPAAV,,'Neowasisolated,thelinearfragmentwasdenaturedandrefoldedover, andthedaughterDNAwassynthefizedbyusing3'一0H~rminusasaprimer.thenthenew strandwascovalentlylinkedtOtheparentalstrandAfterthepalindromicstructurewithresistance neomycinDNAcontrolledbySV40earlypromoterwastransferredintoeukaryoficcells.southern blotshowedthatthemoleculeofharpinstfu1.,'~urecouldfacilitateresistanceneomycinDNAIO integrateintochromosomesofmammaliancellsvitroTheexperimentalresultsindicatethatthe Cavalier—Smith.Srep]icativemodeliScorrectandprovideothernewsystemforDNA transduction KeywordsAAV:end—r0ld—ITRs;Neogene;transduction 作者单位l第二军医大学医学生物技术和分子遗传研究所,200433:2第二军医凡 学长征医院全军免疫中 心,200003 腺相关病毒因其具有定点整合 (19qi3一qter)及非病原性等特点而在基因 转移与治疗中可望作为较为理想的载体. 在宿主染色体DNA上的整合需要病毒 共转染",,Cavalier-Smith关于线状 ss—DNA分子的复制模式是复制过程中以 3,.OH端作为引物,在DNA聚合酶的作用 下合成另一姊妹股D】分子,然后共价的 连接到亲代未折叠5'端回文结构而进行 DNA复制,61.如果这一推论成立,坝4任 何线状双链DNA分子在有腺病毒(Ad)及 复制蛋白(WPep)存在时,只要共价的 连接,AAV一1TRs都可在体内整合,复制. 为此,本文将由SV40早期启动子控制的新 霉素抗性报告基因插入AAv的1TRs之 阃,将盲端双股DNA分子转导真核细胞, 以了解ITRs结构对整合及表达的影响 1材料和方法 1.1PAAV/Neo,PAAV/Ad由美国Pittsberg 大学Samulski博士提供:PAAV/Ad质粒 系在噬菌体EMBL-8分子上克隆含有AAv 1TRs和新霉素抗性基因,在EMBL一8上克 隆含有Ad一1TRs的质粒. 1.2腺病毒二型(Ad2)由上海第二医科 大学微生物教研室惠赠. 1.3Hela细胞株引自中科院上海细胞 所,在含10%FCSRPM11640培基中传 代,G-418由Serva公司生产,LotNo. 19O63c.蛋白酶K系Merck公司产品,Lot No.2o2V135768 1.4限制性内切酶XbaI,P?]I?,T4DNA 连接酶,DNA多聚酶I?舶0w大片段, dNI'P均购自华美公司:随机引物标记Kit 系Promega产品:一一dNI'P为北京亚辉 公司产品,比活度约111Ttkl/mmol.? 1.5构建末端折叠结构将PAAV/Neo用 XbaI和PvulI双酶切,分离499,41top片 E90?,6rain变性后迅速冷却至0?, 第二军医大学1994(oct):15(5) 再用DlNA聚合酶IKienow大片段,dNrP 以3r_0H为引物合成另一姊妹股(为十字 架发夹结构上的一端),连接反应按AAv rr结构DNA:新霉素抗性基因DA=10:1 在D】连接酶作用下15?反应过夜,再 用E)【o?消化处理线状D】分子,电泳鉴 定重组子后用于转导 1.6转导Hela细胞将十字架末段DNA ,PAAV/Ad5gg,Ad2 PAAV/Neo5职 (10PFU/ceI1)共转染Hela细胞,Ad2为电击 后加入.电击条件400V,35uF,0.04s在 Genepulm~o—gad)上进行.72h后,收 集培养物,冻融3次,56?45min灭活Ad2, 感染对数期生长Flda细胞(100储备液106 细胞).18h后,以1:10O00稀释后按50细 胞/皿种人两只直径10an平皿,24h后加 入G-418选择性培基(400两周后 见有细胞克隆形成,挑取克隆扩增 L7Southern印迹 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 蛋白酶K/Sacorsyl 法提取总染色体DNA,XbaI,PvulI酶切 后,以1%琼脂糖凝胶电泳,变性后转移硝酸 纤维素膜.舯?烘干2h,随机引物法标记 抗新霉素基因D】探针,预杂交42?6h, 然后加入一标记探针继续杂交过夜,洗 膜条件为lxSSC,0.1%SDS,42?30min洗 两次,0.5xSSC0.1%SDS,60?1h,干燥压 片,一70?自显影1周. 2结果 2.11TRs末端折叠结构'图1表示构建策 略,其三个主要步骤为:(11酶切分离末端反 向重复顺序(ITRs)线状DNA分子:(21变 性后构成十字架发夹结构:(3)与报告基 因抗新霉素.D】分子连结.酶切后电 泳见图2,A泳道为PAAV/Neo被PvulI酶 切后,抗新霉素基因电泳行为鉴定;B泳道 为Xbat/PvulI双酶切后,可见有499,41top 的两条带,即为ITRs的两条线性分子:C泳 道为PAAV/Neo用XbaI酶切后电泳行为, 第二军医大1994(Oct);15( 分子量为2.7kb的抗新霉素DNA分子;D 泳道的i噬菌体DNAHindm酶切后电 泳分子量,即marker. 22AAWNeo转导Hela细胞结果当用 PAAV, , ' Neo,PAAV/Ad和Hela细胞产生的 Ad2储备液转染对数期生长细胞后,约两周 见有细胞克隆形成(结果见附表),并显示重 组PAAV./Neo在Hela细胞中的转染效率为 35%,43% ITRsRapLipCapITRs AAV Pvu? Heatdenatured GAG3一0H Klenowfragment DNAPolymer~e 5 3. 不GAGGT T|DNAliizase ExoIll pvu? Neo?cin 囤1体外掏建末端反向折叠结构策略 Fig1st=t~fro.~otmsmlctlm0fI删蛔 ITRs??bi盯如yltro (J)IsolationoftheEnearI1Rsandheat d~nattaedtOformpalinck~'ic;f2)SyrUPsofthe dallghLt=rDNAstrandusing3'-OHasap(3】 Ligationofmslsmr~~cmycmDNAwithhai~in AAV一兀'Rs 425 附表转染重组AAV后14M!细胞产生的新霉蠢 抗性克隆 Tab0I0fmmmdIIto H幽eensmnre呻m岫AAVrecto- 囤2PAAV/Neo用限制性内切酶消化后电泳潜 啦2?Bdmph咀瞌蛐?PAAVjN~o 嚆蛐mtlmudtm* A=Pvu?:BXlm/PvulI CXlml:nLarmndaDNAHind? 426 2.3Southem印迹杂交分析用一印标 记新霉素抗性DNA探针杂交AAV/Neo一2 和AAV/Neo一5号克隆染色体基因组DNA. xba1酶切,电泳后做转移,结果如图3,显示 2.7kh处有强杂交信号. 同时在其E方有一弱杂交信号的二倍 国3用?酶切转导后}I出细胞染色体DNA 与一P标记新霉素抗性基因Southern印迹谱 F'tg3AIlt帕)gofxkId窖e;蚰i-e~sl- 珊坤帅加DNA删of1%ag嘲and lr.e~sfeefiononNCnmnbrane一一ATPIabded 咖TIreomreinDNA口Dbe 24NomadHelacellschromosome~nomic DNAI1AAV,'N~-23AANeo一5chxomosorne n0舢cDNA 第二军人学1994~O,:t):】5( 体带,兑明由PAAV/Neo介导的新霉素抗性 分f拷贝已整合到靶细胞染色体基因组 DNAE 3讨论 AAV是一含有rep,lip和强p三个结构 基因和末端为lT黜的微小病毒.其中rep 编码复制蛋白,lip和强p编码衣壳蛋白,感 染时AAV需要与腺病毒(Ad)或单纯疱疹 病毒(HSV)共转染,其中PAA,d为病毒 复制提供反式作用功能(Trans—acfion】,虽然 它不复制,但可提高的AAV的表达水 平f.AAv的】T黜对整台起很重要的作 用,并有顺式作用(Cis—action)功能.本研究 结果 说明 关于失联党员情况说明岗位说明总经理岗位说明书会计岗位说明书行政主管岗位说明书 尽管整台是低频率的(35%,43%); 但插入这一十字架结构的报告基因新霉素 抗性DNA分子在真核细胞中可稳定地整 合和成功地释放,即整台至少有功能的新霉 素抗性基因DNA的一个拷贝.目前,克隆 DNA片段在AAv质粒中广泛地依赖细菌 细胞.由于回文结构的特性是不稳定而常被 删除.重组和重排同时真核甲基化基因也 容易在原核中因高度敏感而被删除,从而会 影响到所希望的表达基因的释放效率我 们的实验结果不仅与Cavalier-Smith的理 沦吻合,有力地支持了他的单股线状DNA病 毒的复制模式,而且还证明以3.-OH作为引 物合成另一姊妹股DNA,再共价地结台到 亲代DNA分子一k.如将外源基因插入这 一 发夹结构中,它可稳定地整台到真核细胞 染色体DNA上:提示末端反向重复顺序及 其折叠产生回文结构对DNA在染色体上 的整合是很重要的.本研究的意义在于:证 明了Cavalier—Smith的单股DNA分子复 制学说,将细菌载体骨架成分从折叠结构中 去除,以减少一起整合带来的问 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 :同时,可 望为外源基因在真核细胞中的转导提供一 个新的系统 (感谢美国Pittsberg大学Sarnulski博士提供 第二军学1~4(Oct);15{ AAVeo,Ad;上海第=医科大学肖家邦老 师提供Ad2;复旦大学余龙博士提供杂交设 备:拳校寄生虫学教研室徐建枉博士提供暗 室及照像设备1 参考文献 1Sfiv~LstavaALL曲EW.BemsK1Nud?f1出sequence and唧埘10nof【heade~lo,a.dedms2 geao~J~mlI983.蛳2I:555 2Samtd~iR^(~aangLSShenkTHdD一freed(.ch of~mNnmatadeno一~soctated?nI9normal integat~ndoesn0【reqm~gene唧re?J ~'irol1989;693822 3.HermonatPLMuz~lzzkaNUofad~ao—assodatxd ?msasamamn~mnDNAdomng0ct0rlmnsduction ofneomy~nm'~staneeinlomammalimlnLlccul~u.e ?【IsProcNadAcad&iUSA.1984;8lf2m:6466 4~ughlinCA.Tratsd~nJD,CoonHetangof In10啉ad锄0一associat~?msgeaomesinbadeTi plasmi~(_衄aI9{i3:23(IJ 427 5~ughlin队Card~icNoCB,CoonHCLatent Ii0nofKBodIswfhitt~no—aod?ntyp JviroL1986:6215I5 &Y~obsonB.K~w-hT,Winceo~EReN~ationof aden0一aod甜?msinmd?DI1,tdkhout the'additionofahdp?nJvjmI,1987;61.972 7NahteimP'~rsenSHS6?ma删gand integrad~ofDNA~Nllentsmh~,an0丑ls tlmlemlinalrei~tsoftheadem)一asscdat~ 矾n2no腿Gene,1992I】2):265 8waCE,ljuJM,)(iaoXetRegulated le'~t~pressionofahuma玎目TT1rrIa—0ngeneintf0_ ducedintoen^d(Usbymadeno—assoaat~v 惯【?ProcNatlAcad&iUSA.1992;817257 KotinRM.MermingerJCWard—DcM叩11gand '1ir0d?qlali盈t10玎0rare,on一?f?Ea】DNA mkgrau0n日忙0nchro~l13一qG?0唧 I991:1831 (1994一删一29收稿,[994一一25修j 7个少数民族血清7种元素与血压关系的研究 【何邦乎,等,中国高血压杂志,1994:2(2):101] 采用原子吸收和火焰光谱分析法,捡测我国7个步数民族脑中风高危人群血清微量元素zn, cu.Fe和常量元素K,Na,Ca.Mg的含量并与血压的关系进行分析.结果发现高血压病高发区人群 血清Na,Mg,Zn,Fe,Na胚,Zn~"Cu明显高于低发区和对照组而K,Ca,Cu,Ca,,,Mg与血压呈显着负相 关,而zn,Fe,Na~'K与血压是显着正相关提示Fe,Na,Zn,Ca的含量变化与血压有密切的关系. 陈爱社荣获1994年度世界卫生组织热带病专项研究基金 我枝寄牛虫学博i:生陈爱杜荣获l994年度世界卫生组织热带病专项研究基金15000美元该 项基金主要授给发展中国家从事热带病研究的科技工作者目前陈爱社同志正在 我校摹础部寄生虫学 教研章管惟滨教授指导下从事疟疾疫苗的研究.(车刊编辑部)
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分类:生活休闲
上传时间:2017-11-13
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